基于Th細(xì)胞失衡探討酸棗仁湯對(duì)失眠小鼠認(rèn)知能力的影響

呂晴 劉香杰 李俊瑩 蔣國(guó)舉 谷雨霏 楊曉彤 戴馨樂 翟靖 王怡欣 劉東云 馮卓航 鄭璐璐 趙祎 杜盼盼 張?zhí)m寧 張玉嬌 李曉冰

(河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450008)

失眠又稱入睡和維持睡眠障礙，是指無法入睡或無法保持睡眠狀態(tài)，導(dǎo)致睡眠不足，表現(xiàn)為各種原因引起入睡困難、睡眠深度或頻度過短、早醒及睡眠時(shí)間不足或睡眠質(zhì)量差等，是一種常見病。隨著失眠程度的加重，失眠患者注意力、記憶力、學(xué)習(xí)能力等認(rèn)知功能下降〔1〕。目前常用于治療失眠的藥物有地西泮、阿普唑侖、三唑侖、佐匹克隆、水合氯醛等，這些西藥都有一定的不良反應(yīng)，包括頭暈、嗜睡、乏力等“宿醉”現(xiàn)象，且部分藥物會(huì)導(dǎo)致口苦、口干、惡心、嘔吐、肌無力等癥狀。另外，長(zhǎng)期用藥易產(chǎn)生耐受性、成癮性和戒斷癥狀。相較于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，中醫(yī)學(xué)對(duì)本病的治療有著獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。酸棗仁湯為治療失眠的經(jīng)典名方，副作用小，對(duì)失眠療效確切〔2〕。既往對(duì)酸棗仁湯治療失眠研究多從神經(jīng)遞質(zhì)角度論證。炎癥狀態(tài)在失眠發(fā)生中起重要作用，但是目前相關(guān)研究較少。本研究探討酸棗仁湯對(duì)失眠模型小鼠白細(xì)胞介素(IL)-1、IL-2、IL-4、IL-10水平的影響。

1 材料與儀器

1.1動(dòng)物 SPF級(jí)昆明小鼠40只，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，由鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供〔產(chǎn)品許可證：SCXK(豫)2019-0002〕。

1.2實(shí)驗(yàn)藥品及制備 酸棗仁湯：炒酸棗仁，甘草，川芎，知母、茯苓中藥飲片，購(gòu)于河南張仲景大藥房；對(duì)氯苯丙氨酸(PCPA)：美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：1002094970；小鼠IL-1、IL-2、IL-4、IL-10測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器 全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-tek公司)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(廣州市康恒儀器有限公司)，高速離心機(jī)(貝克曼庫爾特公司)，電熱恒溫水浴鍋(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1分組與給藥 昆明種小鼠40只，隨機(jī)分為5組，分別為正常組、模型組、地西泮組、酸棗仁湯低(SZR-L)、高劑量(SZR-H)組，每組8只。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，實(shí)驗(yàn)第4天地西泮組(0.92 mg/kg)及中藥高(4.8 g/kg)、低劑量(2.4 g/kg)組分別灌胃治療，1次/d，正常組及模型組給予相同劑量生理鹽水灌胃，給藥10 d。

1.4.2模型制備 除正常組外，其余各組小鼠每日腹腔注射PCPA混懸液300 mg/kg，連續(xù)3 d。觀察小鼠的行為學(xué)變化，選取晝夜節(jié)律消失，對(duì)外界的聲、光等刺激敏感，攻擊性增加，警惕性高，整體觀察與正常組有明顯不同的小鼠作為失眠鼠納入實(shí)驗(yàn)。

1.5觀察指標(biāo)

1.5.1曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 曠場(chǎng)箱(50 cm×50 cm×40 cm，周壁顏色為黑色，底面平均分為25個(gè)10 cm×10 cm小方格)正上方架攝像頭，視野覆蓋整個(gè)曠場(chǎng)。將小鼠放置在正中央格(實(shí)驗(yàn)前，小鼠適應(yīng)1 min)，同時(shí)進(jìn)行攝像和計(jì)時(shí)，時(shí)間為3 min。觀察并記錄小鼠總運(yùn)動(dòng)距離、總站立次數(shù)、中心區(qū)域運(yùn)動(dòng)時(shí)間。

1.5.2Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) Morris水迷宮水池直徑120 cm，高度為50 cm；平臺(tái)直徑6 cm，高度為30 cm，表面粗糙。水池劃分為東西南北4個(gè)象限(東北NE，東南SE，西南SW，西北NW)，象限池壁圓弧中點(diǎn)為可選的動(dòng)物入水點(diǎn)，平臺(tái)可放在任意一個(gè)象限內(nèi)。進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練，實(shí)驗(yàn)前將小鼠置于站臺(tái)上，適應(yīng)10 s，隨后將小鼠NE、NW象限分別面壁置入池內(nèi)，小鼠登上站臺(tái)5 s后終止記錄，若小鼠在60 s內(nèi)不能上臺(tái)，引導(dǎo)其登上站臺(tái)適應(yīng)10 s，最后將小鼠擦干，放入鼠籠，如此將小鼠置入游泳池，每天2次，每次間隔1 h，定位航行訓(xùn)練需要3 d，定位航行訓(xùn)練后進(jìn)行空間探查實(shí)驗(yàn)，記錄小鼠平臺(tái)探索總時(shí)間、平臺(tái)探索總距離、目標(biāo)象限探索時(shí)間、穿越平臺(tái)次數(shù)(60 s)，以評(píng)判小鼠的空間記憶能力。

1.5.3酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清IL-1、IL-2、IL-4、IL-10水平 采用ELISA檢測(cè)血清中IL-1、IL-2、IL-4、IL-10水平，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1酸棗仁湯對(duì)失眠小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)影響 與正常組相比，模型組總運(yùn)動(dòng)距離、總站立次數(shù)明顯增加，中心區(qū)域運(yùn)動(dòng)時(shí)間明顯減少(P<0.01)；與模型組相比，SZR-L、SZR-H、地西泮組總運(yùn)動(dòng)距離、總站立次數(shù)降低(P<0.05，P<0.01)；中心區(qū)域運(yùn)動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)(P<0.01,P<0.05)。見表1。

2.2酸棗仁湯對(duì)失眠小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)影響 與正常組相比，模型組平臺(tái)探索總時(shí)間、總距離明顯增加(P<0.01)；目標(biāo)象限(四象限)探索時(shí)間百分比，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，SZR-L、SZR-H組平臺(tái)探索總時(shí)間顯著降低(P<0.05)；目標(biāo)象限探索時(shí)間百分比及穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增加(P<0.01，P<0.05)。地西泮組平臺(tái)探索總時(shí)間、平臺(tái)探索總距離顯著低于模型組(P<0.01)，穿越平臺(tái)次數(shù)顯著增多(P<0.01)。見表2。

2.3酸棗仁湯對(duì)失眠小鼠血清炎性因子影響 與正常組相比，模型組血清IL-1、IL-2水平明顯升高，IL-4、IL-10水平明顯降低(P<0.05，P<0.01)；與模型組相比，SZR-L、SZR-H、地西泮組IL-1、IL-2水平降低，IL-4及IL-10水平升高，除SZR-L組IL-4和地西泮IL-10外，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。見表2。

表1 酸棗仁湯對(duì)失眠模型小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)影響

表2 酸棗仁湯對(duì)失眠模型小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)及血清炎性因子影響

3 討 論

目前常用的小鼠失眠造模方法有：強(qiáng)迫運(yùn)動(dòng)法造模、人為物理因素刺激法造模、腹腔注射PCPA造模等。PCPA造模法是現(xiàn)階段公認(rèn)的失眠模型。PCPA通過選擇作用有效抑制色氨酸羥化酶活性，導(dǎo)致5-羥色胺(HT)的合成減少，睡眠晝夜節(jié)律消失，幾乎達(dá)到完全失眠，且不會(huì)對(duì)神經(jīng)元造成實(shí)質(zhì)性損害，待注射劑量全部代謝后，可逐步恢復(fù)正?！?〕。故本實(shí)驗(yàn)選取腹腔注射PCPA法造模。

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)是常用的動(dòng)物行為學(xué)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)，可檢測(cè)小鼠自發(fā)活動(dòng)行為和探索行為，是評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在新異環(huán)境中自主行為、探究行為與緊張度實(shí)驗(yàn)方法。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)動(dòng)距離反映小鼠的活動(dòng)度和興奮性，站立次數(shù)、中心區(qū)域運(yùn)動(dòng)時(shí)間反映小鼠對(duì)陌生環(huán)境的好奇程度和探索趨勢(shì)〔4〕。Morris水迷宮是20世紀(jì)80年代由英國(guó)生理學(xué)家Morris設(shè)計(jì)并應(yīng)用于評(píng)估嚙齒類動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶功能的重要工具，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于認(rèn)知功能研究〔5〕。本研究結(jié)果提示酸棗仁湯可有效延緩失眠小鼠認(rèn)知功能障礙進(jìn)程，改善其學(xué)習(xí)能力及記憶能力。

研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期慢性炎癥與認(rèn)知功能減退關(guān)系密切〔6〕。另有研究表明，失眠患者Th1/Th2亞群平衡失衡〔7〕。既往研究表明，免疫系統(tǒng)與睡眠存在雙向聯(lián)系，而炎性因子是這種雙向作用中至關(guān)重要的介質(zhì)〔8〕。Th1細(xì)胞對(duì)初始CD4+T細(xì)胞具有一定刺激作用，產(chǎn)生大量腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-1、IL-2等炎性因子〔9〕。睡眠不足可激活小膠質(zhì)細(xì)胞使IL-1β(促炎因子)表達(dá)增加，直接引起炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡與免疫損傷〔10〕。IL-2具有加快炎癥細(xì)胞增殖的作用，可導(dǎo)致更多炎性介質(zhì)的釋放，破壞體內(nèi)細(xì)胞因子穩(wěn)態(tài)，干擾睡眠節(jié)律，從而導(dǎo)致失眠。睡眠質(zhì)量越差，促炎介質(zhì)分泌越多〔11〕。Th2細(xì)胞通過轉(zhuǎn)錄激活因子6及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，分泌IL-4、IL-6、IL-10等炎性因子〔9〕。IL-4具有抗炎效應(yīng)，可與具有促炎效應(yīng)的細(xì)胞因子發(fā)生拮抗作用。IL-10具有很強(qiáng)的抗炎及免疫抑制活性，能減少炎性介質(zhì)及其受體表達(dá)，抑制炎性細(xì)胞的增殖和遷移，對(duì)急慢性炎癥均有一定抑制作用〔12〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示酸棗仁湯可能通過調(diào)控Th1/Th2細(xì)胞平衡改善失眠小鼠認(rèn)知功能。