基于RhoA/ROCK信號通路研究上調(diào)miR-19b對MSCs成骨分化的影響

陳順玲 許和貴 朱旭 楊砥

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨傷科，貴州 貴陽 550002)

骨質(zhì)疏松是一種代謝性骨骼疾病，骨量減少、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞失衡、骨組織結(jié)構(gòu)破壞是該病的主要特征〔1〕，隨著年齡的增長，女性逐漸進(jìn)入絕經(jīng)期，其體內(nèi)性激素水平會急劇減少，鈣調(diào)節(jié)激素分泌紊亂，微量元素不足，最后導(dǎo)致骨質(zhì)疏松發(fā)生〔2〕。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)具有較強的自我更新能力和定向分化作用，可在體外培養(yǎng)，在一定的條件下可分化為成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞，同時還具有免疫調(diào)節(jié)作用〔3〕，MSCs也是導(dǎo)致成骨細(xì)胞分化失衡的主要原因，MSCs成骨分化過程中細(xì)胞骨架會發(fā)生一系列變化，而Ras同源基因家族成員(Rho)A/Rho相關(guān)卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)信號通路參與細(xì)胞骨架的調(diào)控過程〔4〕。本研究基于RhoA/ROCK信號通路研究上調(diào)miR-19b對MSCs成骨分化的影響。

1 資料與方法

1.1研究動物 選取清潔及健康雌性昆明大鼠36只，2～3月齡，平均(2.38±0.47)個月，體重250～300 g，平均(261.25±23.75)g，均為解放軍總醫(yī)院實驗動物研究中心提供，許可批號：SCXK(粵)2020-0055。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境為：溫度27℃，濕度60%，飲水和飲食自由。

1.2骨質(zhì)疏松大鼠模型建立 從清潔及健康的24只雌性大鼠中，隨機選取6只分為正常組，剩余18只建立骨質(zhì)疏松模型，參考文獻(xiàn)〔5〕建立骨質(zhì)疏松大鼠模型，先沿大鼠背部脊柱兩側(cè)剃毛，注射2% 40 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔麻醉，腹部正中間行縱向切口，尋找左邊和右邊末端的卵巢，行結(jié)扎切除手術(shù)，注射青霉素預(yù)防感染。

1.3MSCs培養(yǎng) 頸椎處死骨質(zhì)疏松模型大鼠和正常組大鼠，將其置于75%乙醇中浸泡10 min，無菌環(huán)境下暴露大鼠后肢，然后切開其皮膚，沿著膝關(guān)節(jié)處剪開，取出多余的組織和韌帶，再沿著大鼠髖關(guān)節(jié)和踝關(guān)節(jié)處剪切，隨后取出大鼠脛骨和股骨，將脛骨和股骨浸泡在磷酸鹽緩沖液(PBS)中，清洗3次，直至脛骨和股骨周圍的組織全部去除，然后吸取培養(yǎng)基中5 ml的溶液，離心15 min，制作單細(xì)胞懸液，與4%乙酸混合，顯微鏡下計數(shù)，將細(xì)胞接種在50 cm2的培養(yǎng)基中，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長形態(tài)。

1.4堿性磷酸酶、茜素紅染色 將5 mmol/L維生素C、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、100 nmol/L地塞米松、10%胎牛血清(FBS)用改良愛德華培養(yǎng)基(MEM)在無菌條件下稀釋至10 ml，混合4℃保存。細(xì)胞生長到融合狀態(tài)進(jìn)行消化傳代，將第三代細(xì)胞在6孔板中接種，當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底80%將培養(yǎng)液吸出，7 d后進(jìn)行堿性磷酸酶染色在室溫環(huán)境下進(jìn)行，需要避光染色15 min，14 d后進(jìn)行茜素紅染色，在37℃環(huán)境中孵育30 min。

1.5分組 將18只骨質(zhì)疏松模型大鼠分為模型組、空白組和上調(diào)組各6只，模型組和空白組給予等體積的生理鹽水進(jìn)行干預(yù)，空白組將5 μl的慢病毒注射到大鼠體內(nèi)，為無意義序列，上調(diào)組在大鼠體內(nèi)注射5 μl的miR-19b慢病毒，慢病毒引物序列為：上游：5′-ACTGAGCGATGAGCAGGC-3′，下游5′-CTTCGGGCCAGTAACGTTAGGG-3′，連續(xù)干預(yù)2 w。

1.6檢測miR-19b表達(dá)量 聚合酶鏈反應(yīng)檢測miR-19b表達(dá)量，取MSCs細(xì)胞以1×105個/ml的密度接種于6孔板，每孔2 ml，72 h后Trizol法提取總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄cDNA，用95℃無RNA酶水洗脫出miR-19b，PCR循環(huán)參數(shù)設(shè)定為95℃ 10 min，然后90℃ 15 min，60℃ 1 min，共40個循環(huán)，最后使用2-ΔΔCt法檢測miR-19b表達(dá)量。

1.7成骨細(xì)胞、信號通路相關(guān)蛋白檢測 采用Western印跡檢測特異性轉(zhuǎn)錄因子(OSX)、骨黏連蛋白(OSN)、骨橋蛋白(OPN)、RhoA、ROCK蛋白表達(dá)量，實驗步驟：將MSCs細(xì)胞接種于6孔板中，24 h貼壁后各組進(jìn)行處理，將采集到的樣本研磨加入蛋白緩沖液，提取各組細(xì)胞蛋白并使用二喹啉甲酸(BCA)法測定濃度，制備電泳樣品，上樣量50 μg進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，加入脫脂奶粉封閉1 h，一抗(1∶1 000)4℃ 孵育過夜，洗膜5 min/次，共3次，二抗(1∶4 000)室溫孵育1 h，洗膜5 min/次，共3次，加入發(fā)光液曝光3～4次，取重疊值。采用軟件分析蛋白條帶灰度值，內(nèi)參蛋白為GAPDH。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行齊性方差檢驗、獨立樣本t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1成骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 如圖1所示，在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，分離出來的原代成骨細(xì)胞貼壁生長，多為邊形或者梭形，僅有一小部分細(xì)胞的表面可見細(xì)小的突起，與鄰近的細(xì)胞相連接；培養(yǎng)出來的第三代細(xì)胞系生長較快，大多數(shù)細(xì)胞呈棱形或者錐形。

圖1 成骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察(×200)

2.2miR-19b在各組中的表達(dá)水平 如表1所示，與正常組相比，模型組、空白組、上調(diào)組miR-19b表達(dá)量明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，空白組、上調(diào)組miR-19b表達(dá)量明顯升高(P<0.05)；與空白組相比，上調(diào)組miR-19b表達(dá)量明顯升高(P<0.05)。

2.3miR-19b對成骨細(xì)胞相關(guān)蛋白的影響 如表1所示，與正常組相比，模型組、空白組、上調(diào)組OSX、OSN、OPN水平明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，空白組、上調(diào)組OSX、OSN、OPN水平明顯升高(P<0.05)；與空白組相比，上調(diào)組OSX、OSN、OPN水平明顯升高(P<0.05)。

2.4成骨細(xì)胞分化能力觀察 如圖2所示，成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)7 d后進(jìn)行堿性磷酸酶染色，14 d后進(jìn)行茜素紅染色結(jié)果顯示：成骨細(xì)胞礦化誘導(dǎo)后產(chǎn)生大量的礦化結(jié)節(jié)，堿性磷酸酶染色顯示成骨細(xì)胞分化能力增強。

表1 miR-19b在各組中的表達(dá)水平及其對成骨細(xì)胞相關(guān)蛋白和Rho/ROCK信號通路的影響

2.5miR-19b對成骨細(xì)胞RhoA/ROCK信號通路的影響 如表1、圖3所示，與正常組相比，模型組、空白組、上調(diào)組RhoA、ROCK水平明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，空白組、上調(diào)組RhoA、ROCK水平明顯降低(P<0.05)；與空白組相比，上調(diào)組RhoA、ROCK水平明顯降低(P<0.05)。

圖2 成骨細(xì)胞分化(×200)

圖3 Western印跡檢測各組RhoA、ROCK蛋白表達(dá)

3 討 論

骨質(zhì)疏松是由于骨代謝中的骨吸收和骨生成失衡所導(dǎo)致的一種疾病，可導(dǎo)致患者骨量減少、骨密度降低，進(jìn)而引起一系列的臨床癥狀，該病是一種增齡性病變，隨著我國人口老齡化的加速，骨質(zhì)疏松的發(fā)病率逐年上升〔6，7〕。有研究指出〔8〕，隨著骨質(zhì)疏松患者骨量的減少，骨微結(jié)構(gòu)的改變，會導(dǎo)致患者出現(xiàn)腰酸背痛、四肢疼痛、脊柱畸形、骨折的問題，其中骨折是導(dǎo)致患者發(fā)生全身性骨病的主要原因，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。成熟的成骨細(xì)胞存在于骨膜內(nèi)層和骨膜小梁表面，成骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的定向分化促進(jìn)成骨細(xì)胞的形成，正常的骨量可維持成骨細(xì)胞骨的形成和破骨細(xì)胞的骨吸收〔9〕，在成骨過程中，基質(zhì)分泌的膠原蛋白可為礦物質(zhì)沉積提供纖維框架，使類骨質(zhì)礦化成正常骨組織。MSCs是成骨細(xì)胞的原始細(xì)胞，在骨質(zhì)疏松癥患者骨代謝失衡過程中起骨修復(fù)作用，近年來發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增長，MSCs也會逐漸呈老化狀態(tài)，再加上骨代謝的嚴(yán)重失衡，會進(jìn)一步形成骨質(zhì)疏松〔10〕。MSCs化為成骨細(xì)胞是一個極為復(fù)雜的過程，該過程必須在多種信號通路的作用下才能進(jìn)行，且骨鈣素和堿性磷酸酶是MSCs成骨分化的重要表現(xiàn)〔11，12〕。研究指出〔13〕，MSCs具有一定的多向分化的能力，在相關(guān)條件的誘導(dǎo)下，其可定向分化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞。

miRNA轉(zhuǎn)錄后可通過抑制靶基因的表達(dá)控制疾病的進(jìn)一步發(fā)展，其差異表達(dá)可能在骨質(zhì)疏松中發(fā)揮重要作用〔14，15〕。已有研究證實〔16〕，miRNA與骨的胚胎發(fā)育，調(diào)節(jié)干細(xì)胞成骨作用和軟骨細(xì)胞代謝中具有重要作用。miR-19b是否直接參與了成骨的調(diào)控，目前尚不明確，但當(dāng)miR-19b表達(dá)量上升時可有效抑制膠原蛋白的合成，促進(jìn)骨質(zhì)礦化，有利于骨質(zhì)生成。本文研究中，上調(diào)miR-19b表達(dá)量可促進(jìn)MSCs成骨分化〔17，18〕。有研究指出〔19〕，miR-19b在骨質(zhì)疏松患者體內(nèi)其表達(dá)量顯著下降，且在骨質(zhì)疏松伴隨骨折患者的外周血中下降的尤為明顯，提示miR-19b與骨量丟失呈負(fù)相關(guān)，miR-19b表達(dá)量越高，成骨細(xì)胞分化能力越強，為臨床上治療骨質(zhì)疏松提供新的方向。OSX能反映成骨細(xì)胞分化程度，其只在骨組織細(xì)胞中表達(dá)，與骨質(zhì)疏松的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。研究指出〔20〕，OSN可與Ⅰ型膠原相結(jié)合形成非可溶性復(fù)合物，進(jìn)而促進(jìn)鈣、磷持續(xù)性沉淀，最后形成羥基磷灰石結(jié)晶，羥基磷灰石結(jié)晶上的陰離子末端可通過與骨黏連蛋白相結(jié)合，然后形成羥基磷灰石-OSN-Ⅰ型膠原復(fù)合物，這一過程可有效促進(jìn)骨的生成和骨的重建，促進(jìn)骨質(zhì)疏松患者身體的恢復(fù)。OPN是一種重要的細(xì)胞黏附因子和趨化因子，能促進(jìn)骨基質(zhì)的礦化，維持骨的完整性，參與骨重塑過程，具有細(xì)胞黏附蛋白和細(xì)胞因子的雙重作用，可參與成骨細(xì)胞表面各種酶的活化，在MSCs成骨分化中發(fā)揮重要作用。本研究提示，上調(diào)miR-19b可提高OSX、OSN、OPN蛋白水平，改善骨質(zhì)疏松大鼠MSCs成骨分化。

RhoA/ROCK信號通路在調(diào)控成骨細(xì)胞活性中起著重要作用，RhoA是Ras超家族成員之一，其可以通過下游的效應(yīng)因子促進(jìn)細(xì)胞肌動蛋白骨架的重建，ROCK是目前研究較為深入的一種Rho下游底物〔21〕，而Rho在成骨細(xì)胞分化，各種生理、病理過程中均發(fā)揮重要作用，其可將細(xì)胞外的基質(zhì)信號，傳遞到細(xì)胞骨架之中，繼而改變成骨細(xì)胞的形態(tài)。研究指出〔22〕，RhoA/ROCK信號通路在參與細(xì)胞骨架形成的過程中，可通過改變細(xì)胞之間不同的接觸面積來促進(jìn)成骨分化。本研究提示，上調(diào)miR-19b可通過調(diào)控RhoA/ROCK通路蛋白來改善骨質(zhì)疏松大鼠MSCs成骨分化。