降壓寶藍(lán)片對SHR腎損害及激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)的影響

周紅艷 張薇 楊丹 王曉麗 時(shí)麗菲 孫江偉 王軍

(1河南省中醫(yī)藥研究院中藥藥理實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450004； 2河南省省立醫(yī)院藥學(xué)部)

高血壓已成為心血管疾病中發(fā)病率較高的重大公共衛(wèi)生問題之一。2012～2015年我國18歲及以上居民高血壓患病粗率為27.9%(標(biāo)化率23.2%)，患病率總體呈增高的趨勢〔1〕。高血壓是腦卒中、心肌梗死、腎功能不全最危險(xiǎn)的因素，引發(fā)的靶器官損害嚴(yán)重危害人類健康〔2〕。腎臟參與血壓的調(diào)節(jié)，也是高血壓相關(guān)損害的重要靶器官。腎功能性障礙導(dǎo)致血壓升高，形成惡性循環(huán)，并加劇其他靶器官損害。早期干預(yù)高血壓進(jìn)行性腎損害進(jìn)程，阻斷高血壓-腎損害惡性循環(huán)，對控制血壓及延緩高血壓腎病的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。研究表明，高血壓腎損害與激肽釋放酶激肽系統(tǒng)(KKS)聯(lián)系密切，KKS是機(jī)體重要的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，廣泛地存在于組織和器官，在逆轉(zhuǎn)血管重構(gòu)、減輕血管損傷后再狹窄及減輕腎損害等方面發(fā)揮保護(hù)作用〔3,4〕。降壓寶藍(lán)片由大黃、龍膽草、蘿芙木、黃芩等中藥組成，具有清瀉肝火、清利濕熱功效，用于肝火亢盛型高血壓治療，臨床療效確切，具有降壓及心、腦、腎靶器官保護(hù)作用。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明：降壓寶藍(lán)片對自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)有一定的降壓作用，對SHR血管、心臟重構(gòu)有不同程度的改善作用〔5〕。本研究選用SHR為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，探討降壓寶藍(lán)片對SHR腎損害及KKS的影響，探討其可能的作用機(jī)制，為擴(kuò)大其臨床應(yīng)用范圍和進(jìn)一步的深入研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)藥物 降壓寶藍(lán)片由河南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院制劑室提供，批號20150902；馬來酸依那普利片，江蘇制藥股份有限公司，批號15061002。

1.2動(dòng)物 SPF級12周齡雄性SHR大鼠30只，12周齡雄性京都種(WKY)大鼠10只，體質(zhì)量(200±20)g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2015-0001，動(dòng)物合格證：NO.1150060133361。研究所涉及的動(dòng)物相關(guān)操作符合河南省中醫(yī)藥研究院動(dòng)物倫理委員會(huì)的規(guī)定。

1.3儀器及試劑 Synergy NEO型多功能酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司)，2K15型冷凍離心機(jī)(德國Sigma公司)，JXFSTPRP-cl全自動(dòng)樣品冷凍研磨儀(上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司)，Asp-303型自動(dòng)脫水機(jī)、EG-1250C型組織包埋機(jī)、RM-2135型石蠟切片機(jī)、DM4000型光學(xué)顯微鏡、QWin V3病理圖像分析系統(tǒng)(德國Leica公司)，DYCP-24DN型電泳儀、DYCP-40C型轉(zhuǎn)膜儀(北京市六一儀器廠)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號325E038)，馬松三色(Masson)染色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)有限公司，批號1508178004)，大鼠緩激肽原(BK)、低分子量激肽(LK)、組織激肽釋放酶(TK)、前列環(huán)素(PG)I2、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測試劑盒(江蘇卡爾文生物科技有限公司，批號E20160301A)，BK2型受體(B2R，上海圣克魯斯生物技術(shù)有限公司，批號sc-136216)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)鼠單克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗鼠，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司(批號60004-1-Ig、SA00001-1)。

1.4方法

1.4.1分組與給藥 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，隨機(jī)分為模型(SHR)組、依那普利組(0.02 g/kg)、降壓寶藍(lán)片組(0.6 g/kg)，在前期的主要藥效學(xué)研究中，共進(jìn)行了3個(gè)劑量(1.2 g/kg、0.6 g/kg、0.3 g/kg)降壓和降脂實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)選擇其中一個(gè)有效劑量(0.6 g/kg)進(jìn)行靶器官保護(hù)作用機(jī)制研究。每組10只，以同齡同種系正常血壓的WKY大鼠10只作為正常對照(WKY)組。灌胃給藥，給藥體積10 ml/(kg·d)，連續(xù)12 w。WKY組和SHR組給予等體積0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液。

1.4.2病理形態(tài)觀察 取腎冠狀切片，10%甲醛固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋，橫斷面切片，分別進(jìn)行HE染色、Masson染色，觀察測量腎小球硬化指數(shù)(GSI)及腎組織間質(zhì)膠原蛋白容積分?jǐn)?shù)(CVF)。①GSI：腎小球硬化的定義為毛細(xì)血管腔塌陷和(或)玻璃樣變。采用Raij等〔6〕半定量方法評估腎小球硬化程度，每張切片觀察40個(gè)腎小球，根據(jù)腎小球硬化灶所占腎小球比例分為4級(0級：腎小球無病變；1級：腎小球受損<25%；2級：25%～50%腎小球受損；3級：51%～75%腎小球受損；4級：76%～100%腎小球受損)，根據(jù)不同級別腎小球硬化的例數(shù)，計(jì)算GSI。GSI=〔(1×N/40)+(2×N/40)+(3×N /40)+(4×N/40)〕×100?！癗”表示不同級別的例數(shù)。②腎組織CVF：每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野(×400)，分別測量膠原蛋白面積和視野總面積，取平均值計(jì)算CVF。CVF=膠原蛋白面積/視野總面積×100。

1.4.3腎組織BK、TK、LK和PGI2含量測定 末次灌胃給藥后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(0.3 g/kg)，腎組織勻漿，3 000 r/min離心15 min，取上清液。按ELISA試劑盒說明書操作，用酶標(biāo)儀于450 nm波長處分別測定BK、TK、LK和PGI2樣品吸光度(A)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程計(jì)算各樣品含量。

1.4.4腎組織B2R蛋白表達(dá)測定 制備分離膠，分離膠凝固后制備濃縮膠并插入梳子，待濃縮膠凝固后拔出梳子加入蛋白質(zhì)樣品，接通電源開始電泳，電泳結(jié)束后按照纖維墊-濾紙-聚偏氟乙烯(PVDF)膜-分離膠-濾紙-纖維墊順序制作三明治，4℃，100 V轉(zhuǎn)膜120 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將PVDF膜放入封閉液中，37℃封閉1 h。4℃一抗過夜，TBST洗膜6 min×3次，孵二抗1 h，TBST洗膜6 min×3次，曝光并用Image Studio對條帶進(jìn)行分析。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組腎組織病理形態(tài)學(xué) WKY組腎小球、腎小管無明顯病理改變，可見少量膠原蛋白染色。SHR組可見腎小球體積縮小、塌陷及局灶性硬化，腎小管渾濁腫脹，基底膜增厚，偶見蛋白或紅細(xì)胞管型，腎間質(zhì)充血，可見炎性細(xì)胞浸潤及間質(zhì)纖維化，腎小球內(nèi)及間質(zhì)可見大量深染的膠原蛋白沉積。與SHR組比較，降壓寶藍(lán)片和依那普利組腎組織病理性改變及膠原蛋白沉積明顯減輕，GSI、CVF明顯降低(P<0.01)。見表1，圖1、2。

2.2各組腎組織KKS比較 與WKY組比較，SHR組腎組織BK、PGI2含量顯著降低(P<0.05)，TK含量有降低的趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與SHR組比較，降壓寶藍(lán)片組及依那普利組顯著升高腎組織PGI2含量(P<0.05，P<0.01)，降壓寶藍(lán)片組BK、TK、LK含量亦有升高的趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，依那普利組顯著升高BK、TK(P<0.01)。見表1。

2.3降壓寶藍(lán)片對SHR腎組織B2R蛋白表達(dá)的影響 與WKY組比較，SHR組腎組織B2R蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)。與SHR組比較，依那普利及降壓寶藍(lán)片均能顯著上調(diào)B2R蛋白表達(dá)(P<0.05)。見表1，圖3。

表1 各組腎組織GSI和CVF、KKS及B2R蛋白表達(dá)比較

圖1 各組腎組織形態(tài)學(xué)改變(HE染色，×200)

圖2 各組腎組織膠原蛋白改變(Masson染色，×200)

1～4：WKY組、SHR組、依那普利組、降壓寶藍(lán)片組圖3 各組腎組織B2R蛋白表達(dá)

3 討 論

高血壓是慢性腎臟病發(fā)生發(fā)展的主要危險(xiǎn)因素之一，臨床上將高血壓造成的腎臟結(jié)構(gòu)和功能的改變，稱為高血壓腎損害，亦稱高血壓性腎病。本研究結(jié)果顯示，SHR腎臟組織發(fā)生形態(tài)及結(jié)構(gòu)上的病理變化：腎小球體積縮小、塌陷及局灶性硬化，內(nèi)部間質(zhì)有大量深染的膠原蛋白沉積，腎小管渾濁腫脹，基底膜增厚，腎間質(zhì)充血，可見炎性細(xì)胞浸潤及間質(zhì)纖維化，腎組織GSI、CVF顯著高于WKY組，符合高血壓腎損害病理特征，與文獻(xiàn)報(bào)道一致〔7,8〕。

腎臟局部KKS是腎-體液控制系統(tǒng)重要組成部分，KKS參與高血壓-腎損害病理生理過程，當(dāng)其受抑制則可導(dǎo)致鈉潴留及高血壓的發(fā)生〔9〕。KKS是一種內(nèi)源性代謝級聯(lián)系統(tǒng)，主要由激肽前體-激肽原、激肽釋放酶、激肽及激肽受體組成〔10〕。激肽原是活性激肽的前體，其中LK為一種β-球蛋白，分子量50～68 kD，主要存在于血漿和各種組織中。LK在TK催化下，釋放胰激肽(KD)和BK，TK是一種絲氨酸蛋白酶，它可以將低分子量的激肽原加工為具有生物活性的激肽和緩激肽，激肽具有血管活性，它可以觸發(fā)KKS的瀑布級聯(lián)反應(yīng)〔11〕。BK是生理?xiàng)l件下主要的激肽類物質(zhì)，是KKS發(fā)揮作用的主要成分，它是一種血管舒張因子。BK作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞膜B2R，使內(nèi)皮細(xì)胞釋放一氧化氮(NO)和PGI2等活性物質(zhì)，通過擴(kuò)張小動(dòng)脈、增加局部血流和血管通透性、抑制膠原蛋白、炎癥細(xì)胞及成纖維細(xì)胞聚集進(jìn)而減輕血管重構(gòu)及腎臟纖維化〔12〕。另一方面，BK還能促進(jìn)水鈉排泄，具有強(qiáng)大的利尿鈉效應(yīng)。靜脈或動(dòng)脈注射BK，能迅速地?cái)U(kuò)張全身血管，降低外周血管阻力，抑制鈉水重吸收，增加腎小球?yàn)V過率，產(chǎn)生降壓效應(yīng)〔13,14〕。另有研究表明，中藥能夠升高血清BK、TK的表達(dá)量，激活激肽釋放酶發(fā)揮降低血壓，改善血管重構(gòu)，發(fā)揮靶器官保護(hù)作用〔15〕。本研究結(jié)果顯示，降壓寶藍(lán)片對SHR腎組織BK、TK、LK含量有升高的趨勢，能明顯升高腎組織中PGI2含量，顯著上調(diào)B2R蛋白表達(dá)，說明降壓寶藍(lán)片能發(fā)揮舒張血管效應(yīng)，通過擴(kuò)張小動(dòng)脈，增加血管通透性和組織血流量，抑制膠原蛋白、平滑肌細(xì)胞增殖進(jìn)而減輕血管重構(gòu)及腎臟纖維化。

高血壓治療的根本目標(biāo)是降低高血壓的心、腦、腎與血管并發(fā)癥發(fā)生和死亡的總危險(xiǎn)〔1〕。中醫(yī)藥具有這方面的優(yōu)勢，降壓寶藍(lán)片是河南省中醫(yī)藥研究院高血壓中心系列醫(yī)院制劑之一，用于肝火亢盛型高血壓治療。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，降壓寶藍(lán)片有減輕SHR左室肥厚及左室重構(gòu)的作用〔5〕；臨床研究發(fā)現(xiàn)，降壓寶藍(lán)片可降低高血壓患者血漿同型半胱氨酸水平、左心室體積指數(shù)及頸動(dòng)脈內(nèi)膜中膜復(fù)合體厚度等指標(biāo)，對左心室肥大和血管損傷有一定改善作用，可預(yù)防心血管事件及并發(fā)癥的發(fā)生〔16,17〕。

綜上，降壓寶藍(lán)片對SHR有腎保護(hù)作用，部分機(jī)制可能與上調(diào)KKS活性有關(guān)。