臭氧水療法對(duì)KOA大鼠關(guān)節(jié)軟骨及Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響

丁小芬 周友龍 田明月 韓松辰 賈夢雅 李彥華 楊志孟 王晶

(河南中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450008)

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(KOA)是一種關(guān)節(jié)退行性疾病，臨床常見于中老年人，其主要病理特征為進(jìn)行性關(guān)節(jié)軟骨退化，膝關(guān)節(jié)退變由衰老、肥胖、外傷、關(guān)節(jié)不穩(wěn)、過度使用或其他異常負(fù)荷引起〔1〕，臨床癥狀常包括關(guān)節(jié)腫脹、疼痛、活動(dòng)受限、關(guān)節(jié)畸形等。KOA是引發(fā)全球患病老年人口慢性疼痛和導(dǎo)致殘疾的主要原因〔2～4〕，在60歲以上人群中影響多達(dá)1/3以上〔5〕。西醫(yī)治療該病易出現(xiàn)不良反應(yīng)，中醫(yī)治療起效較慢，周友龍等〔6～8〕采用中西醫(yī)結(jié)合療法，運(yùn)用臭氧水關(guān)節(jié)腔聯(lián)合穴位注射治療KOA，可有效緩解疼痛、改善關(guān)節(jié)活動(dòng)度、創(chuàng)傷小、無明顯毒副作用、療程短、療效確切。

KOA的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，近年來，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)調(diào)控關(guān)節(jié)形成和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的眾多信號(hào)通路是導(dǎo)致KOA發(fā)病的關(guān)鍵因素，其中經(jīng)典通路Wnt/β-catenin信號(hào)通路被認(rèn)為是重要的通路之一〔9,10〕，炎癥環(huán)境下該通路被激活，下游靶基因基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)過度表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過度降解，關(guān)節(jié)軟骨破壞〔11,12〕。本實(shí)驗(yàn)通過關(guān)節(jié)腔注射木瓜蛋白酶建立KOA大鼠模型，基于Wnt/β-catenin信號(hào)通路探討臭氧水關(guān)節(jié)腔聯(lián)合穴位注射治療KOA的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:3月齡SPF級(jí)雄性SD大鼠48只，體重(300±20)g，由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCKX(魯)20190003，在河南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心常規(guī)飼養(yǎng)，1 w后用于模型制備。主要試劑:木瓜蛋白酶、左旋半胱氨酸(批號(hào)：SLCD866、STBJ3975)購于美國Sigma-Aldrich公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(批號(hào)：20200817)購于北京索萊寶科技有限公司；β-catenin、Wnt3a、MMP-13抗體(批號(hào)：A19657、 A13601、A11148、A2562)購于美國ABclona公司；GAPDH抗體(批號(hào)：60004-1-lg)購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；總RNA提取試劑盒(批號(hào)：20200522)購于北京索萊寶科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)：00753607)購于美國Thermo Fisher公司；2X通用型SYBR Green快速定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)預(yù)混液(批號(hào)：9619031126)購于美國ABclona公司。主要儀器:醫(yī)用臭氧水制備儀(型號(hào)：SYZ-80A)購自濟(jì)南三氧科技有限公司；病理切片機(jī)(型號(hào)：RM2016)上海徠卡儀器有限公司；全波長酶標(biāo)儀、離心機(jī)、核酸蛋白濃度微量測定儀(型號(hào)：Multiskan GO、ST16R、Nanodrop 2000)購于美國Thermo Fisher公司；熒光定量PCR儀(型號(hào)：TL-988)西安天隆科技有限公司。

1.2分組與造模 將48只大鼠隨機(jī)分為空白組(12只)和造模組(36只)，造模組分別在實(shí)驗(yàn)的第1、4、7天行關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射4%木瓜蛋白酶溶液〔13〕：稱量大鼠體重，常規(guī)碘伏消毒，術(shù)者戴無菌手套，用2 ml的注射器按大鼠體重按照劑量(5 ml/kg)的劑量抽取10%水合氯醛溶液，以45°斜刺進(jìn)行腹腔注射麻醉，剪去大鼠右后膝關(guān)節(jié)周邊1 cm區(qū)域的皮毛，屈曲大鼠右后膝關(guān)節(jié)45°，使用微量注射器按大鼠體重按照劑量(0.1 ml/kg)抽取木瓜蛋白酶溶液劑量，以髕骨下及髕腱外緣為進(jìn)針點(diǎn)，向髁間窩方向進(jìn)針，抵達(dá)股骨髁后回撤2 mm，將木瓜蛋白酶溶液推入即可。造模結(jié)束后空白組取1只、造模組取3只大鼠，分別處死取關(guān)節(jié)軟骨組織進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色，驗(yàn)證造模成功。再將造模組隨機(jī)分為模型組、生理鹽水組、臭氧水組，每組11只。

1.3實(shí)驗(yàn)干預(yù) 于最后1次注射木瓜蛋白酶3 w后開始干預(yù)，空白組、模型組采取同樣抓取，不予治療；臭氧水組向大鼠右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射20 μg/ml的臭氧水0.2 ml，“梁丘”“血海”“陰陵泉”“陽陵泉”“三陰交”行穴位注射，每穴20 μl，1次/w，共治療3 w；生理鹽水組操作同臭氧水組，僅是把藥物由20 μg/ml臭氧水換成0.9%生理鹽水。

1.4樣本取材及檢測分析

1.4.1取材 采用頸椎脫臼法分別處死各組大鼠，將大鼠右膝關(guān)節(jié)處皮膚切開暴露皮下膝關(guān)節(jié)，被動(dòng)彎曲膝關(guān)節(jié)，用手術(shù)刀切開髕下韌帶，然后用鑷子夾住髕下組織連同髕骨一起用力向上牽拉，再依次剪去關(guān)節(jié)周圍其他組織和韌帶，以充分暴露關(guān)節(jié)軟骨。用刀片盡量切下股骨遠(yuǎn)端、脛骨近端的關(guān)節(jié)軟骨。每組隨機(jī)選取3只大鼠的右側(cè)膝關(guān)節(jié)標(biāo)本置于裝有4%多聚甲醛的離心管中固定，進(jìn)行病理切片的制作和觀察；各組剩余8只大鼠的右側(cè)膝關(guān)節(jié)標(biāo)本，放入標(biāo)好號(hào)碼的凍存管用液氮保存，轉(zhuǎn)運(yùn)至-80℃冰箱，用于Western印跡和實(shí)時(shí)熒光定量(RT)-PCR檢測。

1.4.2HE染色 取軟骨組織脫鈣、脫水、透明、浸蠟、包埋后制備軟骨組織切片，參考HE染色試劑盒對(duì)切片進(jìn)行染色，光鏡下觀察，并參照改良Mankin評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各組關(guān)節(jié)軟骨評(píng)分。

1.4.3Western印跡檢測軟骨組織內(nèi)Wnt3a、β-catenin、MMP-13蛋白表達(dá)情況 取各組凍存的軟骨組織，加入裂解液置于高速組織研磨儀上進(jìn)來組織研磨，測定蛋白濃度后，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝胺電泳(SDS-PAGE)分離后轉(zhuǎn)膜、封閉，采取Wnt3a、β-catenin、MMP-13、GAPDH一抗孵育聚偏氟乙烯(PVDF)膜，4℃過夜后，用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗與膜接觸，室溫振搖反應(yīng)1 h，在暗室中，將膜浸入發(fā)光液顯影，以GAPDH為內(nèi)參，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析Wnt3a、β-catenin、MMP-13各蛋白條帶的灰度值。

1.4.4RT-PCR檢測軟骨組織內(nèi)Wnt3a、β-catenin、MMP-13 mRNA表達(dá)情況 將凍存的關(guān)節(jié)軟骨解凍后將軟骨削成碎屑狀，按Trizol試劑盒說明提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用RT-PCR法檢測Wnt3a、β-catenin、MMP-13 mRNA表達(dá)水平，選用GAPDH作為內(nèi)參，反應(yīng)程序?yàn)槭紫阮A(yù)變性95℃作用3 min；變性95℃作用15 s，退火60℃作用1 min，延伸72℃作用1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；引物由江蘇金唯智生物科技有限公司合成。GAPDH上游引物：5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，下游：5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′；Wnt3a上游引物：5′-CAGGGCACTAACAAGTCGGG-3′，下游：5′-CCACACTGGGCATGATCTCC-3′；β-catenin上游引物：5′-ACTCCAGGAATGAAGGCGTG-3′，下游：5′-GAACTGGTCAGCTCAACCGA-3′；MMP-13上游引物：5′-ACCCAGCCCTATCCCTTGAT-3′，下游：5′-TCTCGGGATGGATGCTCGTA-3′。利用2-ΔΔCt法分別計(jì)算出Wnt3a、β-catenin、MMP-13mRNA的表達(dá)量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1HE染色結(jié)果 空白組關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，無缺損，四層結(jié)構(gòu)(淺表層、過渡層、輻射層和鈣化層)排列規(guī)則可見，無血管侵入，潮線完整，軟骨細(xì)胞數(shù)量正常，軟骨基質(zhì)著色均勻；模型組關(guān)節(jié)軟骨破壞嚴(yán)重、不完整，表面粗糙不光滑，有裂隙形成，四層結(jié)構(gòu)紊亂，有血管侵入，潮線不完整，過渡層細(xì)胞緊密排列現(xiàn)象消失，軟骨細(xì)胞變性數(shù)量減少、排列混亂、分布不均勻、呈簇狀分布，可見軟骨細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，軟骨基質(zhì)著色不均勻；生理鹽水組關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙，有少量裂隙形成，四層結(jié)構(gòu)層次不清，潮線結(jié)構(gòu)少量破壞，軟骨細(xì)胞數(shù)量減少、排列不整齊，可見部分軟骨細(xì)胞部分凋亡現(xiàn)象，軟骨基質(zhì)著色較均勻；臭氧水組：關(guān)節(jié)軟骨表面較光滑，未見明顯裂隙產(chǎn)生，四層結(jié)構(gòu)層次清楚，潮線結(jié)構(gòu)絕大部分完整、個(gè)別不完整，軟骨細(xì)胞數(shù)量基本正常、排列整齊、分布較均勻，軟骨基質(zhì)著色均勻。見圖1。

圖1 各組軟骨組織病理形態(tài)(HE染色，×200)

2.2光鏡下對(duì)各組軟骨組織病理切片行改良Mankin評(píng)分 與空白組〔(0.00±0.00)分〕相比，模型組〔(7.67±1.53)分〕、生理鹽水組〔(5.00±1.00)分〕及臭氧水組改良Mankin評(píng)分〔(2.33±0.58)分〕均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，生理鹽水組和臭氧水組評(píng)分降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與生理鹽水組相比，臭氧水組評(píng)分降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3Western印跡檢測軟骨組織內(nèi)Wnt3a、β-catenin、MMP-13蛋白及mRNA表達(dá)水平 與空白組相比，模型組、生理鹽水組、臭氧水組軟骨組織內(nèi)Wnt3a、β-catenin、MMP-13蛋白及mRNA表達(dá)水平均增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，生理鹽水組、臭氧水組軟骨組織內(nèi)Wnt3a、β-catenin、MMP-13蛋白及mRNA表達(dá)水平均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與生理鹽水組相比，臭氧水組軟骨組織內(nèi)Wnt3a、β-catenin、MMP-13蛋白及mRNA表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2、表1。

圖2 各組目的蛋白印跡

表1 各組軟骨組織內(nèi)Wnt3a、β-catenin、MMP-13蛋白及mRNA表達(dá)

3 討 論

KOA屬于中醫(yī)“痹癥”范疇，在古代醫(yī)案中有“骨痹”“鶴膝風(fēng)”“歷節(jié)”等類似該病的記載，主要病機(jī)特點(diǎn)為人體正氣不足，肝腎虧虛為主要因素，風(fēng)寒濕邪侵襲為誘發(fā)因素〔14〕。西醫(yī)認(rèn)為KOA與金屬蛋白酶、細(xì)胞因子、激素水平、免疫因素、信號(hào)通路等多種機(jī)制綜合作用有關(guān)〔15〕，其中，軟骨細(xì)胞凋亡和軟骨基質(zhì)合成與降解之間的失衡是軟骨變性和損傷的重要原因〔16〕，KOA發(fā)生時(shí)炎癥因子表達(dá)上調(diào)，通過一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)將信號(hào)向下游傳遞，引發(fā)軟骨退變。其中，已經(jīng)證明Wnt信號(hào)通路是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展的關(guān)鍵〔17〕，Wnt/β-catenin信號(hào)通路是軟骨發(fā)育和骨重塑的重要機(jī)制，通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)下游MMPs表達(dá)，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)改變和軟骨破壞，是調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的重要信號(hào)通路之一〔18〕。Wnt3a配體可與跨膜蛋白分泌型FZ相關(guān)蛋白(sFRP)上富含半胱氨酸的區(qū)域結(jié)合，激活經(jīng)典Wnt信號(hào)通路〔19〕，β-catenin是Wnt/β-catenin信號(hào)通路上的核心蛋白，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起主導(dǎo)作用，β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累后可進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)參與轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)下游靶向介導(dǎo)的MMPs等的表達(dá)，尤其是MMP-13對(duì)Ⅱ型膠原的降解性較強(qiáng)，是促進(jìn)軟骨基質(zhì)降解的關(guān)鍵酶，在軟骨破壞中起核心作用〔20〕。

本研究采用關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射木瓜蛋白酶復(fù)制KOA大鼠模型，木瓜蛋白酶是一種蛋白水解酶，通過將硫酸軟骨素從關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的蛋白多糖復(fù)合物中釋放出來，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨穩(wěn)態(tài)無法維持，正常的應(yīng)力也會(huì)造成軟骨損傷而引起KOA，但對(duì)軟骨細(xì)胞和膠原蛋白沒有直接影響，不會(huì)干擾軟骨組織的修復(fù)機(jī)制和修復(fù)能力〔21〕。本研究中生理鹽水組有治療作用是由于生理鹽水組向大鼠“陰陵泉”“陽陵泉”“梁丘”“血?！薄白闳铩薄叭幗弧毖ㄎ粌?nèi)注射生理鹽水，對(duì)穴位產(chǎn)生了刺激，發(fā)揮了穴位的治療作用。袁佳夢〔22〕研究發(fā)現(xiàn)毫針刺KOA模型兔“犢鼻”“內(nèi)膝眼”“梁丘”“血?！焙突疳槾獭盃俦恰薄皟?nèi)膝眼”治療比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，發(fā)現(xiàn)通過對(duì)穴位的刺激可能抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)β-catenin的表達(dá)被抑制，阻止了Wnt信號(hào)的傳遞，從而減少了下游MMP-3和MMP-13的表達(dá)，緩解關(guān)節(jié)軟骨的退變。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)臭氧水關(guān)節(jié)腔聯(lián)合穴位注射干預(yù)后，對(duì)關(guān)節(jié)軟骨保護(hù)作用明顯，臭氧水作為一種強(qiáng)氧化劑，可誘導(dǎo)超氧化物歧化酶(SOD)過度表達(dá)，從而清除病理過程中產(chǎn)生的過多活性氧(ROS)，還能刺激抗炎因子的產(chǎn)生，改善關(guān)節(jié)內(nèi)的炎癥環(huán)境〔23〕，可能是通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致該通路的配體Wnt3a不能與跨膜蛋白有效結(jié)合，β-catenin不能在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)聚集進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，從而抑制下游靶基因MMP-13表達(dá)，抑制關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而延緩關(guān)節(jié)軟骨的破壞。

綜上，Wnt/β-catenin信號(hào)通路在KOA大鼠關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)被激活，阻止該信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)可以改善關(guān)節(jié)軟骨的破壞。臭氧水關(guān)節(jié)腔聯(lián)合穴位注射療法可以改善KOA大鼠關(guān)節(jié)軟骨病理評(píng)分，有效延緩關(guān)節(jié)軟骨的退變，其作用機(jī)制可能是抑制正調(diào)節(jié)因子Wnt3a和β-catenin的表達(dá)，從而降低了下游靶基因MMP-13的表達(dá)，抑制了Wnt/β-catenin信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，減少軟骨細(xì)胞凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)降解，延緩關(guān)節(jié)軟骨退變，這可能是臭氧水療法治療KOA的作用機(jī)制之一。