加味柴胡疏肝散通過調(diào)控AKT/GSK-3β/Nrf2信號(hào)通路抑制小鼠酒精性肝損傷

張兆鵬 閆俏 馬欣宇 呼雅麗 郭軍鵬 劉洋

(1長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117；2長春醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校)

酒精性肝病(ALD)是一種長期酗酒引起的慢性肝損傷疾病。流行病調(diào)查發(fā)現(xiàn)，雖然適量飲酒有利于身心健康，如預(yù)防心臟病、高血壓和糖尿病，但過度和長期飲酒會(huì)導(dǎo)致酒精性肝病〔1〕。ALD是全球肝病發(fā)病的主要致病因素，并呈逐年上升趨勢(shì)〔2〕?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)ALD的治療主要基于戒酒、營養(yǎng)支持、使用護(hù)肝藥物、改善肝損傷和預(yù)防并發(fā)癥，臨床治療依舊存在一定局限性〔3～6〕。

中醫(yī)認(rèn)為，ALD為氣、血、痰、濕相互搏結(jié)，長久無法及時(shí)疏散和排出體外，因此中醫(yī)治療多釆用行氣、活血、解毒及扶正藥配伍〔7，8〕。本研究從中醫(yī)整體觀念出發(fā)，基于清解酒毒、化瘀散結(jié)的學(xué)說，以柴胡疏肝散為基本方配以烏藥，行補(bǔ)肝益腎，又兼顧健脾、活血化瘀的功能，共奏降低酒精性肝損傷的功效。目前加味柴胡疏肝散(JWCH)對(duì)于酒精性肝損傷的實(shí)驗(yàn)研究較少，本研究通過酒精灌胃復(fù)制ALD動(dòng)物模型，探究此方劑對(duì)于ALD的保護(hù)作用和分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只SPF級(jí)昆明小鼠〔遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK(遼)2020-0001〕，雌雄各半，體重(22±2)g，飼養(yǎng)于溫度為22～ 26℃的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物屏障環(huán)境中，12 h晝/夜循環(huán)照明。

1.2藥品和試劑 實(shí)驗(yàn)用中藥購自長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。三酰甘油(TG)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒購自北京華英生物試劑有限公司，批號(hào)分別為(20210622、20210625、20210625、20210627、20210624、20210628、20210625、20210622)；抗體蛋白激酶B(AKT)、p-AKT、核因子NF-E2相關(guān)因子(Nrf)2、糖原合成酶激酶(GSK)-3β、p-GSK-3β、β-actin均購自 proteintech生物技術(shù)有限公司。

1.3藥物制備 根據(jù)藥典及臨床用藥劑量可知人用劑量為：陳皮6 g、柴胡6 g、川芎4.5 g、香附4.5 g、枳殼4.5 g、芍藥4.5 g、甘草1.5 g、烏藥4.5 g。根據(jù)人與小鼠體表面積換算得小鼠低、高劑量。水煎煮藥材2次，濃縮備用。

1.4造模及給藥 小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、JWCH低劑量(JWCH-L)組、高劑量(JWCH-H)組，每組10只，雌雄各半。除對(duì)照組外，其余各組每天定時(shí)灌胃給予50°酒精(10 ml/kg)，連續(xù)灌胃4 w。第5周開始，對(duì)照組和模型組灌胃給予20 ml/kg生理鹽水，JWCH-L、JWCH-H組分別灌胃給予50 g/kg、150 g/kg柴胡疏肝散，連續(xù)給藥2 w。

1.5肝臟指數(shù) 造模結(jié)束，稱量小鼠體重，完整取出肝臟并稱量，肝臟指數(shù)(%)=肝臟質(zhì)量(g)/小鼠體重(g)×100%。

1.6血清生化指標(biāo) 小鼠眼眶靜脈叢取血，靜置30 min，以3 500 r/min離心15 min，提取上清，嚴(yán)格按照試劑盒說明書，檢測(cè)TG、ALT、AST、CAT、GSH-Px、ROS、SOD在血清中的含量。

1.7肝組織病理學(xué)檢查 取部分肝臟，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡觀察、拍照。

1.8Western印跡檢測(cè)肝組織相關(guān)蛋白表達(dá) 取冷凍肝臟組織50 mg，提取組織總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法定量蛋白濃度。一抗〔AKT(1∶2 000)、p-AKT(1∶2 000)、GSK-3β(1∶2 000)、p-GSK-3β(1∶3 000)、Nrf2(1∶3 000)〕，4℃孵育過夜，二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影，圖片采用Image J軟件進(jìn)行圖片處理分析。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析和GraphPad Prism8繪圖軟件處理。

2 結(jié) 果

2.1JWCH對(duì)ALD小鼠體重和肝臟指數(shù)的影響 與對(duì)照組比較，模型組體重和肝臟指數(shù)明顯增加(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，JWCH-L及JWCH-H組體重和肝臟指數(shù)明顯減小(P<0.05)。見表1。

2.2JWCH對(duì)ALD小鼠血清TG、ALT、AST水平的影響 與對(duì)照組比較，模型組血清中TG、ALT、AST含量明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，JWCH-L及JWCH-H組血清中TG、ALT、AST含量明顯降低(P<0.05，P<0.01)。見表1。

2.3JWCH對(duì)ALD小鼠血清CAT、GSH-Px、ROS和SOD水平的影響 與對(duì)照組比較，模型組血清中CAT、GSH-Px、SOD含量明顯降低(P<0.05，P<0.01)，ROS含量明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，JWCH-L及JWCH-H組血清中CAT、GSH-Px、SOD含量明顯升高(P<0.05，P<0.01)，ROS含量明顯降低(P<0.01)。見表2。

2.4JWCH對(duì)ALD小鼠肝臟組織p-AKT、p-GSK-3β、Nrf2蛋白表達(dá)影響 與對(duì)照組相比，模型組肝臟組織p-AKT、p-GSK-3β、Nrf2蛋白表達(dá)量明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，JWCH各治療組p-AKT、p-GSK-3β、Nrf2蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01，P<0.05)。見表2、圖1。

表1 JWCH對(duì)ALD肝臟指數(shù)及TG、ALT、AST含量的影響

2.5JWCH對(duì)ALD小鼠肝臟組織HE染色 對(duì)照組肝組織結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列整齊，血竇走行脈絡(luò)清晰。模型組肝組織可見肝細(xì)胞氣球樣變，出現(xiàn)部分水腫壞死、肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)脂肪空泡，肝竇變窄并伴有明顯炎性細(xì)胞浸潤；與模型組相比，JWCH各治療組肝臟組織上述肝臟病理組織形態(tài)改變明顯較輕，且部分肝組織損傷恢復(fù)明顯。見圖2。

表2 JWCH對(duì)ALD小鼠血清中CAT、GSH-Px、ROS、SOD含量及肝臟組織p-AKT、p-GSH3β、Nrf2蛋白表達(dá)的影響

1～4：對(duì)照組、模型組、JWCH-L組、JWCH-H組圖1 JWCH對(duì)ALD小鼠肝臟組織p-AKT、p-GSK3β、Nrf2的蛋白表達(dá)

圖2 JWCH對(duì)ALD小鼠肝臟的影響(HE染色，大圖×100，小圖×400)

3 討 論

目前認(rèn)為，ALD的發(fā)生發(fā)展機(jī)制為酒精在肝臟代謝轉(zhuǎn)換的過程中刺激或激發(fā)了肝臟炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)〔9～11〕。已有研究發(fā)現(xiàn)，酒精在肝臟中部分被轉(zhuǎn)化為乙醛，由于體內(nèi)乙醇脫氫酶的活性比乙醛脫氫酶活性高很多，因此造成乙醛在體內(nèi)堆積無法快速代謝出體外〔12～14〕。乙醛具有很強(qiáng)的毒性效應(yīng)，影響肝臟中線粒體呼吸鏈的正?；顒?dòng)，造成線粒體氧化還原反應(yīng)障礙，氧自由基生成增多，肝臟氧化應(yīng)激性損傷加重〔15〕；同時(shí)酒精和乙醛還干擾了脂類轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝酶類，造成脂類進(jìn)入肝臟后不能轉(zhuǎn)運(yùn)出肝而形成脂肪變性〔16，17〕。

在中醫(yī)學(xué)中，將酒歸為濕熱品行列，少量飲酒可以促進(jìn)全身氣血暢通，有益于機(jī)體健康。但過量飲酒必然會(huì)對(duì)機(jī)體器官造成一定的傷害，累及肝臟及脾胃，導(dǎo)致體內(nèi)濕熱酒毒內(nèi)藏不散，這也是中醫(yī)學(xué)中ALD病機(jī)所在〔18，19〕。柴胡舒肝散是治療肝臟氣血瘀滯、行氣活血的代表方。《靈樞·五邪》篇論：“邪在肝，則兩脅中痛”，現(xiàn)代醫(yī)家亦認(rèn)為氣滯、血瘀、濕熱而致病機(jī)，均可以本方為基礎(chǔ)加減治療〔20〕。有研究表明，該方中柴胡、白芍、川芎具有降低ALD模型血清中ALT、AST、TG水平〔21～23〕。JWCH具有明顯升高肝組織中抗氧化物質(zhì)，有效消除過量自由基及減少炎癥的作用〔24〕。

本研究說明，JWCH改善ALD的主要作用機(jī)制是通過清除氧自由基或抑制其生成。 酒精對(duì)于肝臟的損傷主要通過影響胰島素受體(INSR)進(jìn)而影響肝臟的代謝和肝細(xì)胞的增殖〔25〕。INSR下游信號(hào)通路主要蛋白主要是AKT/GSK-3β〔26〕。AKT/GSK-3β通路的適當(dāng)激活對(duì)于肝臟中能量代謝和細(xì)胞存活至關(guān)重要〔27，28〕。AKT/GSK-3β通路已被證明可以減輕酒精誘導(dǎo)的肝損傷。大量研究發(fā)現(xiàn)，GSK-3β通過將 Nrf2 核轉(zhuǎn)出和磷酸化而下調(diào)其功能，Nrf2入核后靶向抗氧化基因啟動(dòng)元件，提高機(jī)體抗氧化能力〔29，30〕。本研究發(fā)現(xiàn)JWCH能夠調(diào)節(jié)p-AKT、p-GSK-3β和Nrf2蛋白表達(dá)，說明AKT/GSK-3β/Nrf2參與了JWCH的肝保護(hù)作用。

綜上，JWCH對(duì)ALD小鼠肝臟具有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與JWCH調(diào)節(jié)AKT/GSK-3β/Nrf2信號(hào)通路、抑制ALD肝臟氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。