銀杏葉提取物(EGb-761)誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制

劉培培 馮趙慧子 嚴(yán)金玲 曾雪亮 潘靜 高暢

(1贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，江西 贛州 341000；2贛州市人民醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科)

乳腺癌是一種常見(jiàn)于女性的腫瘤〔1〕，根據(jù)最新報(bào)告顯示，2020年乳腺癌全球新發(fā)病例高達(dá)226萬(wàn)例，超越肺癌成為全球第一大癌癥〔2〕。目前，對(duì)于乳腺癌轉(zhuǎn)移臨床上多采用手術(shù)治療，放化療輔助術(shù)后治療，但治療效果較為一般，經(jīng)常發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的情況〔3〕，因此，尋找一種防治癌癥的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、降低放化療毒副作用的抗癌藥物十分必要。銀杏葉提取物(EGb-761)為傳統(tǒng)中藥材銀杏葉中提取的活性成分，具有低毒高效的特點(diǎn)，已有學(xué)者將其用于治療神經(jīng)損傷、肝損傷及腎代謝等疾病〔4，5〕，但銀杏葉提取物對(duì)腫瘤尤其是人乳腺癌治療效果的研究報(bào)道較少，其分子機(jī)制尚不十分明確。磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路和細(xì)胞活動(dòng)密切相關(guān)，已被研究證實(shí)與多種人類(lèi)腫瘤存在關(guān)聯(lián)，其活性異常會(huì)使細(xì)胞周期紊亂，導(dǎo)致正常細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)換〔6，7〕。本研究觀察EGb-761對(duì)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的影響，并基于PI3K/Akt通路探討EGB-761抗腫瘤作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株與EGb-761 MDA-MB-231細(xì)胞(購(gòu)自協(xié)和細(xì)胞庫(kù))；EGb-761(17.5 mg/5 ml，臺(tái)灣濟(jì)生化學(xué)制藥廠(chǎng)股份有限公司，批號(hào)：M4073)。

1.2試劑與儀器 RPMI1640培養(yǎng)基、青鏈霉素購(gòu)自同田科技有限公司；蛋白胰酶購(gòu)自GEN-VIEW科技有限公司；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清購(gòu)自愛(ài)必信生物有限公司；噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒、transwell小室、基質(zhì)膠、凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3、腺苷二磷酸-核糖聚合酶(PARP)、糖原合成酶激酶(GSK)-3β、p-GSK-3β、PI3K、p-Akt 、Akt和β-actin抗體及山羊抗兔IgG購(gòu)自成都正能生物有限公司；Elx800酶標(biāo)儀購(gòu)自BioTek公司；Western 濕電轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；S3e流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；熒光倒置顯微鏡購(gòu)自美國(guó)Leica公司。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)及分組 MDA-MB-231細(xì)胞在培養(yǎng)基中(含10%胎牛血清，1%的青鏈霉素)，于37℃、5%CO2溫箱中孵育，2～3 d傳代1次，3代后用于實(shí)驗(yàn)。根據(jù)銀杏葉提取物EGb-761處理的濃度分為低(656.25 μg/ml)、中(1 093.75 μg/ml)、高濃度(1 531.25 μg/ml)組，以不含EGb-761的溶劑處理細(xì)胞為對(duì)照組。

1.4MTT法檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞抑制率 取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，濃度控制為1×105個(gè)/ml。對(duì)照組和EGb-761組每孔加入100 μl細(xì)胞懸浮液，調(diào)零組加培養(yǎng)基，小孔周?chē)覲BS，于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中孵育24 h。根據(jù)分組加藥處理，調(diào)零組加等量培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。各組加MTT溶液20 μl，繼續(xù)孵育4 h。吸出上清，每孔200 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分融解，上酶標(biāo)儀測(cè)定各孔光OD490 nm值，記錄結(jié)果并計(jì)算各復(fù)孔的細(xì)胞抑制率，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞抑制率=(OD對(duì)照-ODEGb-761)/(OD對(duì)照-OD調(diào)零)×100%。

1.5細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，0.25%胰酶消化，離心，重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/ml。按上述細(xì)胞分組處理，上室加入100 μl處理好細(xì)胞懸液，下室加入含20%血清的培養(yǎng)基，放5% CO2，37℃培養(yǎng)箱中孵育24 h。取出小室，吸去溶液，4%甲醛固定細(xì)胞10 min，0.1%結(jié)晶紫染色10 min左右，清洗。用棉簽小心擦去上室底部膜表面上的細(xì)胞，取5個(gè)方向隨機(jī)視野，顯微鏡下計(jì)數(shù)，計(jì)算取平均值。

1.6細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 取稀釋的人工基質(zhì)膠125 μl加入transwell板上室，平攤覆蓋至膜上，然后在溫箱中放置30 min，使人工基質(zhì)膠聚合。取對(duì)數(shù)期待測(cè)細(xì)胞，調(diào)整濃度為2×105個(gè)/ml，上室接種處理后MDA-MB-231細(xì)胞懸液，下室用初始的培養(yǎng)基做趨化因子。后續(xù)步驟同1.5遷移實(shí)驗(yàn)，顯微鏡下計(jì)數(shù)，計(jì)算取平均值。

1.7倒置顯微鏡下形態(tài)觀察 取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，接種于24孔板并控制密度為1×105個(gè)/孔，培養(yǎng)細(xì)胞，按1.3描述方法進(jìn)行分組處理，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，顯微鏡下觀察乳腺癌細(xì)胞形態(tài)。

1.8雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，接種到6孔板中，每孔約2×105個(gè)細(xì)胞。置于溫箱中，根據(jù)分組處理，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。以0.25%胰酶消化細(xì)胞，離心后棄上清。4℃預(yù)冷的70%乙醇固定，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml，加入染色劑10 ml，置于4℃冰箱中染色30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡情況，細(xì)胞凋亡率(%)=凋亡細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù)×100%計(jì)算。

1.9Western印跡檢測(cè)PI3K/Akt通路蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)期細(xì)胞同上處理分組，培養(yǎng)48 h，收集各組細(xì)胞加入細(xì)胞液裂解15 min，用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將樣品放在沸水中加熱至蛋白完全變性，拿出樣品冷卻至室溫，取30 μg進(jìn)行電泳，濕轉(zhuǎn)聚偏氟乙烯(PVDF)膜。常溫下以5%脫脂牛奶封閉2 h，后用TBST清洗3次，一抗caspase-3、PARP、p-GSK-3β、GSK-3β、PI3K、p-Akt、Akt(1∶1 000)4℃孵育過(guò)夜，洗膜，DyLight 800標(biāo)記的二抗(1∶2 000)常溫下孵育1 h，PVDF清洗膜3次后，用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯影處理，拍照，用ImageJ(v1.7.0)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)所得條帶進(jìn)行定量分析，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，相對(duì)表達(dá)量=目標(biāo)蛋白灰度值/參照蛋白灰度值。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1EGb-761對(duì)細(xì)胞抑制率的影響 對(duì)照組和EGb-761低、中、高組的抑制率依次為(0.00±0.00)%、(27.28±5.66)%、(48.05±4.90)%、(80.30±4.00)%，各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且EGb-761對(duì)DA-MB-231細(xì)胞抑制作用呈濃度依懶性(均P<0.05)。

2.2EGb-761對(duì)細(xì)胞遷移的影響 對(duì)照組和EGb-761低、中、高組的遷移個(gè)數(shù)分別為(379.40±27.46)個(gè)、(348.80±17.08)個(gè)、(288.00±16.23)個(gè)、(224.00±11.38)個(gè)，與對(duì)照組比較，EGb-761各劑量組細(xì)胞穿透數(shù)量顯著減少，且呈劑量依賴(lài)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

2.3EGb-761對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響 對(duì)照組和EGb-761低、中、高組的細(xì)胞數(shù)分別為(272.60±15.37)個(gè)、(208.80±16.21)個(gè)、(127.20±11.12)個(gè)、(69.80±10.66)個(gè)。與對(duì)照組比較，EGb-761組細(xì)胞侵襲數(shù)量明顯減少，且呈劑量依賴(lài)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見(jiàn)圖1。

2.4EGb-761對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響 對(duì)照組MDA-MB-231細(xì)胞為細(xì)長(zhǎng)不規(guī)則狀，間隙較小，分布密集。加入EGb-761培養(yǎng)48 h后，細(xì)胞間隙增大，密度顯著降低，貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞開(kāi)始脫壁，胞質(zhì)出現(xiàn)渾濁，細(xì)胞外形收縮呈片狀球狀，出現(xiàn)細(xì)胞腫脹破裂情況，提示處理后細(xì)胞會(huì)明顯發(fā)生凋亡，見(jiàn)圖2。

2.5EGb-761對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 對(duì)照組和EGb-761低、中、高組的細(xì)胞凋亡率分別為(2.15±0.41)%、(23.23±2.07)%、(44.69±4.12)%，(65.78±5.26)%。與對(duì)照組比較，EGb-76組細(xì)胞凋亡率明顯升高，且呈劑量依賴(lài)性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見(jiàn)圖3。

2.6各組PI3K/Akt通路蛋白水平測(cè)定 與對(duì)照組比較，EGb-761處理后各組PARP和PI3K蛋白含量均明顯降低，caspase-3含量顯著升高，p-GSK-3β和p-Akt水平顯著下降，且EGb-761劑量越高效果越顯著(均P<0.05)。見(jiàn)表1、圖4。

圖1 各組細(xì)胞遷移及侵襲(結(jié)晶紫染色，×200)

圖2 各組MDA-MB-231細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)變化(結(jié)晶紫染色，×200)

圖3 各組細(xì)胞凋亡率

表1 各組PI3K/Akt通路蛋白表達(dá)

1～4：對(duì)照組、EGb-761低濃度組、EGb-761中濃度組、EGb-761高濃度組圖4 各組PI3K/Akt通路蛋白Western印跡檢測(cè)

3 討 論

細(xì)胞的增殖和凋亡是非常重要的生理過(guò)程，正常情況下細(xì)胞的增殖會(huì)受到自身限制，細(xì)胞凋亡表現(xiàn)穩(wěn)定。但在癌細(xì)胞中這些平衡會(huì)被打破，細(xì)胞增殖速度異常并失去控制，凋亡途徑被阻斷，使得癌細(xì)胞非常具有危險(xiǎn)性〔8〕。

在分子層面上，PI3K/Akt通路參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生理功能，而乳腺癌的產(chǎn)生和細(xì)胞活動(dòng)的異常存在直接的關(guān)系，二者之間存在的一定的聯(lián)系〔9，10〕。PI3K 是一種異源二聚體酶，多種信號(hào)因子都可以使PI3K活化〔11，12〕?；罨腜I3K通過(guò)特異性催化激活胞膜上的PIP3，從而靶向調(diào)控Akt。Akt是PI3K重要的下游效應(yīng)蛋白〔13〕，活化后的Akt可以通過(guò)作用于PARP、GSK-3β、caspase-3等因子，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能，與腫瘤的形成發(fā)展有緊密的關(guān)聯(lián)〔14，15〕。作為PI3K/Akt的下游分子的PARP蛋白是一種DNA修復(fù)酶，在細(xì)胞凋亡調(diào)控中發(fā)揮著十分重要的作用，其主要通過(guò)內(nèi)源性途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，PARP的剪切與caspase-3活化也存在密切關(guān)聯(lián)。caspase-3在細(xì)胞凋亡有著重要的作用，研究表明，PI3K/Akt信號(hào)通過(guò)caspase-3蛋白，引起促凋亡蛋白B細(xì)胞淋巴瘤-2相關(guān)X蛋白(Bax)從細(xì)胞質(zhì)向線(xiàn)粒體外膜移位，破壞線(xiàn)粒體膜的完整性，降低膜電位，使得細(xì)胞開(kāi)始凋亡。GSK-3β是一種普遍存在細(xì)胞中的調(diào)控糖原合成酶，活化的GSK-3β蛋白作用與多種信號(hào)分子，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生命活動(dòng)，但在在腫瘤細(xì)胞中GSK-3β代謝會(huì)產(chǎn)生異常，使得機(jī)體紊亂。有研究表明，PI3K/Akt信號(hào)通過(guò)caspase-3蛋白〔16〕。

本研究結(jié)果說(shuō)明，EGb-761通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路下調(diào)腫瘤細(xì)胞中PARP和PI3K的表達(dá)，上調(diào)caspase-3的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡。EGb-761中的主要有效成分為銀杏黃酮類(lèi)化合物。研究認(rèn)為，包括EGb-761在內(nèi)的多種黃酮類(lèi)化合物具有抗氧化作用，同時(shí)可以影響體內(nèi)金屬離子平衡，調(diào)節(jié)代謝狀態(tài)，近幾年隨著研究愈加深入，發(fā)現(xiàn)EGb-761在分子水平上也有巨大的影響作用，可以調(diào)控多個(gè)信號(hào)通路〔17〕?？鸿吹取?8〕研究發(fā)現(xiàn)，EGb761可以通過(guò)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)/PI3K/Akt1通路清除氧自由基，從而改善大鼠創(chuàng)傷性腦水腫；劉鐵鋼等〔19〕在報(bào)告中指出，EGb-761對(duì)甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞株的抗腫瘤效果與調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路密切相關(guān)〔19〕。在EGb-761所屬的黃酮類(lèi)化合物研究中也有相應(yīng)的結(jié)果，韋飛燕等〔20〕研究說(shuō)明黃酮類(lèi)中藥單體被證實(shí)具有顯著的抗腫瘤活性，具有誘導(dǎo)凋亡和自噬、抑制增殖和轉(zhuǎn)移的作用，內(nèi)在機(jī)制可能與多個(gè)通路相關(guān)，其中就包括PI3K/Akt 途徑。而關(guān)于人乳腺癌的研究中，López-Knowles等〔21〕通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明PI3K通路可以有效抑制腫瘤細(xì)胞；Jie等〔22〕則在研究報(bào)告中指出，抑制PI3K和Akt的活化可以有效的促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)EGb-761影響乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、凋亡過(guò)程，與其他人在不同類(lèi)型細(xì)胞中的研究結(jié)果相似，同時(shí)，發(fā)現(xiàn)EGb-761通過(guò)PI3K/Akt途徑調(diào)控多種蛋白的表達(dá)和活化，作用與MDA-MB-231的生命活動(dòng)。

綜上，EGb-761通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt途徑扼制MDA-MB-231細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，具有較好的抗腫瘤作用，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制PI3K及Akt的磷酸化，抑制下游蛋白表達(dá)，并誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡。本研究為體外試驗(yàn)，對(duì)EGb-761在生物體內(nèi)的功效未做探討，能否被機(jī)體利用且具體臨床療效，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究驗(yàn)證。