促紅細(xì)胞生成素衍生肽對表柔比星致大鼠心肌損傷ERK1/2信號通路的影響

馮俊月 李躍榮 馬寶新

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 濱州 256600)

阿霉素是一種有效的抗腫瘤藥物，但它會導(dǎo)致累積性和劑量依賴性的心臟毒性，范圍從心肌結(jié)構(gòu)和功能的隱匿性改變到可能導(dǎo)致心臟移植或死亡的嚴(yán)重心肌病和充血性心力衰竭〔1〕。阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性的確切因果機(jī)制仍然不清楚，這使得很難預(yù)測或預(yù)防其在個(gè)別患者中的嚴(yán)重不良事件〔2〕。研究發(fā)現(xiàn)〔3〕阿霉素和相關(guān)的蒽環(huán)類藥物表柔比星(EPI)在蛋白和mRNA水平上顯著上調(diào)了心肌細(xì)胞的死亡受體的表達(dá)，由此產(chǎn)生自發(fā)凋亡。促紅細(xì)胞生成素(EPO)是一種主要由腎臟分泌的糖蛋白激素，具有促進(jìn)造血的功能，還可作為一種保護(hù)因子，作用于機(jī)體多種組織器官，包括神經(jīng)系統(tǒng)、心臟 、腎臟等〔4〕，通過減少細(xì)胞凋亡、抑制炎癥反應(yīng)、促血管生長等發(fā)揮其組織保護(hù)作用〔5〕。EPO衍生肽(HBSP)是EPO衍生物，HBSP與EPO具有組織保護(hù)作用，但HBSP不刺激骨髓造血系統(tǒng)，無促紅細(xì)胞生成，避免了EPO導(dǎo)致高血壓、高凝等副作用〔6〕。目前研究表明〔7,8〕，HBSP可能是通過caspase-3凋亡相關(guān)蛋白發(fā)揮抗凋亡作用，通過磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路改善EPI所致心肌損傷模型大鼠心肌損傷。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)1/2是一種與心肌保護(hù)相關(guān)的重要胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶，其相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被認(rèn)為是經(jīng)典絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。然而ERK1/2信號通路是否對EPI所致心肌損傷發(fā)揮保護(hù)作用需研究證實(shí)。本文探討EPO衍生肽對EPI所致大鼠心肌損傷ERK1/2信號通路影響作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 雄性Wistar大鼠(濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司)；注射用鹽酸EPI(海正輝瑞制藥有限公司)；注射用重組人促紅細(xì)胞生成素(rhEPO) (昂德生物藥業(yè)有限公司)；HBSP(上?？齐纳锟萍加邢薰?；細(xì)胞色素(Cyt)C、半胱胺酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-9抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；山羊抗兔多克隆二抗、山羊血清(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。總RAN提取試劑盒(上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒(TaKaRa公司)；ERK1、ERK2引物及內(nèi)參磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH；上海生工生物工程有限公司)。

1.2動物造模 雄性Wistar大鼠40只，6～8周齡，體重260～300 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w。隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，每組10只，分為正常對照(CON)組、EPI模型組、EPO治療組、HBSP治療組。EPI模型組：每周給與腹腔注射EPI(2.5 mg/kg)1次，共6 w，累積劑量15 mg/kg，注射等量生理鹽水在給與EPI前1 d，后1 d及后3 d；EPO治療組：每周給與腹腔注射rhEPO(5 000 IU/kg)3次，分別為注射EPI前1 d，后1 d及后3 d，共6 w；HBSP治療組：腹腔注射HBSP 60 μg/kg，給藥時(shí)間同EPO組。CON組以等量生理鹽水腹腔注射6 w。再喂養(yǎng)5 w后處死大鼠。

1.3蘇木素-伊紅(HE)染色 麻醉大鼠，心臟灌流后，固定取心尖組織，多聚甲醛溶液浸泡固定，經(jīng)脫水、透明、浸蠟，石蠟包埋。切片厚約4 μm，行HE染色。于光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠心臟組織。

1.4免疫組織化學(xué)測CytC、caspase-9表達(dá)的變化 石蠟塊切片厚約4 μm，常規(guī)脫蠟、脫水。乙二胺四乙酸(EDTA)熱修復(fù)抗原活性，3%過氧化氫(H2O2)滅活內(nèi)源性過氧化物酶，5%山羊血清封閉后滴加一抗，CytC、caspase-9 濃度分別為1∶200、1∶50，4℃孵育過夜。加山羊抗兔二抗，37℃孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片。置于光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織，每組隨機(jī)取8張切片，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)400倍視野在光鏡下進(jìn)行觀察。用Image Pro Plus5.1圖像分析軟件測定心肌組織中CytC、caspase-9蛋白表達(dá)的平均光密度(IOD/area)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5PCR檢測心肌組織中ERK1、ERK 2 mRNA表達(dá) 采用RT-PCR法檢測：(1)總RNA 提取：稱取20 mg左右大鼠心肌組織在研磨棒中研磨成勻漿，按總RNA提取試劑盒操作步驟提取總RAN，取總RNA于紫外分光光度計(jì)測定RNA濃度和純度。(2)逆轉(zhuǎn)錄：按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書把總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。(3)以cDNA為模板、以GAPDH為內(nèi)參，對ERK1、ERK2基因進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增：反應(yīng)體系為10 μl PCR Master Mix (2×)，10 μmol/L上下游引物。引物序列：ERK1：上游：5′-CCCTTGACCTGAGTGATGAG-3′,下游：5′-CATAGCCCTTCCATTCCAGA-3′;ERK2:上游：5′-CACATCCTGGGTATTCTTGGA-3′,下游：5′-AGTCAGCGTTTGGGAACAAC-3′;GAPDH:上游：5′-CCACGAAACTACCTTCAACTCC-3′,下游：5′-GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT-3′。cDNA模板2 μl，反應(yīng)液體積為20 μl。反應(yīng)條件94℃ 3 min 變性，94℃ 10 s；60℃ 40 s，40循環(huán)；72℃ 7 min。PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳，使用凝膠成像系統(tǒng)Image Lab進(jìn)行條帶圖像采集。RT-PCR擴(kuò)增：反應(yīng)體系為12.5 μl TB Green，10 μmol/L上下游引物，cDNA模板(<100 ng)2 μl，反應(yīng)液體積為25 μl。反應(yīng)條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)；95℃ 10 s。按標(biāo)準(zhǔn)曲線的反應(yīng)體系及條件進(jìn)行擴(kuò)增。分別收集內(nèi)參GAPDH及目的基因ERK1、ERK2的Ct值，根據(jù) 2-ΔΔCt公式計(jì)算相對表達(dá)量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1一般情況 與CON組比較，隨著周齡的增加，EPI模型組大鼠體重增加較少，說明EPI影響了低齡大鼠的生長發(fā)育。EPI模型組EPI腹腔注射后，部分開始出現(xiàn)精神萎靡、腹水、脫毛、活動量減少等現(xiàn)象，第9周出現(xiàn)2只大鼠死亡。EPO治療組第10周1只大鼠死亡。第11周時(shí)取出兩組心臟稱重并計(jì)算心臟重量質(zhì)量比，結(jié)果顯示兩組心臟重量質(zhì)量比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明EPI不是通過心肌肥大導(dǎo)致心肌功能損傷。

2.2各組心肌組織病理學(xué)結(jié)果 心臟組織切片HE染色結(jié)果顯示，CON組心肌纖維排列整齊、橫紋清晰，細(xì)胞間隙正常，心肌細(xì)胞大小、形態(tài)正常；EPI模型組心肌細(xì)胞腫大、排列紊亂，胞質(zhì)呈溶解狀態(tài)、核深染，橫紋模糊，細(xì)胞間隙扭曲增寬，可見部分肌原纖維溶解斷裂。與EPI組比較，EPO治療組及HBSP治療組心肌纖維排列、心肌細(xì)胞大小、形態(tài)等形態(tài)學(xué)改變較少。見圖1。

2.3各組心肌組織CytC、caspase-9蛋白表達(dá) 各組心肌組織CytC、caspase-9蛋白的陽性表達(dá)均為棕黃色顆粒，位于細(xì)胞質(zhì)中。CON組僅有少量CytC、caspase-9蛋白表達(dá)。與CON組比較，EPI模型組心肌組織CytC、caspase-9蛋白表達(dá)明顯增多(P<0.05)；與EPI模型組比較，EPO治療組與HBSP治療組心肌組織CytC、caspase-9蛋白表達(dá)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。EPO治療組與HBSP治療組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2、圖3、表1。

圖1 各組心肌組織(HE染色，×400)

圖2 各組心肌組織CytC表達(dá)(DAB染色,×400)

圖3 各組心肌caspase-9蛋白表達(dá)(DAB染色,×400)

表1 各組心肌組織CytC、caspase-9平均光密度

2.4各組心肌組織中 ERK mRNA表達(dá)變化 與CON組比較，EPI模型組心肌組織中ERK1、ERK2 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。與EPI模型組比較，EPO治療組和HBSP治療組心肌組織中ERK1、ERK2 mRNA表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)。EPO治療組與HBSP治療組ERK1、ERK2 mRNA表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4、表2。

圖4 各組心肌caspase-9蛋白表達(dá)(DAB染色,×400)

表2 各組心肌組織ERK1、ERK2 mRNA 相對表達(dá)量比較

3 討 論

蔥環(huán)類化療藥物，如阿霉素是目前許多腫瘤的重要治療手段之一，但是此類化學(xué)藥物容易產(chǎn)生心臟毒性。阿霉素治療引起的急性或長期的心臟毒性受到了臨床極大關(guān)注〔9〕。阿霉素誘導(dǎo)的線粒體功能障礙是阿霉素心臟毒性作用的重要機(jī)制，進(jìn)而誘導(dǎo)活性氧增多、心肌細(xì)胞凋亡增加和心臟功能下降〔10〕。阿霉素可直接通過線粒體和(或)通過氧化應(yīng)激和細(xì)胞內(nèi)高鈣來刺激caspase-3誘導(dǎo)的凋亡。增加抗凋亡因子B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2 的表達(dá)和降低促凋亡因子caspase-3和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)的表達(dá)可改善阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡〔11〕。由細(xì)胞自發(fā)進(jìn)行的內(nèi)源性凋亡大部分是以線粒體為中心進(jìn)行的并由線粒體調(diào)節(jié)。細(xì)胞毒性應(yīng)激能觸發(fā)內(nèi)源性凋亡途徑，在dATP的作用下，CytC引發(fā)凋亡蛋白酶激活因子-1寡聚成大蛋白支架，即凋亡小體，凋亡小體可以激活caspase-9，caspase-9進(jìn)而激活效應(yīng)caspase〔12〕，caspase-3能夠裂解一系列的死亡底物，這些死亡底物的裂解會誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞發(fā)生DNA片段化、細(xì)胞核碎片化、斷裂細(xì)胞膜起泡等一系列細(xì)胞表型和生化指標(biāo)的改變，完成細(xì)胞凋亡。

研究發(fā)現(xiàn)EPO對多種心臟疾病具有重要的保護(hù)作用〔13〕，EPO可緩解氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，促進(jìn)血管再生，減少心肌梗死急性期有害物質(zhì)的釋放，改善心肌重構(gòu)及心臟舒縮功能，對持續(xù)性損傷的心肌細(xì)胞具有重要的保護(hù)作用〔14〕。EPO需要大劑量才能發(fā)揮組織保護(hù)作用，會造成對骨髓造血系統(tǒng)的過度刺激〔15〕。螺旋B表面肽(HBSP)是一種新發(fā)現(xiàn)的具有組織保護(hù)作用的促紅細(xì)胞生成素衍生肽，在腎臟〔16〕、肺臟〔17〕及肝臟〔18〕中發(fā)揮保護(hù)作用。Lin等〔19〕研究發(fā)現(xiàn)HBSP保護(hù)心肌缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的過度自噬和細(xì)胞凋亡。近年來，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)了HBSP在心臟中的保護(hù)作用。HBSP在心肌梗死〔20、21〕、糖尿病心肌病〔22〕及心肌缺血再灌注損傷模型〔23〕中具有抗心肌凋亡及減輕心肌損傷等作用。

由本研究病理學(xué)結(jié)果可證實(shí)EPI誘導(dǎo)的大鼠心肌損傷模型構(gòu)建成功，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明HBSP、EPO改善EPI模型大鼠的心肌損傷。本研究還發(fā)現(xiàn)EPI可能是通過線粒體釋放CytC，激活caspase-9通路來促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，加重心肌損害。而HBSP及EPO可能是降低線粒體釋放凋亡相關(guān)因子CytC，抑制caspase-9表達(dá)來抑制心肌細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。EPO、HBSP與EPOR-βcR結(jié)合后可以激活多種信號通路抑制凋亡、炎癥發(fā)揮組織保護(hù)作用〔24〕。第一條通路：PI3K/Akt；第二條通路：ERK1/2/MAPK；第三條通路：信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子 (STAT)3通路。本研究前期結(jié)果顯示，EPO與HBSP通過PI3K/Akt信號通路改善EPI所致心肌損傷模型大鼠心肌損傷。HBSP還可以通過抑制自噬Akt-哺乳動物雷帕霉素蛋白(mTOR)〔25〕信號通路減輕心肌缺血/再灌注損傷，減輕炎癥因子Akt/糖原合成酶激酶(Gsk)-3β〔26〕信號通路減輕糖尿病心肌病損傷。研究證實(shí)在心肌梗死、心肌缺血再灌注及擴(kuò)張型心肌病動物模型中ERK1/2信號通路參與了心肌損傷保護(hù)機(jī)制〔27〕。

本研究結(jié)果表明，各組均有ERK1、ERK2 mRNA的表達(dá)，RT-PCR結(jié)果說明HBSP比EPO對ERK1、ERK2基因的表達(dá)更具有促進(jìn)作用。因此，HBSP及EPO改善EPI模型大鼠的心肌損傷可能通過ERK1/2信號通路發(fā)揮作用。HBSP改善心肌損傷更強(qiáng)，可能是HBSP通過抑制Akt-mTOR、Akt/Gsk-3β信號通路來進(jìn)一步減輕心肌損傷，需要實(shí)驗(yàn)證實(shí)。由此推論HBSP具有抑制細(xì)胞凋亡，保護(hù)心肌細(xì)胞損傷的作用，其機(jī)制可能通過激活ERK1/2信號通路來減少CytC蛋白的表達(dá)，降低 caspase-9蛋白的表達(dá)，減少CytC釋放，抑制 caspase-9蛋白活性有關(guān)。

綜上，ERK1/2的表達(dá)與保護(hù)心肌損傷關(guān)系密切，HBSP對EPI誘導(dǎo)的大鼠心肌損傷模型中ERK1/2基因的表達(dá)有干預(yù)作用，為化療藥物引起的心肌損傷新藥研究及靶向治療提供新思路。本實(shí)驗(yàn)不足之處，無ERK1/2特異性阻斷劑，無法直接證明ERK1/2信號通路抗心肌細(xì)胞損傷，HBSP可能通過多條通路保護(hù)心肌，有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究。