miR-187-3p調(diào)控FOXK1/NF-κB信號(hào)通路影響破骨細(xì)胞增殖、凋亡及分化的分子機(jī)制

張濤 楊扉扉 王藜篥 黃華 張松 曹永飛

(貴州省骨科醫(yī)院骨外科，貴州 貴陽 550002)

骨質(zhì)疏松(OP)的主要特征為骨代謝增加、骨密度降低等，常發(fā)生于絕經(jīng)后婦女中，已成為影響絕經(jīng)后婦女生活質(zhì)量的重要問題，大部分患者在骨折發(fā)生后被確診為OP，因而早期診斷及治療成為提高患者生活質(zhì)量的重要途徑〔1,2〕。微小RNA(miRNA)廣泛存在于機(jī)體中表達(dá)異常與骨代謝異常密切相關(guān)，并可能作為診斷OP的重要輔助指標(biāo)〔3〕。miR-187-3p表達(dá)水平升高可抑制大麻素受體2型(CNR2)對(duì)成骨細(xì)胞前體細(xì)胞成骨分化的抑制作用〔4〕。靶基因預(yù)測(cè)顯示miR-187-3p與叉頭框轉(zhuǎn)錄因子(FOX)K1存在結(jié)合位點(diǎn)，研究表明抑制FOXK1表達(dá)可通過抑制糖酵解作用而抑制肝癌細(xì)胞增殖〔5〕。原花青素通過抑制核因子(NF)-κB和c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號(hào)通路而抑制OP破骨細(xì)胞的形成和功能〔6〕。本研究探討miR-187-3p對(duì)破骨細(xì)胞增殖、凋亡、分化的影響及其對(duì)FOXK1/NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1一般資料 選取貴州省骨科醫(yī)院2018年2月至2020年9月收治的49例絕經(jīng)后OP性骨折患者為OP組，所有患者符合世界衛(wèi)生組織在2004年頒布的OP診斷標(biāo)準(zhǔn)，年齡63～75歲，平均(68.24±5.61)歲，體重(62.31±6.29)kg，身高(156.32±5.62)cm，體重指數(shù)(BMI，26.16±3.16)kg/m2。同時(shí)選取絕經(jīng)后OP無骨折患者49例為control組，年齡65～78歲，平均(69.34±3.24)歲，體重(61.35±5.24)kg，身高(155.49±6.32)cm，BMI(26.35±3.21)kg/m2。兩組年齡、體重、身高、BMI比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者知情且簽署同意書。所有研究對(duì)象于清晨抽取患者空腹外周靜脈血，室溫靜置5 min后經(jīng)3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，吸取上清液置于-20℃冰箱內(nèi)保存。

1.1.2主要試劑 南京君科生物提供18只SPF級(jí)雌性大鼠，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK(寧)：2016-0020，體重(184.16±23.16)g，8周齡。美國(guó)Invitrogen提供Lipofectamine2000、Trizol試劑；北京天根生化提供反轉(zhuǎn)錄與熒光定量PCR試劑；廣州銳博生物提供miR-NC、miR-187-3p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-187-3p；武漢淼靈生物提供pcDNA；北京索萊寶提供噻唑藍(lán)(MTT)試劑、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒；美國(guó)CST提供兔抗鼠Ki-67、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved-caspase)-3抗體；北京百奧萊博提供兔抗鼠p-p65、磷酸化NF-κB抑制蛋白(p-IкBα)抗體。

1.2方法

1.2.1建立OP大鼠模型與分離大鼠破骨細(xì)胞 采用隨機(jī)分組的方法分為正常組與模型組，每組9只。模型組禁食12 h，肌肉注射0.5 g阿托品，采用3.6%水合氯醛進(jìn)行全身麻醉，消毒后在大鼠背部正中切口，切除大鼠肋緣下側(cè)的雙側(cè)卵巢，縫合切口后采用無菌紗布與油紗雙層敷料覆蓋創(chuàng)面、包扎，通過檢測(cè)大鼠的血、尿、骨骼參數(shù)判斷造模是否成功〔7〕。兩組頸椎脫位處死后，采用乙醇浸泡消毒，采取大鼠兩側(cè)股骨、脛骨，取周圍軟骨組織后切除兩端骨骺，骨髓腔暴露，采用50 ml α-MEM培養(yǎng)液與1 ml青霉素-鏈霉素溶液清洗骨髓腔直至骨面變白，輕輕吹打提取液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，經(jīng)25 000 r/min離心8 min后，加入10 ml α-MEM培養(yǎng)液制備單細(xì)胞懸液〔8〕。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組 在10%胎牛血清、100 U/ml青霉素與100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中接種破骨細(xì)胞，使細(xì)胞在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，一直到細(xì)胞能生長(zhǎng)融合達(dá)到80%，之后開展傳代培養(yǎng)。于96孔板(100 μl/孔)接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期破骨細(xì)胞(2.5×105個(gè)/ml)，分別將miR-NC、miR-187-3p mimics、pcDNA-NC、pcDNA-FOXK1、miR-187-3p mimics與pcDNA-NC、miR-187-3p mimics與pcDNA-FOXK1轉(zhuǎn)染入破骨細(xì)胞，分別記為miR-NC組、miR-187-3p組、pcDNA-NC組、pcDNA-FOXK1組、miR-187-3p+pcDNA-NC組、miR-187-3p+pcDNA-FOXK1組。同時(shí)將正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為NC組。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)miR-187-3p與FOXK1、耐酒石酸酸性磷酸酶(Acp)-5、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)9、組織蛋白酶(Cathepsin)K、整合素(Integrinαv)mRNA 的表達(dá)水平 針對(duì)control組、OP組的血清、各種破骨細(xì)胞總RNA均經(jīng)過Trizol法提取，以反轉(zhuǎn)錄方法合成cRNA，并開展qRT-PCR擴(kuò)增。之后進(jìn)行熒光定量PCR方法對(duì)基因的相對(duì)表達(dá)量作出檢測(cè)。

1.2.4MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 將各組的破骨細(xì)胞接種在96孔板上，并且在每孔中均加入20 μl MTT溶液，然后放置在體積分?jǐn)?shù)為5%的二氧化碳培養(yǎng)箱當(dāng)中，設(shè)置溫度為37℃，持續(xù)培養(yǎng)4 h，取上清液，之后每孔再加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，在溫室作用之下震蕩孵育5 min，再以酶標(biāo)儀將各孔的吸光度值做出標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 每組的破骨細(xì)胞內(nèi)均需要將胰蛋白酶(0.25%濃度)加入促進(jìn)消化，以凋亡測(cè)試試劑盒的說明書為依據(jù)進(jìn)行嚴(yán)格的檢測(cè)。

1.2.6雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-187-3p與FOXK1的靶向關(guān)系 將miR-NC、miR-187-3p mimics分別同野生型載體WT-FOXK1與突變型載體MUT-FOXK1共同轉(zhuǎn)入到破骨細(xì)胞，之后常規(guī)培養(yǎng)24 h，然后開展熒光測(cè)試，利用熒光素酶活性對(duì)細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定，分析結(jié)果。

1.2.7Western印跡檢測(cè)FOXK1、Ki-67、Cleaved-caspase-3、p-p65、p-IкBα蛋白表達(dá) 所有組的破骨細(xì)胞均以500 μl的放射免疫沉淀(RIPA)裂解液實(shí)施細(xì)胞提取，得到細(xì)胞總蛋白，將所獲取的細(xì)胞總蛋白樣品選擇50 μl加入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)開展電泳反映，使蛋白分離。之后在密閉環(huán)境下停放2 h，將1∶1 000的一抗稀釋液加入，將輔浴箱溫度設(shè)置為4℃，放入其中孵育24 h。對(duì)經(jīng)過TBST洗滌以后的樣品再加入1∶2 000的二抗稀釋液,然后采用ImageJ軟件為各個(gè)條帶灰度值作出分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1OP性骨折患者血清中miR-187-3p和FOXK1的表達(dá)水平 與control組比較，OP組血清中miR-187-3p表達(dá)水平明顯降低，F(xiàn)OXK1 mRNA及蛋白水平明顯升高(均P<0.05)，見圖1、表1。

圖1 Western印跡檢測(cè)人血清中FOXK1蛋白表達(dá)

表1 OP骨折患者血清中miR-187-3p和FOXK1表達(dá)水平

2.2OP大鼠模型破骨細(xì)胞中miR-187-3p和FOXK1表達(dá)情況 與正常組比較，模型組miR-187-3p表達(dá)水平明顯降低，F(xiàn)OXK1 mRNA及蛋白水平明顯升高(P<0.05)，見圖2、表2。

圖2 Western印跡檢測(cè)破骨細(xì)胞FOXK1蛋白表達(dá)

表2 破骨細(xì)胞中FOXK1和miR-187-3p表達(dá)量

2.3高表達(dá)miR-187-3p抑制破骨細(xì)胞活性和分化，促進(jìn)細(xì)胞凋亡 與miR-NC組比較，miR-187-3p組細(xì)胞活力明顯降低，細(xì)胞凋亡率明顯升高，Ki-67、Acp-5、MMP9、Cathepsin K、Integrinαv mRNA表達(dá)水平明顯降低，miR-187-3p、Cleaved-caspase-3蛋白水平明顯升高(均P<0.05)，見圖3、表3。

2.4高表達(dá)FOXK1促進(jìn)破骨細(xì)胞活性和分化，抑制細(xì)胞凋亡 與pcDNA-NC組比較，pcDNA-FOXK1組細(xì)胞活力明顯明顯升高，細(xì)胞凋亡率明顯降低，F(xiàn)OXK1、Ki-67、Acp-5、MMP9、Cathepsin K、Integrinαv mRNA表達(dá)水平明顯升高，Cleaved-caspase-3蛋白水平降低(P<0.05)，見表4、圖4。

圖3 高表達(dá)miR-187-3p抑制破骨細(xì)胞活性和分化，促進(jìn)細(xì)胞凋亡

表3 高表達(dá)miR-187-3p抑制破骨細(xì)胞活性和分化，促進(jìn)細(xì)胞凋亡

圖4 高表達(dá)FOXK1對(duì)破骨細(xì)胞活性、分化細(xì)胞凋亡的影響

表4 高表達(dá)FOXK1對(duì)破骨細(xì)胞活性、分化、抑制細(xì)胞凋亡的影響

2.5miR-187-3p靶向表達(dá)FOXK1 starbase預(yù)測(cè)顯示miR-187-3p和FOXK1存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖5。miR-187-3p過表達(dá)可明顯降低野生型載體WT-FOXK1的熒光素酶活性(P<0.05)，見表5。miR-NC組FOXK1蛋白表達(dá)為(0.92±0.09)，miR-187-3p組為(0.43±0.04)，anti-miR-NC組為(0.94±0.08)，anti-miR-187-3p組為(1.37±0.13)。與miR-NC組、anti-miR-NC組比較，miR-187-3p過表達(dá)可抑制FOXK1表達(dá)，抑制miR-187-3p表達(dá)可促進(jìn)FOXK1表達(dá)(P<0.05)，見圖6。

圖5 通過starbase對(duì)miR-187-3p和FOXK1結(jié)合進(jìn)行預(yù)測(cè)示意圖

表5 miR-NC或 FOXK1與報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細(xì)胞后雙熒光素酶活性檢測(cè)

1～5:miR-NC組，miR-187-3p組，anti-miR-NC組，anti-miR-187-3p組圖6 Western印跡檢測(cè)4組FOXK1蛋白表達(dá)

2.6FOXK1高表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)miR-187-3p高表達(dá)對(duì)破骨細(xì)胞增殖、凋亡、分化的影響 與miR-187-3p+pcDNA-NC組比較，miR-187-3p+pcDNA-FOXK1組細(xì)胞活力明顯升高，細(xì)胞凋亡率明顯降低，Ki-67、Acp-5、MMP9、Cathepsin K、Integrinαv的表達(dá)水平明顯升高，Cleaved-caspase-3蛋白水平明顯降低(P<0.05)，見圖7、圖8、表6。

圖7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

1，2：miR-187-3p+pcDNA-NC組,miR-187-3p+pcDNA-FOXK1組圖8 Western印跡檢測(cè)FOXK1、Ki-67、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)

表6 FOXK1高表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)miR-187-3p高表達(dá)對(duì)破骨細(xì)胞增殖、凋亡、分化的影響

2.7NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá) 與NC組比較，miR-187-3p組p-p65、p-IкBα蛋白水平明顯降低(P<0.05)，pcDNA-FOXK1組p-p65、p-IкBα蛋白水平明顯升高(P<0.05)；與miR-187-3p+pcDNA-NC組比較，miR-187-3p+pcDNA-FOXK1組p-p65、p-IкBα蛋白水平升高(P<0.05)，見圖9、表7。

1～6:NC組,miR-NC組,miR-187-3p組,pcDNA-FOXK1組, miR-187-3p+pcDNA-NC組,miR-187-3p+pcDNA-FOXK1組圖9 Western印跡檢測(cè)p-p65、p-IкBα蛋白的表達(dá)

表7 各組NF-κB信號(hào)通路蛋白的表達(dá)

3 討 論

miRNA在OP中表達(dá)異常，并可能參與OP發(fā)生及發(fā)展過程，骨吸收性骨細(xì)胞、骨形成性成骨細(xì)胞與骨骼修復(fù)密切相關(guān)，破骨細(xì)胞分化過程與破骨細(xì)胞前體表達(dá)的NF-κB密切相關(guān)，既往研究顯示，miR-133a通過促進(jìn)破骨細(xì)胞分化參與絕經(jīng)后OP發(fā)生過程〔9〕。miR-29a通過調(diào)節(jié)PCAF介導(dǎo)的RANKL和CXCL12而抑制破骨細(xì)胞的形成并預(yù)防OP〔10〕。miR-483-5p通過促進(jìn)破骨細(xì)胞分化參與OP的發(fā)病過程〔11〕。

miR-187-3p過表達(dá)通過抑制IL-1β釋放而減輕缺血再灌注損傷〔12〕。LncRNA PVT1通過靶向miR-187-3p/AGO1軸促進(jìn)阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡〔13〕。研究表明Ki-67與細(xì)胞增殖有關(guān)，其水平升高表示細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)〔14〕。本研究結(jié)果提示，miR-187-3p過表達(dá)可抑制破骨細(xì)胞增殖。caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔15〕。本研究結(jié)果顯示，miR-187-3p過表達(dá)可促進(jìn)破骨細(xì)胞凋亡。Acp-5、MMP9、Cathepsin K、Integrinαv基因與破骨細(xì)胞分化密切相關(guān)，其表達(dá)水平升高表示細(xì)胞分化能力增強(qiáng)〔16,17〕。本研究結(jié)果提示，miR-187-3p過表達(dá)可抑制破骨細(xì)胞分化。

本研究證實(shí)FOXK1是miR-187-3p的靶基因，miR-187-3p可負(fù)向調(diào)控FOXK1的表達(dá)。研究表明miR-186-5p通過靶向FOXK1在人骨肉瘤中發(fā)揮抑癌作用〔18〕。甘草酸通過調(diào)節(jié)NF-κB、ERK和JNK信號(hào)通路抑制破骨細(xì)胞分化〔19〕。NF-κB信號(hào)通路被激活后可促進(jìn)破骨細(xì)胞形成〔20〕。本研究結(jié)果提示miR-187-3p過表達(dá)可能通過調(diào)控FOXK1/NF-κB信號(hào)通路而發(fā)揮作用。