多肽芯片技術(shù)在藥物篩選中的應(yīng)用研究

趙媛 賀倩 謝永臻 張為 梁柏堂

1 多肽芯片技術(shù)

多肽芯片即多肽陣列,是將已知的蛋白質(zhì)一級(jí)序列按序列漂移原則分解成重疊肽段,并將多肽片段作為分子探針固載至載體機(jī)制表面形成高密度陣列。多肽芯片包含了蛋白質(zhì)的全結(jié)構(gòu),保留了蛋白質(zhì)的部分功能,與蛋白質(zhì)相比具有更優(yōu)越的化學(xué)穩(wěn)定性［1］。隨著固相多肽合成(solid phase peptide synthesis,SPSS)技術(shù)快速發(fā)展,多肽芯片為蛋白質(zhì)組學(xué)提供了快速、易于操作、高通量的研究方法。

依據(jù)多肽芯片的用途可以將其分為功能型多肽芯片和分析型多肽芯片［2］。功能型多肽芯片多為探究蛋白分子與其他生物分析信息［3］,故對(duì)每一陣列點(diǎn)上肽段純度要求不高。對(duì)于短肽(<20 個(gè)氨基酸)而言,純度>80%即可應(yīng)用于功能性檢測(cè)［4］。在多種多肽原位合成(in situ synthesis)方法中,SPOT 斑點(diǎn)合成法運(yùn)用最為廣泛。該方法最先由Frank 等［5］提出,將已知蛋白的一級(jí)氨基酸序列按照序列漂移原則,將活化的氨基酸點(diǎn)印至在平面載體上逐步合成多肽陣列,具有試劑消耗量極少、肽段純化簡便無需結(jié)晶、固定化操作和可合成非天然肽段等優(yōu)點(diǎn)［6］。分析型多肽芯片直接將預(yù)先合成(off-chip synthesis)后的多肽片段固定至載體上,在低分析物濃度下提供足量的結(jié)合位點(diǎn),特異性結(jié)合目標(biāo)大分子后進(jìn)行定性或定量分析,是目前為止應(yīng)用最為廣泛的類型［2,4,7］。如Voss 等［8］利用多肽陣列芯片和基于乳膠顆粒凝集法系統(tǒng)性篩查新冠肺炎病毒抗體,發(fā)現(xiàn)用芯片法檢測(cè)血清更為敏感,可以利用多肽芯片技術(shù)同時(shí)檢測(cè)數(shù)百個(gè)突變體,以評(píng)估突變位點(diǎn)對(duì)抗體藥物反應(yīng)的影響。

2 多肽芯片的制備及檢測(cè)

多肽芯片技術(shù)包含4 個(gè)基本過程：陣列構(gòu)建、探針/樣品固載、理化檢驗(yàn)及結(jié)果分析。多肽微陣列芯片檢測(cè)流程見圖1。其中,將探針/樣品固載至載體上最為關(guān)鍵,直接影響芯片質(zhì)量。載體材料不僅對(duì)固載物即探針或樣品有強(qiáng)吸附能力,同時(shí)要保持其構(gòu)象和穩(wěn)定性,在檢測(cè)時(shí)具有高響應(yīng)、高靈敏度和低背景等優(yōu)點(diǎn)。目前,多肽芯片常用的載體主要包含玻片［9,10］、化學(xué)膜［7,11-13］(硝酸纖維素膜、尼龍膜、PVDF 膜等)、凝膠［14］和各種復(fù)合材料［15,16］等。凝膠作為多肽芯片載體可提供多孔親水環(huán)境,易于保持探針分子活性和穩(wěn)定性,但后續(xù)反應(yīng)液移除較為麻煩。復(fù)合材料作為多肽芯片載體具有良好的響應(yīng)值和靈敏度,但其高昂成本限制了商業(yè)化應(yīng)用。玻片具有價(jià)格低廉、背景信號(hào)低等優(yōu)點(diǎn),其表面經(jīng)過化學(xué)基團(tuán)活性修飾后具有更高的固載能力［17］,提高了陣列密度,實(shí)現(xiàn)高集成高通量,但其使用前需要經(jīng)過繁瑣的化學(xué)改性?；瘜W(xué)膜表面具有非特異性吸附易造成較高的背景,但其具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性、機(jī)械強(qiáng)度,后續(xù)封閉實(shí)驗(yàn)操作可有效降低其背景干擾、減少非特異性吸附,拓展其在多肽芯片甚至生物芯片領(lǐng)域應(yīng)用。Guo 等［11］采用斑點(diǎn)合成技術(shù)在載玻片上自制覆蓋嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)病毒全蛋白的多肽芯片,分別與急性患者、康復(fù)期患者血清反應(yīng),發(fā)現(xiàn)了被多種康復(fù)期血清識(shí)別的表位,這些表位對(duì)于開發(fā)相應(yīng)抗體藥物及疫苗具有重要作用。

圖1 多肽微陣列芯片檢測(cè)流程［2］

芯片點(diǎn)印可采用手動(dòng)式和機(jī)械式,機(jī)械式點(diǎn)印的精度、速度、樣點(diǎn)均一性等優(yōu)點(diǎn)更為突出。多肽芯片的點(diǎn)印方式可分為接觸式和非接觸式。接觸式點(diǎn)印法適合將大量不同的多肽或氨基酸溶液點(diǎn)印至一張芯片上；非接觸式點(diǎn)印法適合批量制備特征芯片［15］。由藥明激創(chuàng)(佛山)生物科技有限公司開發(fā)的自動(dòng)化多肽陣列合成儀,將所需制備的氨基酸序列(可包含非天然氨基酸)輸入軟件,按照客戶需求分解成肽段并在功能化纖維素膜上形成高密度肽陣列,現(xiàn)已成功制備了新冠病毒突變體奧密克戎S 蛋白多肽芯片,助力新冠病毒疫苗開發(fā)和藥物開發(fā)。

多肽芯片完成相應(yīng)的理化檢驗(yàn)后需檢測(cè)儀器記錄結(jié)果并分析。目前常用的多肽芯片檢測(cè)方法有直接檢測(cè)法和間接檢測(cè)法。常用的直接檢測(cè)法包括表面加強(qiáng)激光解析離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(surface enhance laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry,SELDI-TOF-MS)、表面等離子體共振檢測(cè)技術(shù)(surface plasmon resonance,SPR)等［18,19］,這些方法無需對(duì)靶標(biāo)分子進(jìn)行標(biāo)記即可檢測(cè)到芯片上探針分子與其相互作用,但對(duì)昂貴儀器的依賴度較高,應(yīng)用受到限制。間接檢測(cè)法是將示蹤物標(biāo)記于靶標(biāo)分子上,通過檢測(cè)標(biāo)記信號(hào)強(qiáng)弱來分析樣品信息。常用的間接檢測(cè)法包括放射性同位素示蹤法(isotopic tracer method)、化學(xué)發(fā)光法(luminesence)、熒光染料標(biāo)記法、親和素標(biāo)記法等［9,20-22］。同位素示蹤法容易給環(huán)境帶來放射性污染,化學(xué)發(fā)光法因操作簡便、檢測(cè)試劑低廉和檢測(cè)儀器易于使用優(yōu)點(diǎn)得到更為廣泛的應(yīng)用。

3 多肽芯片在藥物篩選中的應(yīng)用

多肽芯片是一種高通量、平行化的檢測(cè)手段,能夠在較短時(shí)間內(nèi)準(zhǔn)確且快速的獲取待測(cè)樣品信息,效率顯著優(yōu)于傳統(tǒng)方法。這些特點(diǎn)使其在藥物篩選中顯示出巨大的作用力［23］,不僅為藥物應(yīng)用提供理論依據(jù),還能為藥物設(shè)計(jì)和開發(fā)提供指導(dǎo),縮短藥物開發(fā)周期,加速藥物篩選［24-27］。

3.1 藥物開發(fā)篩選 藥物開發(fā)過程中篩選出有效的藥物并進(jìn)行驗(yàn)證是非常重要的環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的藥物開發(fā)需要從動(dòng)植物組織或微生物中提取分離出先導(dǎo)化合物,并進(jìn)行多步驟的人工修飾,既費(fèi)時(shí)又耗力。利用功能型多肽芯片和分析型多肽芯片對(duì)蛋白質(zhì)分子進(jìn)行體外研究,可快速獲取藥物作用靶點(diǎn)。Domenyuk 等［28］發(fā)現(xiàn)了一種新的篩選抗菌藥物的方法。他們將10000 個(gè)20 個(gè)氨基酸長度的肽段固定至聚合物表面形成高密度的多肽陣列,對(duì)多種細(xì)菌外部和細(xì)胞內(nèi)部分別用染料標(biāo)記,鑒定了具有目標(biāo)特異性結(jié)合的多肽或殺傷功能的多肽。具有結(jié)合功能但無殺傷功能的多肽會(huì)產(chǎn)生兩種熒光顏色,而具有結(jié)合功能及殺傷功能的多肽僅產(chǎn)生一種信號(hào)。研究小組將篩選出的肽段依據(jù)濃度梯度陣列固載,鑒定出了抑制革蘭陽性菌和革蘭陰性菌生長的多肽,其最低抑制濃度(MIC)為20 μM。該方法有顯著的優(yōu)點(diǎn)：首先芯片可同時(shí)篩選多種細(xì)菌,節(jié)省了驗(yàn)證時(shí)間；其次,該方法快速,在1 d 內(nèi)可完成細(xì)菌標(biāo)記、篩選和檢測(cè)分析。此外,采用固相合成法可將非天然氨基酸引入肽庫,能夠直接篩選對(duì)蛋白酶穩(wěn)定的肽。

3.2 藥物作用靶點(diǎn)篩選 藥物作用靶點(diǎn)是指藥物分子在生命體內(nèi)相互作用的結(jié)合位點(diǎn),包括基因位點(diǎn)、核酸大分子、受體、酶、小分子肽、離子通道等。

對(duì)于化學(xué)類藥物,一般通過查詢先導(dǎo)化合物并對(duì)其進(jìn)行修飾改性等達(dá)到藥物作用［29］。Meli 等［30］利用多肽陣列芯片聯(lián)合計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)尋找新藥,他們通過計(jì)算機(jī)模擬用于抑制癌癥生長的非肽小分子先導(dǎo)物結(jié)構(gòu)信息,找到了一種命名為shepherdin 的肽(肽段序列結(jié)構(gòu)GNNQQNY),其具有抗癌作用。以該肽短的結(jié)構(gòu)為母核進(jìn)行相應(yīng)的化學(xué)修飾,并將修飾后的肽段制備成多肽陣列,運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)測(cè)試其與底物三磷酸腺苷(ATP)、N-末端熱休克蛋白90(N-Hsp90)的反應(yīng)。通過濃度梯度研究發(fā)現(xiàn)多肽與Hsp90 的N 端結(jié)合具有特異性和飽和性。

對(duì)于生物藥如蛋白藥物和抗體藥物,單從結(jié)構(gòu)上是較難推斷藥物的靶點(diǎn),可以用多肽芯片查找可能的藥物靶點(diǎn)。Wang 等［31］及Li 等［32］設(shè)計(jì)和開發(fā)的SARS-CoV-2 病毒蛋白質(zhì)組多肽芯片,包含966 個(gè)多肽片段和純化的S 蛋白、N 蛋白和E 蛋白探針,每一肽段包含15 個(gè)氨基酸且相鄰肽段間有10 個(gè)氨基酸重疊。該多肽芯片具有高靈敏度(94 pg/ml)、重復(fù)性良好(r=0.99),僅需要1.5 h 就可實(shí)現(xiàn)新冠病毒感染者血清血漿中抗體檢測(cè),并可精確到抗體氨基酸表位。多肽陣列技術(shù)鑒定出抗體表位的氨基酸表位序列FRKSN,結(jié)構(gòu)分析了體結(jié)合到S-RBD-ACE2 復(fù)合體的表位位置并預(yù)測(cè)中和性抗體。他們?cè)诨颊哐逯惺状伟l(fā)現(xiàn)中和性抗體可能結(jié)合到靶標(biāo)刺突蛋白的線性表位(456-FRKSN-460),隨后該表位結(jié)構(gòu)在同行的研究者中得到證實(shí)［33］。這些鑒定出的表位結(jié)構(gòu),對(duì)于新冠病毒抗體藥物研發(fā)及疫苗研發(fā)、廣泛篩選現(xiàn)有的廣譜抗病毒藥物、臨床免疫動(dòng)態(tài)檢測(cè)和快速分析患者血清以指導(dǎo)用藥具有指導(dǎo)意義。Guo 等［11］在功能化纖維素膜上原位合成了覆蓋SARS 病毒全蛋白的多肽芯片,該芯片上包含4942 個(gè)多肽片段。將多肽芯片與患者血清反應(yīng),再與辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗人免疫球蛋白(Ig)G、IgM 或IgA 在37℃下孵育1 h,然后用ECL 化學(xué)發(fā)光試劑處理,通過鑒定陽性斑點(diǎn)氨基酸序列識(shí)別抗原表位。這些識(shí)別到的表位對(duì)于開發(fā)相應(yīng)抗體藥物及疫苗具有重要作用。

3.3 藥物活性篩選 藥物治療過程中,篩選出合適的藥物能降低藥物使用風(fēng)險(xiǎn),提高藥物使用者生活質(zhì)量［34］。利用多肽芯片,可以測(cè)定不同藥物在體內(nèi)藥效作用。蘇敏等［22］開發(fā)出了一種基于多肽微陣列芯片的熒光和共振光散射雙通路檢測(cè)方法來篩選凝血酶抑制劑。具體流程見圖2。用生物素標(biāo)記芯片上肽片段C 端,凝血酶將水解多肽上的特異性位點(diǎn)作用,用熒光探針和30 nm 金納米粒子探針捕獲水解反應(yīng)釋放的生物素。通過熒光和共振光散射信號(hào)強(qiáng)度的變化檢測(cè)抑制劑的抑制能力。該方法測(cè)定的3 種凝血酶抑制劑 ［阿加曲班、抗凝血酶Ⅲ和絲氨酸蛋白酶抑制劑(AEBSF)］在酶溶液中的半抑制劑濃度(IC50)測(cè)定值與文獻(xiàn)報(bào)道相符；在血漿樣本中測(cè)到的IC50值大小與酶溶液中相符；在加標(biāo)血清中測(cè)定IC50值有差別,但是抑制能力是一致的(阿加曲班>抗凝血酶Ⅲ>AEBSF)?？梢姸嚯男酒夹g(shù)對(duì)樣品測(cè)定具有高度特異性、穩(wěn)定性、結(jié)果可量化顯示,有助于判斷抑制劑的實(shí)際使用價(jià)值。

圖2 基于多肽微陣列芯片的熒光法和共振光散射法檢測(cè)凝血酶抑制劑

郭明日等［35］同時(shí)采用多肽微陣列、MGIT960 藥敏和羅氏比例法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌(MTB)耐藥性,選擇3 種方法檢測(cè)均為陽性的446 例患者標(biāo)本進(jìn)行異煙肼(INH)和利福平(RFP)藥敏測(cè)試,比較三者檢測(cè)結(jié)果的差異性。結(jié)果分別以MGIT960 藥敏結(jié)果和羅氏比例法為參照,微陣列芯片法檢測(cè)MTB 對(duì)INH 和RFP 耐藥性的靈敏度、特異度、Kappa 值接近,表明微陣列芯片法和另外兩種方法對(duì)INH 和RFP 耐藥性的檢測(cè)具有極好的一致性。而MGIT960 藥敏和羅氏比例法藥敏不一致的MTB 樣本采用微陣列芯片法檢測(cè),結(jié)果顯示,芯片法測(cè)定的INH 和RFP 耐藥性與MGIT960 藥敏一致和羅氏比例法測(cè)定也有差異,可能MTB 樣本存在異質(zhì)性耐藥。微陣列方法與經(jīng)典測(cè)定方法相比,測(cè)定INH 和RFP 耐藥性具有較高的一致性,且具有快速、精準(zhǔn)、較高的靈敏度和特異度。

3.4 中藥篩選 中藥及其復(fù)方具有多成分、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)協(xié)同作用等特性,憑借這些優(yōu)勢(shì)發(fā)揮不可替代的作用,同時(shí)也為中藥研究帶來困難。國內(nèi)已有人利用多肽芯片技術(shù)對(duì)中藥進(jìn)行研究。發(fā)明者［36］在纖維素膜上制備了能夠與從不同產(chǎn)地的人參中提取的人參總蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)的多肽陣列,用于鑒別人參產(chǎn)地。不同產(chǎn)地人參蛋白種類及含量不一樣,通過提取人參根部蛋白質(zhì)并進(jìn)行標(biāo)記,將其與多肽微陣列芯片反應(yīng),通過發(fā)光區(qū)域和發(fā)光斑點(diǎn)可判斷提取蛋白質(zhì)種類和含量,從而推斷其產(chǎn)地。發(fā)明者將多肽陣列芯片在再生后,重新測(cè)定樣本,其結(jié)果具有高度的一致性。玄毅等［37］利用SELDI 多肽芯片技術(shù)監(jiān)測(cè)注射魚腥草后不同天數(shù)狗血清中蛋白質(zhì),發(fā)現(xiàn)狗血清中3511Da 與3522Da、3960Da 與3975Da 四種蛋白含量隨中草藥魚腥草的注射天數(shù)有顯著變化。采用該芯片技術(shù)可快速監(jiān)測(cè)到血液中蛋白含量變化,這些蛋白值的變化對(duì)中草藥魚腥草作用靶點(diǎn)篩選和藥物不良反應(yīng)監(jiān)控有輔助意義。由此可見多肽芯片技術(shù)在復(fù)雜的中藥研究當(dāng)中表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)。

4 小結(jié)

多肽芯片技術(shù)所具有的樣品用量少、穩(wěn)定性好、靈敏度高、快速平行檢測(cè)、結(jié)果可量化顯示等優(yōu)點(diǎn),使其成為蛋白質(zhì)組學(xué)和藥物開發(fā)的有力工具。芯片上的多肽探針分子較多級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白分子,對(duì)溫度、濕度、pH 值、有機(jī)溶劑的耐受性更高,易于保存,且經(jīng)適當(dāng)處理可實(shí)現(xiàn)再生重復(fù)使用。隨著材料新技術(shù)的發(fā)展,可以在載體上制備更長更穩(wěn)定的肽段以展示更多肽段空間構(gòu)象,使其在藥物研究表現(xiàn)出巨大的作用力。