UPLC-MS/MS測定生乳與豆制飲品中咪唑煙酸殘留

高玉杰，張立佳，劉麗君，莫 楠，謝瑞龍，呂志勇，李翠枝

（內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110）

咪唑啉酮類除草劑作為一種高選擇性、高效的手性除草劑[1]，主要包含咪唑乙煙酸、甲咪唑煙酸、咪唑煙酸等，這些農(nóng)藥廣泛應(yīng)用于林地、農(nóng)作物及草場等[2-5]，造成了農(nóng)藥殘留[6-8]、環(huán)境污染[9-12]和生物毒性[13-17]等問題，帶來食品安全隱患問題。咪唑煙酸是咪唑啉酮類除草劑中發(fā)現(xiàn)最早的一個(gè)品種，其農(nóng)藥殘留通過污染土壤、水和空氣等直接或間接的在動(dòng)物和人類體內(nèi)累積并引發(fā)長時(shí)間微劑量的慢性中毒或通過皮膚接觸、呼吸吸入等途徑短時(shí)間內(nèi)引發(fā)急性中毒，在人體生理、自身免疫功能等方面造成傷害。我國是農(nóng)藥生產(chǎn)和消費(fèi)大國，而農(nóng)藥使用欠缺規(guī)范化操作，致使農(nóng)藥污染和殘留問題相對更加嚴(yán)重，因此，農(nóng)藥殘留狀況研究是持續(xù)的、必要的。國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763—2021《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[18]明確規(guī)定，生乳中咪唑煙酸最大殘留量為0.01 mg/kg，大豆中咪唑煙酸最大殘留量為5 mg/kg。生乳和大豆是乳與乳制品和豆制飲品的重要原料，但是迄今尚無專門針對生乳和大豆原漿豆奶等豆制飲品中咪唑煙酸檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法。隨著乳與乳制品和豆制飲品需求量日益增加，為防止咪唑煙酸的濫用，保證生乳和豆制飲品的品質(zhì)，亟需建立生乳和豆制飲品中咪唑煙酸的檢測方法。

當(dāng)前咪唑煙酸殘留的主要檢測方法有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（gas chromatography-mass spectrography，GC-MS）[19]、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[20-22]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）[23-26]。與檢測方法結(jié)合的前處理方法有衍生法、基質(zhì)分散法、凝膠色譜法和固相萃取法等，其中衍生法操作步驟復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)條件要求多；基質(zhì)分散法技術(shù)簡單、快捷，但無法充分凈化復(fù)雜基質(zhì)的樣品；凝膠色譜法對復(fù)雜基質(zhì)處理的效果比較好，但操作耗時(shí)長，消耗溶劑比較多；固相萃取法有操作步驟少、使用的有機(jī)試劑少，可以有效地降低基質(zhì)干擾等優(yōu)點(diǎn)，但是目前分析樣本主要是土壤、水體、藥材、果蔬和谷物等，對生乳和豆制飲品的檢測報(bào)道較少，沈雪等[27]采用高效液相法測定牛奶中咪唑煙酸含量和石家莊君樂寶乳業(yè)有限公司[28]檢測牛乳中農(nóng)藥殘留相關(guān)報(bào)道，但是這些方法存在靈敏度比較低，不能滿足國家規(guī)定的限量要求和適用范圍有限的問題。因此，建立一種生乳與豆制飲品中咪唑煙酸殘留的檢測方法對保障食品安全具有重要意義。

本研究考察不同前處理?xiàng)l件對生乳及豆制飲品中咪唑煙酸檢測效果的影響，旨在開發(fā)一種簡便、高效、準(zhǔn)確測定生乳和豆制飲品中咪唑煙酸的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

0.2 μm通用親水性聚丙烯（general hydrophilicity polypropylene，GHP）濾膜、PRIME HLB和HLB固相萃取柱：美國Waters公司；氨基固相萃取柱：美國安捷倫公司；生乳樣品（牛乳）：來自不同牧場；豆制飲品（大豆原漿豆奶）：市售。

1.1.2 試劑

咪唑煙酸標(biāo)品（純度≥98.0%）：德國Dr.Ehrenstorfe公司；氯化鈉（分析純）：天津市富宇商貿(mào)有限公司；乙腈、甲酸（均為色譜純）：美國Fisher公司；二氯甲烷（色譜級）：德國CNW科技公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TQ-D超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（配有電噴霧電離（electron spray ionization，ESI）源）：美國Waters公司；57250-U Visiprep固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）裝置：美國Sigma-Aldrich集團(tuán)公司；MS3 basic渦旋振蕩器：德國IKA公司；BIOFUGE STRATOS臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：美國Thermo Fisher公司；TurboVap氮吹儀：瑞典Biotage公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

提?。悍Q取生乳、豆制飲品試樣各2 g（精確到0.1 mg），分別加入乙腈10 mL，經(jīng)10 min的渦旋提取后，加0.5 g氯化鈉，渦旋混勻5 min，在低溫條件（0～4 ℃）下，15 000 r/min離心10 min，得到上清液。

凈化：采用3 mL乙腈活化HLB固相萃取柱后，將5 mL上清液轉(zhuǎn)移到固相萃取柱中，再加入3 mL乙腈對固相萃取柱進(jìn)行淋洗，收集全部流出液。設(shè)置氮吹儀的溫度為40 ℃，用氮?dú)猓∟2）吹至近干后，再采用乙腈定容至1.0 mL，經(jīng)過1 min渦旋溶解后，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，在低溫條件（0～4 ℃）下，20 000 r/min離心5 min后，上清液過0.22 μm濾膜，供UPLC-MS/MS測定。

在此基礎(chǔ)上，依次考察不同提取試劑（甲酸∶乙腈=1∶999（V/V）、甲酸：乙腈=5∶995（V/V）、甲酸∶乙腈=10∶990（V/V））和固相萃取柱（氨基柱、HLB和PRIME HLB）對生乳和豆制飲品中咪唑煙酸回收率的影響，最后考察不同定溶液（乙腈、50%乙腈水溶液和20%乙腈水溶液）對咪唑煙酸峰型的影響。

1.3.2 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

（1）超高效液相色譜條件

Waters C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱；A流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液，B流動(dòng)相為乙腈；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣體積為3 μL；梯度洗脫程序見表1。

表1 超高液相色譜的梯度洗脫程序Table1 Gradient elution procedure of ultra high performance liquid chromatography

（2）質(zhì)譜條件

電噴霧離子源正離子（ESI+）模式；離子源溫度120 ℃；毛細(xì)管電壓1.13 kV；脫溶劑溫度350 ℃；錐孔氣流量50 L/h；脫溶劑氣流量800 L/h；檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）；其他質(zhì)譜條件見表2。

表2 生乳與豆制飲品中咪唑煙酸測定的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Parameters of mass spectrometry for the determination of imazapyr in raw milk and soybean drinks

（3）定性定量方法

定性：根據(jù)保留時(shí)間（retention time，RT）和離子的相對豐度（relative abundance of ions）定性。

定量：采用外標(biāo)法定量。

1.3.3 基質(zhì)效應(yīng)分析

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：選擇5份無咪唑煙酸的樣品，采用最優(yōu)的前處理?xiàng)l件對樣品進(jìn)行提取、凈化后，制備空白基質(zhì)溶液。精密量取質(zhì)量濃度為100 ng/mL的咪唑煙酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液20 μL、50 μL、100 μL、200 μL、300 μL至不同的進(jìn)樣小瓶中，分別用空白基質(zhì)溶液稀釋，配制成質(zhì)量濃度依次為2 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L、30 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，采用UPLC-MS/MS測定，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密量取質(zhì)量濃度為100 ng/mL的咪唑煙酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液20 μL、50 μL、100 μL、200 μL、300 μL至不同的進(jìn)樣小瓶中，分別用體積分?jǐn)?shù)20%乙腈水溶液稀釋，配制成質(zhì)量濃度依次為2 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L、30 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，采用UPLC-MS/MS測定，以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)繪制溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線。

根據(jù)兩種標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）[29-30]，其計(jì)算公式如下：

1.3.4 檢出限和定量限

按照3倍信噪比（S/N）計(jì)算檢出限（limit of detection，LOD），10倍信噪比（S/N）計(jì)算定量限（limit of quantitation，LOQ）。

1.3.5 回收率及精密度試驗(yàn)

稱取無咪唑煙酸的生乳、豆制飲品試樣后，添加終質(zhì)量濃度分別為0.005 mg/kg、0.010 mg/kg、0.030 mg/kg的咪唑煙酸，渦旋混勻后，對樣品進(jìn)行提取和凈化，每個(gè)水平重復(fù)試驗(yàn)6次，采用UPLC-MS/MS測定咪唑煙酸含量，并計(jì)算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviations，RSD）。

1.3.6 實(shí)際樣品的測定

利用本研究建立的前處理方法和儀器方法對100批市售生乳和100批市售豆制飲品進(jìn)行檢測。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理及分析

使用賽默飛TraceFinder 4.1 General Quan軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行采集，采用Origin 8.0繪圖，采用Microsoft Excel 2016軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的選擇

2.1.1 提取試劑的選擇

根據(jù)GB/T 20769—2008《水果和蔬菜中450種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[31]采用乙腈作為提取試劑檢測生乳和豆制飲品中的咪唑煙酸時(shí)發(fā)現(xiàn)，咪唑煙酸的回收率均＜25%，說明目標(biāo)化合物不能被完全提取，因?yàn)檫溥驘熕釣閮尚曰衔铮谒嵝詶l件下，咪唑煙酸更穩(wěn)定且主要以分子狀態(tài)存在，有利于有機(jī)溶劑對其提取，因此，考慮在乙腈中添加甲酸后對其進(jìn)行提取，并分析比較提取試劑中不同甲酸含量對咪唑煙酸回收率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 不同的提取試劑對咪唑煙酸回收率的影響Fig.1 Effect of different extraction reagents on imazapyr recovery

由圖1可知，生乳和豆制飲品樣品經(jīng)甲酸∶乙腈=1∶999（V/V）提取后，咪唑煙酸的回收率在68%～71%之間；采用甲酸∶乙腈=5∶995（V/V）提取后，平均回收率在82%～88%之間；采用甲酸∶乙腈=10∶990（V/V）提取后，回收率在85%～90%之間，其與提取試劑甲酸∶乙腈=5∶995（V/V）相比，沒有明顯的提高。因此，選擇使用甲酸∶乙腈=5∶995（V/V）作為提取試劑，既能保證目標(biāo)化物基本上被完全提取，又可以節(jié)約酸的用量。

2.1.2 固相萃取柱的選擇

分析對比氨基柱、HLB和PRIME HLB 3種不同固相萃取柱對咪唑煙酸回收率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 不同固相萃取柱對咪唑煙酸回收率的影響Fig.2 Effect of different solid phase extraction columns on imazapyr recovery

由圖2可知，生乳和豆制飲品樣品經(jīng)過氨基柱凈化后，部分目標(biāo)峰被吸附，回收率＜30%；當(dāng)使用HLB、PRIME HLB柱凈化時(shí)，目標(biāo)化合物基本被完全淋洗下來，回收率均可達(dá)78%～90%，滿足實(shí)驗(yàn)要求，但是PRIME HLB柱是一款新型產(chǎn)品，價(jià)格相對比較貴。因此，該方法選擇通用型的HLB固相萃取柱進(jìn)行凈化。

2.1.3 定容液的選擇

定容液中有機(jī)相比例高時(shí)能更有效的將咪唑煙酸溶解，但是高比例的有機(jī)相在液相分離易造成嚴(yán)重的溶劑效應(yīng)，因此，考察乙腈、50%乙腈水溶液和20%乙腈水溶液3種定容液對咪唑煙酸峰型的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，當(dāng)使用乙腈定容時(shí)，咪唑煙酸的色譜峰比較寬且有前延現(xiàn)象；當(dāng)使用50%乙腈水溶液定容時(shí)，色譜峰的峰寬和前延現(xiàn)象有明顯的改善；當(dāng)使用20%乙腈水溶液定容時(shí)，色譜峰的峰寬和峰型都良好。因此，選擇20%乙腈作為定容液。

圖3 不同定容液對咪唑煙酸峰型的影響Fig.3 Effect of different constant volume solutions on peak type of imazapyr

2.2 基質(zhì)效應(yīng)

在質(zhì)譜檢測中需要考察基質(zhì)效應(yīng)，因?yàn)榛|(zhì)效應(yīng)會(huì)對分析方法的準(zhǔn)確度、靈敏度、重復(fù)性等產(chǎn)生影響，表現(xiàn)為基質(zhì)抑制或增強(qiáng)效應(yīng)[32]。ME＞100%稱為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，ME＜100%稱為基質(zhì)抑制效應(yīng)，ME在80%～120%稱為弱基質(zhì)效應(yīng)，受基質(zhì)效應(yīng)影響不顯著；ME在70%～80%和120%～130%之間稱為較強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)，受基質(zhì)效應(yīng)影響較顯著；ME在以上范圍之外稱為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)，受基質(zhì)效應(yīng)影響強(qiáng)顯著[33]。通過基質(zhì)效應(yīng)公式計(jì)算得到，豆制飲品的ME為85%，生乳的ME為90%。結(jié)果表明，豆制飲品和生乳的ME均在80%～120%之間，為弱基質(zhì)效應(yīng)，受基質(zhì)效應(yīng)影響不顯著。因此，可以采用20%乙腈水溶液配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行外標(biāo)法定量。

2.3 方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

使用20%乙腈水溶液配制質(zhì)量濃度在2.0～30.0 μg/L的咪唑煙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=314.344x+17.143 3，R2=0.999 5，說明在2.0～30.0 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。生乳和豆制飲品中咪唑煙酸的LOD均為0.002 mg/kg，LOQ均為0.005 mg/kg，可以滿足分析的需要。

2.4 方法的回收率和精密度

在無咪唑煙酸的生乳和豆制飲品樣品中分別添加0.005 mg/kg、0.010 mg/kg和0.030 mg/kg的咪唑煙酸，進(jìn)行3個(gè)質(zhì)量濃度水平的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，各個(gè)水平進(jìn)行6個(gè)平行，計(jì)算每個(gè)質(zhì)量濃度水平的平均回收率和RSD，結(jié)果見表3。由表3可知，平均回收率在80.77%～90.35%之間，精密度試驗(yàn)結(jié)果的RSD在1.43%～5.27%之間，回收率及精密度均滿足GB/T 27417—2017《合格評定化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》[34]相關(guān)要求，表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度、精密度。

表3 方法的加標(biāo)回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Recovery and precision tests results of the method

2.5 實(shí)際樣品的測定

利用本研究建立的前處理方法和儀器方法對100批市售生乳和100批市售豆制飲品進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，咪唑煙酸均未檢出。雖然當(dāng)前抽檢的樣品均沒有檢出，但是介于目前農(nóng)藥濫用的現(xiàn)狀，會(huì)持續(xù)對該項(xiàng)目進(jìn)行監(jiān)督檢測，以降低食品安全風(fēng)險(xiǎn)。

3 結(jié)論

本研究建立UPLC-MS/MS法測定生乳和豆制飲品中咪唑煙酸殘留，以甲酸∶乙腈=5∶995（V/V）溶液為提取試劑，采用通用型的HLB固相萃取柱凈化，20%乙腈溶液定容，UPLC-MS/MS檢測，外標(biāo)法定量。該方法條件下，生乳和豆制飲品中咪唑煙酸的檢出限均為0.002 mg/kg，定量限均為0.005 mg/kg，在2.0～30.0 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)R2＞0.99，線性關(guān)系良好，在0.005 mg/kg、0.010 mg/kg、0.030 mg/kg 3個(gè)質(zhì)量濃度水平下的回收率為80.77%～90.35%，精密度試驗(yàn)結(jié)果的RSD為1.43%～5.27%，說明該方法簡便、準(zhǔn)確、精密度好、靈敏度高和推廣應(yīng)用性強(qiáng)，適用于生乳和豆制飲品中咪唑煙酸的日常檢測。