高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定天龍泉-陶藏酒中12種活性成分

張 龍，郝俊光，楊金海，萬(wàn)瑞杰，梁振榮，葉靜萱，黎 婷，梁婷鈺

（1.北部灣大學(xué) 食品工程學(xué)院 欽州市食品風(fēng)味分析與調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 欽州 535011；2.廣西天龍泉酒業(yè)有限公司，廣西河池 546400；3.北部灣大學(xué) 食品工程學(xué)院 廣西高校北部灣海產(chǎn)品高值化利用與預(yù)制食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 欽州 535011；4.羅城仫佬族自治縣科技情報(bào)研究所，廣西 河池 546400）

隨著消費(fèi)者健康意識(shí)的提高，飲酒觀念發(fā)生了轉(zhuǎn)變，傳統(tǒng)白酒的轉(zhuǎn)型迫在眉睫，營(yíng)養(yǎng)型白酒在市場(chǎng)上開(kāi)始興起[1-2]。營(yíng)養(yǎng)型白酒是在傳統(tǒng)白酒中適量添加了富含活性成分的草本藥材提取物，酒體微黃，使消費(fèi)者在享受傳統(tǒng)白酒的同時(shí)又能攝入健康因子[3-4]。市售保健酒草藥味濃烈，使消費(fèi)者感官體驗(yàn)不佳；而營(yíng)養(yǎng)型白酒卻與之不同，其風(fēng)味接近于傳統(tǒng)白酒，因此深受消費(fèi)者喜愛(ài)，如勁酒集團(tuán)的毛鋪苦蕎酒[14-16]。天龍泉-陶藏酒，是以米香型白酒為基酒，輔以添加廣西富產(chǎn)的葛根、羅漢果、苦蕎麥提取物的一款新產(chǎn)品，一上市就受到消費(fèi)者的追捧。

葛根是傳統(tǒng)的藥食同源植物，含有葛根素、大豆苷等活性成分[5]；苦蕎麥和羅漢果具有較高藥用價(jià)值，含有蘆丁、槲皮素、表兒茶素、羅漢果苷IV、羅漢果苷V等活性成分[6-8]。不同的活性成分在人體內(nèi)發(fā)揮不同的保健功效，如大豆苷能抗氧化、抗癌等[9]；葛根素能降低血糖血脂等[10]，蘆丁具有抗癌、抗炎等功效[11]；兒茶素、表兒茶素能清除自由基等[12]，羅漢果苷V具有保肝、抗癌等作用[13]。目前常見(jiàn)測(cè)定活性成分的方法有光譜法[17]，高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[18]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法[19]等。光學(xué)分析法常用于測(cè)定總酚含量，無(wú)法檢測(cè)單一組分含量；超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法靈敏度高但儀器昂貴、運(yùn)行維護(hù)成本高；高效液相色譜法測(cè)定活性成分在國(guó)內(nèi)外應(yīng)用較為廣泛，在單獨(dú)檢測(cè)葛根、苦蕎麥、羅漢果的組成方面已有報(bào)道，如AMAKURA Y等[20]借助HPLC準(zhǔn)確測(cè)羅漢果提取物羅漢果苷V的含量，QU L M等[21]利用HPLC測(cè)定葛根中的葛根素等六種異黃酮，MANSUR A R等[22]通過(guò)HPLC測(cè)定苦蕎麥中的黃酮類物質(zhì)。高效液相色譜法能同時(shí)測(cè)定多種單體活性成分含量，具有操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，適用于工廠自行檢測(cè)，但目前尚無(wú)同時(shí)檢測(cè)天龍泉-陶藏酒中葛根、苦蕎麥、羅漢果提取物活性成分的方法。

本研究通過(guò)對(duì)天龍泉-陶藏酒中12種活性成分的HPLC檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了HPLC同時(shí)測(cè)定天龍泉-陶藏酒中12種活性成分的檢測(cè)方法，并將其應(yīng)用于天龍泉-陶藏酒樣品的檢測(cè)，以期為天龍泉-陶藏酒功能成分提供有效的檢測(cè)手段，為天龍泉-陶藏酒的品質(zhì)控制提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

天龍泉-陶藏酒3A酒樣（酒精度為30%vol，添加了葛根、苦蕎麥提取物）、天龍泉-陶藏酒4A酒樣（酒精度為33%vol，添加了苦蕎麥提取物）、天龍泉-陶藏酒5A酒樣（酒精度為42%vol，添加了羅漢果、葛根提取物）：廣西天龍泉酒業(yè)有限公司。

1.1.2 試劑

乙腈、甲醇、乙醇（均為色譜純）：上海麥克林生化科技公司；槲皮素、大豆苷、山奈酚、蘆丁、葛根素、異槲皮苷、兒茶素、表兒茶素、槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、羅漢果苷IV、羅漢果苷V標(biāo)準(zhǔn)品（純度均＞98%）：四川維克奇生物科技有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Alliance 高效液相色譜儀（配備2695分離單元、2996光電二極管陣列（photo-diode array，PDA）檢測(cè)器、Empower工作站）：美國(guó)Waters儀器公司；ME204E電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DK-98-II恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；Waters-AtlantisT3色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、SLGP 033RB針頭濾膜（0.22 μm）：美國(guó)Millipore公司；XW-80A旋渦混合器：常州萬(wàn)科儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制：稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶，用熱乙醇（45 ℃）溶解蘆丁、槲皮素、山奈酚后定容，得到質(zhì)量濃度為100 mg/L單標(biāo)溶液；用體積分?jǐn)?shù)為80%甲醇溶解葛根素、大豆苷、兒茶素、表兒茶素、異槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮苷、羅漢果苷IV、羅漢果苷V后定容，得到質(zhì)量濃度為100 mg/L單標(biāo)溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：適量稱取各物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶解后得到質(zhì)量濃度范圍為8 000～17 000 mg/L的單標(biāo)母液，再吸取適量母液，置于10 mL容量瓶中用甲醇定容混勻，制得質(zhì)量濃度為1 200 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。吸取0.064 mL混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液置于10 mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為80%甲醇定容，得到質(zhì)量濃度為7.68 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液用于色譜條件的優(yōu)化。

1.3.2 高效液相色譜條件

根據(jù)保留時(shí)間進(jìn)行定性，采用外標(biāo)法進(jìn)行定量。

1.3.3 高效液相色譜條件優(yōu)化

（1）波長(zhǎng)的確定

對(duì)各活性成分進(jìn)行二級(jí)管陣列掃描（190～400 nm），得到各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的光譜圖，確定測(cè)定波長(zhǎng)，于選定檢測(cè)波長(zhǎng)分離優(yōu)化混合標(biāo)樣，以達(dá)到最佳效果。

（2）洗脫梯度的確定

本試驗(yàn)共進(jìn)行了30余次梯度優(yōu)化，僅選擇4個(gè)有代表性的梯度說(shuō)明優(yōu)化效果，具體洗脫梯度見(jiàn)表1。選取各目標(biāo)物完全分離、檢測(cè)周期短的洗脫梯度作為最優(yōu)色譜條件。通過(guò)改變洗脫條件，實(shí)現(xiàn)不同活性物質(zhì)的有效分離，達(dá)到兩種相鄰的目標(biāo)活性物質(zhì)分離度≥1.5，分離度的計(jì)算公式見(jiàn)式（1）[23]。

表1 洗脫梯度的優(yōu)化Table 1 Optimization of eluent gradients

續(xù)表

式中：tR1為相鄰色譜峰前-峰的保留時(shí)間；tR2為相鄰色譜峰后-峰的保留時(shí)間；Y1、Y2為相鄰兩色譜峰的峰寬。

1.3.4 方法學(xué)考察

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

適量吸取1.3.1單標(biāo)母液置于10 mL容量瓶中配制得到含2 500 mg/L的葛根素、大豆苷、槲皮苷、槲皮素、山奈酚，5 000 mg/L山奈酚-3-O-蕓香糖苷、羅漢果苷V、羅漢果苷IV、表兒茶素、兒茶素，3 750 mg/L蘆丁、異槲皮苷的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，分別吸取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.008 mL、0.001 6 mL、0.032 mL、0.064 mL、0.128 mL、0.256 mL置于10 mL容量瓶中用80%甲醇定容，得到6個(gè)質(zhì)量濃度梯度的混合標(biāo)樣，見(jiàn)表2，于優(yōu)化色譜條件下按質(zhì)量濃度由低到高的順序上機(jī)檢測(cè)。以混合標(biāo)樣各組分的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)峰面積（y）為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表2 混合標(biāo)樣質(zhì)量濃度梯度Table 2 Mass concentration gradient of mixed standard solution mg/L

（2）檢出限和定量限

將混合標(biāo)樣梯度1逐步稀釋檢測(cè)，把信噪比（signalnoise ratio，S/N）分別為3和10所對(duì)應(yīng)分析物的質(zhì)量濃度作為方法的檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantification，LOQ）。

（3）精密度試驗(yàn)

精確吸取天龍泉-陶藏酒3A樣品0.5 mL，加入混合標(biāo)樣梯度三，均勻混合后過(guò)0.22 μm針頭濾膜，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算12種活性成分各自的質(zhì)量濃度及其對(duì)應(yīng)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），確定方法的精密度。

（4）加標(biāo)回收率試驗(yàn)

精確吸取3份天龍泉-陶藏酒3A樣品0.5 mL，分別加入質(zhì)量濃度為2 mg/L、4 mg/L、6 mg/L 的混合標(biāo)樣0.5 mL，均勻混合過(guò)0.22 μm針頭濾膜后進(jìn)樣，每個(gè)濃度3個(gè)平行，計(jì)算加標(biāo)回收率，確定方法的準(zhǔn)確度。加標(biāo)回收率計(jì)算公式如式（2）：

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2016軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，樣品數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜條件的確定

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

本試驗(yàn)采用PDA檢測(cè)器對(duì)混合標(biāo)樣梯度三進(jìn)行紫外二極管陣列掃描，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 12種活性成分混合標(biāo)樣于全波長(zhǎng)（190～400 nm）處的HPLC光電二極管陣列光譜圖Fig.1 HPLC photodiode array spectrograms of 12 active components mixed standard solution at full-wavelength (190-400 nm)

由圖1可知，表兒茶素、大豆苷、兒茶素、葛根素、羅漢果苷IV、羅漢果苷V、山奈酚、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、異槲皮苷、槲皮素、蘆丁及槲皮苷對(duì)應(yīng)的最大吸收波長(zhǎng)分別為203 nm、192 nm、207 nm、194 nm、192 nm、190 nm、192 nm、266 nm、204 nm、255 nm、204 nm及204 nm。為簡(jiǎn)化定量過(guò)程，在保證各組分檢測(cè)靈敏的前提下，因12種活性成分在波長(zhǎng)203 nm處均有吸收，故選擇定性檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm。

2.1.2 洗脫梯度的確定

對(duì)混合標(biāo)樣進(jìn)行四個(gè)典型梯度的洗脫，其洗脫效果見(jiàn)圖2。

圖2 12種活性成分混合標(biāo)樣于波長(zhǎng)203 nm處的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of 12 active components mixed standard solution at 203 nm

由圖2A可知，采用梯度一進(jìn)行洗脫，各標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間過(guò)于集中，表兒茶素（峰2）與兒茶素（峰3）未見(jiàn)分離，與HPLC測(cè)定葡萄酒中表兒茶素、兒茶素等9種酚類物質(zhì)的結(jié)果相同[24]，且該洗脫條件下異槲皮苷（峰6）與山奈酚-3-O-蕓香糖苷（峰7）未完全分離；由圖2B可知，采用梯度二洗脫，異槲皮苷（峰6）與山奈酚-3-O-蕓香糖苷（峰7）已分離，分離度為1.54，但其他物質(zhì)分離效果不理想，且蘆?。ǚ?）前存在雜峰（峰a）；由圖2C可知，采用梯度三洗脫，表兒茶素（峰2）、兒茶素（峰3）分離效果仍不理想，分離度僅為1.23，基于洗脫梯度二條件下調(diào)整后發(fā)現(xiàn)蘆丁（峰5）與雜質(zhì)（峰a）融合；經(jīng)多次調(diào)整洗脫梯度，表兒茶素、兒茶素達(dá)不到有效分離，且測(cè)定目標(biāo)活性成分蘆丁與雜質(zhì)峰融合，因此需進(jìn)一步優(yōu)化洗脫梯度，參考測(cè)定華佗延壽酒中表兒茶素、兒茶素素等成分的洗脫條件[25]，對(duì)試驗(yàn)洗脫梯度進(jìn)行調(diào)整，由圖2D可知，采用梯度四洗脫，表兒茶素（峰2）、兒茶素（峰3）分離度達(dá)到1.56，同時(shí)該梯度條件下，蘆?。ǚ?）與雜質(zhì)峰完全分離。通過(guò)對(duì)測(cè)定梯度的優(yōu)化，采用洗脫梯度四洗脫，各活性成分峰形好、12種測(cè)定的目標(biāo)成分分離度高，滿足分析要求，最終確定梯度四為最優(yōu)洗脫梯度，用于后續(xù)的定性定量分析。

2.2 12種活性成分的定性和定量

在上述優(yōu)化條件的基礎(chǔ)上，于203 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)混合標(biāo)準(zhǔn)樣品，其HPLC色譜圖見(jiàn)圖3，保留時(shí)間見(jiàn)表3。

圖3 12種活性成分混合標(biāo)樣在203 nm檢測(cè)波長(zhǎng)條件下HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of 12 active components mixed standard under detected wavelength 203 nm condition

由圖3可知，在優(yōu)化后色譜條件下，各活性成分峰形好、各相鄰的成分完全分離，即分離度均＞1.5[23]。

2.3 方法學(xué)考察

優(yōu)化色譜條件下測(cè)定混合標(biāo)樣，以每種物質(zhì)最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定得到的色譜峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，建立12種活性成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得12種活性成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。確定保留時(shí)間、線性回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，各活性成分呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2為0.993～0.999，方法檢出限為0.018～0.210 mg/L，定量限為0.062～0.701 mg/L。

表3 12種活性成分的保留時(shí)間、線性回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限Table 3 Retention time,linear regression equation,linear range,correlation coefficient,detection limit and quantification limit of 12 active components

方法精密度試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，精密度試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.11%～4.28%，說(shuō)明該方法的精密度較高。

表4 精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of precision tests

方法加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，平均加標(biāo)回收率為89.6%～118.1%，回收率試驗(yàn)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.00%～4.53%，表明該方法準(zhǔn)確度良好，能滿足分析要求。

表5 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of standard recovery rate tests

2.4 天龍泉-陶藏酒樣品中12種活性成分的檢測(cè)結(jié)果

采用上述優(yōu)化色譜條件檢測(cè)天龍泉-陶藏酒3款產(chǎn)品中12種活性成分，結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可知，天龍泉-陶藏酒3A、4A蘆丁含量較高，其對(duì)應(yīng)的含量測(cè)定值均＞30 mg/L，陶藏酒5A中含有較多的葛根素，測(cè)定值≥14 mg/L，且陶藏酒5A中特有的兩種活性成分羅漢果苷IV、羅漢果苷V的含量分別約為4 mg/L、5 mg/L。實(shí)際測(cè)得的成分與產(chǎn)品生產(chǎn)中所添加的提取物情況相符，因此該方法適用于測(cè)定天龍泉-陶藏酒。

表6 天龍泉-陶藏酒樣品測(cè)定結(jié)果Table 6 Determination results of Tianlongquan Taocang Baijiu sample

3 結(jié)論

本研究建立了同時(shí)測(cè)定天龍泉-陶藏酒中12種活性成分的高效液相色譜方法，通過(guò)對(duì)試驗(yàn)條件的優(yōu)化，采用Waters AtlantisT3色譜柱（4.6 mm×25 mm，5 μm），流動(dòng)相：乙腈-水溶液，梯度洗脫，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量5 μL，柱溫32 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm，保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量。在此優(yōu)化檢測(cè)條件下，其精密度試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.11%～4.28%，平均加標(biāo)回收率為89.6%～119.7%，方法的檢出限為0.018～0.210 mg/L，定量限為0.062～0.701 mg/L。該方法線性良好、檢出限低、精密度和準(zhǔn)確度良好，操作簡(jiǎn)單，能滿足對(duì)天龍泉-陶藏酒12種活性成分含量的日常監(jiān)控。