響應(yīng)面法優(yōu)化粘質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)靈菌紅素發(fā)酵工藝

何鎮(zhèn)權(quán)，李 靜，鄧毛程，張遠平，王 瑤，楊 姬，蘇佳豪，漆祖粵，鐘海婷

（廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品與生物技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510300）

靈菌紅素是一種來源于微生物的次級代謝產(chǎn)物，是具有三個吡咯環(huán)為骨架結(jié)構(gòu)的紅色素[1]，靈菌紅素具有抗菌、抗瘧、抗腫瘤等作用，可誘導(dǎo)T、B淋巴細胞凋亡，引起了醫(yī)學(xué)、制藥和不同行業(yè)研究人員的興趣[2-3]，已從多個角度對靈菌紅素及其合成菌的特性進行深入研究，如對病原微生物的抑菌活性、合成菌的細胞運動、產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄合成調(diào)控等[4-5]，尤其在誘導(dǎo)癌細胞凋亡方面具有特殊作用機制，被認為是一種具有巨大開發(fā)潛力的抗癌藥物[6-7]。

靈菌紅素最早發(fā)現(xiàn)由粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）產(chǎn)生，近年來也有產(chǎn)自鏈霉菌屬（Streptomyces）、弧菌屬（Vibrio）、惡臭單胞菌（Pseudomonas putida）的報道，至今人們普遍利用粘質(zhì)沙雷氏菌進行靈菌紅素生物合成的研究[8-10]。劉思航等[11]通過正交試驗法優(yōu)化粘質(zhì)沙雷氏菌的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件，使靈菌紅素產(chǎn)量提高了2.845倍；洪偉等[12]通過響應(yīng)面法對粘質(zhì)沙雷氏菌發(fā)酵的甘油添加量、胰蛋白胨、搖床轉(zhuǎn)速等因素進行優(yōu)化，使靈菌紅素產(chǎn)量較初始狀態(tài)提高了24倍。靈菌紅素是微生物的次級代謝產(chǎn)物[6]，培養(yǎng)基的磷酸鹽用量往往會影響次級代謝產(chǎn)物的生物合成。本研究在靈菌紅素高產(chǎn)菌種篩選的前期研究基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法對培養(yǎng)基磷酸鹽用量、溶氧量、發(fā)酵時間等因素進行優(yōu)化，期望能夠提高粘質(zhì)沙雷氏菌的靈菌紅素發(fā)酵水平，為相關(guān)研究及生產(chǎn)實踐提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與試劑

粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）PG12：現(xiàn)保藏于廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院微生物實驗室；大豆油：中糧福臨門食品營銷有限公司；靈菌紅素標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%）：上海源葉生物科技有限公司；K2HPO4、MgSO4·7H2O（均為分析純）：天津永大化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨、酵母膏（均為生化試劑）：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：葡萄糖32 g/L，蛋白胨12 g/L，酵母膏8 g/L，K2HPO430 mmol/L，MgSO4·7H2O 0.45 g/L，調(diào)節(jié)pH值為7.0，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：大豆油30 g/L，蛋白胨12 g/L，K2HPO420～45 mmol/L，MgSO4·7H2O 0.45 g/L，調(diào)節(jié)pH值為7.5，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

ZHWY-C2112F雙層恒溫搖床：上海智城分析儀器制造有限公司；GJS-30D型全自動發(fā)酵罐：江蘇省鎮(zhèn)江貝利生物工程有限公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；TL-1000CT型超聲波細胞破碎儀：江蘇恒敏儀器制造有限公司；H1850R型高速離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；U-T6型紫外可見分光光度計：屹譜儀器制造（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 粘質(zhì)沙雷氏菌活化及種子液制備

將粘質(zhì)沙雷氏菌PG12的斜面菌種接入200 mL種子培養(yǎng)基，于26 ℃、200 r/min的振蕩生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h。將200 mL種子培養(yǎng)液接入20 L發(fā)酵培養(yǎng)基，按單因素試驗和響應(yīng)面試驗的方案進行發(fā)酵。

1.3.2 菌株產(chǎn)靈菌紅素發(fā)酵工藝條件優(yōu)化單因素試驗

（1）K2HPO4濃度對靈菌紅素產(chǎn)量影響

將發(fā)酵培養(yǎng)基中K2HPO4濃度分別調(diào)節(jié)為20 mmol/L、25 mmol/L、30 mmol/L、35 mmol/L、40 mmol/L、45 mmol/L，在發(fā)酵溫度26 ℃、pH7.5、溶氧量60%的條件下發(fā)酵36 h，檢測靈菌紅素產(chǎn)量。

（2）溶氧量對靈菌紅素產(chǎn)量影響

將發(fā)酵培養(yǎng)基中K2HPO4濃度調(diào)節(jié)為30 mmol/L，控制發(fā)酵溫度26 ℃和pH7.5，分別控制溶氧量為15%、30%、45%、60%、75%，發(fā)酵36 h，檢測靈菌紅素產(chǎn)量。

（3）發(fā)酵時間對靈菌紅素產(chǎn)量影響

將發(fā)酵培養(yǎng)基中K2HPO4濃度調(diào)節(jié)為30 mmol/L，控制發(fā)酵溫度26 ℃、pH7.5、溶氧量60%，分別發(fā)酵18 h、24 h、30 h、36 h，檢測靈菌紅素產(chǎn)量。

1.3.3 發(fā)酵工藝條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗

在上述單因素試驗基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理[13-14]，選擇K2HPO4濃度（X1）、溶氧量（X2）、發(fā)酵時間（X3）為自變量，以靈菌紅素產(chǎn)量（y）為響應(yīng)值，通過3因素3水平的響應(yīng)面分析設(shè)計，對粘質(zhì)沙雷氏菌PG12發(fā)酵產(chǎn)靈菌紅素條件進行優(yōu)化，試驗因素水平設(shè)計見表1。

表1 菌株P(guān)G12產(chǎn)靈菌紅素發(fā)酵工藝條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for fermentation process conditions optimization for prodigiosin production by strain PG12

1.3.4 靈菌紅素含量測定

配制一系列濃度的靈菌紅素標(biāo)準(zhǔn)溶液，在波長535 nm處測定吸光度值[15]，建立靈菌紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程（y=0.195 6x+0.005 3，R2=0.998 6）。參照文獻所述的靈菌紅素提取方法，取100 mL發(fā)酵液，利用超聲波細胞破碎儀在功率150 W條件下進行超聲波破碎處理15 min，在50 ℃下減壓蒸發(fā)去除水分，加入適量的、pH 3.0的甲醇，使色素溶解，經(jīng)離心分離（15 000 r/min，20 min），獲得上清液，放入100 mL容量瓶，用pH 3.0的甲醇定容[16]。將色素溶液進行適當(dāng)稀釋，在535 nm波長處測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算靈菌紅素含量。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Excel 2019和Design Expert 8.0響應(yīng)面軟件進行統(tǒng)計分析及差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 K2HPO4濃度對發(fā)酵產(chǎn)靈菌紅素的影響

K2HPO4濃度對粘質(zhì)沙雷氏菌PG12生物合成靈菌紅素的影響如圖1所示，當(dāng)K2HPO4濃度為20～30 mmol/L時，靈菌紅素產(chǎn)量隨K2HPO4濃度增大而顯著增大；當(dāng)K2HPO4濃度＞30 mmol/L時，靈菌紅素產(chǎn)量反而下降。在菌體生長階段，在一定濃度范圍內(nèi)適當(dāng)提高磷酸鹽濃度，可促進菌體生長，但隨著磷酸鹽被消耗，在次級代謝產(chǎn)物合成階段的磷酸鹽濃度通常要求不高于10 mmol/L[17-19]，否則會抑制次級代謝產(chǎn)物的合成。因此，根據(jù)接種量、發(fā)酵周期等具體情況，兼顧菌體生長和次級代謝對磷酸鹽的需求，在高于10 mmol/L的范圍內(nèi)選擇合適的磷酸鹽濃度。在本試驗條件下，靈菌紅素產(chǎn)量在K2HPO4濃度為30 mmol/L時達到峰值1 446.4 mg/L。故選擇最適K2HPO4濃度為30 mmol/L。

圖1 K2HPO4濃度對菌株P(guān)G12產(chǎn)靈菌紅素的影響Fig.1 Effect of K2HPO4 concentration on prodigiosin production by strain PG12

2.1.2 溶氧量對發(fā)酵產(chǎn)靈菌紅素的影響

溶氧量對粘質(zhì)沙雷氏菌PG12生物合成靈菌紅素的影響如圖2所示，溶氧量為15%～45%時，靈菌紅素產(chǎn)量隨溶氧量增大而增大；當(dāng)溶氧量＞45%時，繼續(xù)增大溶氧量，靈菌紅素產(chǎn)量呈下降趨勢。文獻研究表明，靈菌紅素發(fā)酵液保持較高溶氧量水平可促進粘質(zhì)沙雷氏菌生長和靈菌紅素合成[20]，發(fā)酵后期的耗氧量比發(fā)酵前期的耗氧量要小[21]。在本試驗條件下，靈菌紅素產(chǎn)量在溶氧量為45%時，達到峰值1549.1mg/L。故選擇最適溶氧量為45%。

圖2 溶氧量對菌株P(guān)G12產(chǎn)靈菌紅素的影響Fig.2 Effect of dissolved oxygen on prodigiosin production by strain PG12

2.1.3 發(fā)酵時間對發(fā)酵產(chǎn)靈菌紅素的影響

發(fā)酵時間對粘質(zhì)沙雷氏菌PG12生物合成靈菌紅素的影響如圖3所示，在發(fā)酵時間18～30 h范圍內(nèi)，靈菌紅素產(chǎn)量隨發(fā)酵時間延長而增大；當(dāng)發(fā)酵時間超過30 h，繼續(xù)延長發(fā)酵時間，靈菌紅素產(chǎn)量呈下降趨勢。次級代謝產(chǎn)物的大量合成時間是在菌體停止生長之后，接種量、磷酸鹽濃度等因素的大小往往導(dǎo)致最佳的發(fā)酵時間不同[16，22-24]。在本試驗條件下，靈菌紅素產(chǎn)量在發(fā)酵時間為30 h達到峰值1 577.6 mg/L。故選擇最適發(fā)酵時間為30 h。

圖3 發(fā)酵時間對菌株P(guān)G12產(chǎn)靈菌紅素的影響Fig.3 Effect of fermentation time on prodigiosin production by strain PG12

2.2 響應(yīng)面試驗分析

2.2.1 回歸模型的建立及方差分析

響應(yīng)面試驗結(jié)果見表2。根據(jù)相關(guān)文獻方法，利用Design Expert 8.0軟件對試驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析[25-26]，建立靈菌紅素產(chǎn)量（Y）關(guān)于K2HPO4濃度（X1）、溶氧量（X2）和發(fā)酵時間（X3）的二次多項回歸方程為：

表2 菌株P(guān)G12產(chǎn)靈菌紅素發(fā)酵工藝條件優(yōu)化Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments for fermentation conditions optimization for prodigiosin production by strain PG12

對該回歸模型進行方差分析，結(jié)果見表3。由表3可知，回歸模型的P＜0.000 1，表明回歸模型極顯著，而失擬項P為0.073 7，大于0.05，表明不顯著，因而該模型成立。模型的決定系數(shù)R2和校正決定系數(shù)R2（Adj）分別為0.997 4和0.994 1，兩者接近，說明模型的準(zhǔn)確性較高。變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）為2.37%，小于10%，表明試驗具有較高的可信度和精確度，模型與試驗擬合程度良好，可用該模型來預(yù)測靈菌紅素的最佳發(fā)酵工藝條件。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

續(xù)表

由P值可知，一次項X1、X2、交互項X1X2、二次項X12、X22、X32對靈菌紅素產(chǎn)量有極顯著影響（P＜0.01），一次項X3對靈菌紅素產(chǎn)量有顯著影響（P＜0.05）其他項對靈菌紅素產(chǎn)量影響不顯著（P＞0.05）。F值可知，各因素對靈菌紅素產(chǎn)量的影響程度依次是：K2HPO4濃度（X1）＞溶氧量（X2）＞發(fā)酵時間（X3）。

2.2.2 響應(yīng)曲面圖分析

各因素交互作用對靈菌紅素產(chǎn)量影響的響應(yīng)曲面及等高線如圖4所示，從3D的曲面圖可以看出，K2HPO4濃度與溶氧量交互作用的曲面圖坡度最陡峭，表明交互作用最強；而溶氧量與發(fā)酵時間交互作用的曲面圖坡度最平緩，表明交互作用最弱。綜合幾個等高線分析來看，靈菌紅素產(chǎn)量＜1 400 mg/L時，等高線較密；當(dāng)靈菌紅素產(chǎn)量≥1 400 mg/L時，對應(yīng)的各因素數(shù)值大約集中表現(xiàn)為：K2HPO4濃度25.2～31.9 mmol/L，溶氧量＞33.5%。

圖4 各因素間交互作用對靈菌紅素產(chǎn)量影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on the yield of prodigiosin

2.2.3 回歸模型的驗證

利用Design Expert 8.0軟件求取二次曲面方程的極值，得到粘質(zhì)沙雷氏菌PG12產(chǎn)靈菌紅素的最佳發(fā)酵工藝條件為K2HPO4濃度28.45 mmol/L，溶氧量46.87%，發(fā)酵時間29.07 h，此條件下靈菌紅素產(chǎn)量預(yù)測值為1 639.76 mg/L?？紤]到實際操作的可行性，將優(yōu)化的發(fā)酵工藝條件修正為K2HPO4濃度28.45 mmol/L，溶氧量47%，發(fā)酵時間29 h。在此發(fā)酵工藝條件下進行3次平行試驗，靈菌紅素產(chǎn)量實際值為（1 636.5±13.7）mg/L，與預(yù)測值接近，故該回歸模型可用于優(yōu)化粘質(zhì)沙雷氏菌PG12的靈菌紅素發(fā)酵條件。相對于原始條件（K2HPO4濃度30 mmol/L、溶氧量60%、發(fā)酵時間36 h）下的靈菌紅素產(chǎn)量，優(yōu)化條件下的靈菌紅素產(chǎn)量提高了13.14%。

3 結(jié)論

通過單因素試驗，篩選出K2HPO4濃度、溶氧量和發(fā)酵時間3種因素對靈菌紅素發(fā)酵產(chǎn)量有較大影響。采用Box-Behnken響應(yīng)面法確定最佳的發(fā)酵工藝條件為K2HPO4濃度28.45 mmol/L，溶氧量47%，發(fā)酵時間29 h。在優(yōu)化條件下，靈菌紅素產(chǎn)量達到1 636.5 mg/L，較原始條件下的靈菌紅素產(chǎn)量提高了13.14%，表明響應(yīng)面法優(yōu)化工藝可行性良好，可以為靈菌紅素發(fā)酵工藝條件控制的研究及生產(chǎn)實踐提供參考。