苦丁茶米酒的發(fā)酵工藝條件優(yōu)化

王芙蓉，趙益梅，李 靖，唐佳代，黃麗姍，曹文濤

（1.茅臺(tái)學(xué)院 釀酒工程系，貴州 遵義 564500；2.仁懷市中等職業(yè)學(xué)校，貴州 遵義 564500）

貴州省遵義市余慶縣盛產(chǎn)苦丁茶，是全國苦丁茶的核心產(chǎn)區(qū)[1]。其成品茶清香有苦味、回味甘涼[2]?？喽〔韬蓄慄S酮、維生素C、氨基酸、多種微量元素、三萜皂甙類等多種有益成分，具有一定的抗氧化[3-4]、降血糖[5-6]、降血脂、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫的功能[7-9]。但苦丁茶產(chǎn)品競爭力不強(qiáng)，經(jīng)濟(jì)效益不高，目前對(duì)苦丁茶的相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)還處于比較滯后的水平。通過深加工開發(fā)一些新產(chǎn)品，可以改變目前的這種消費(fèi)現(xiàn)狀，拓寬產(chǎn)品銷售渠道[10]。把苦丁茶深加工成茶酒，將貴州的兩張名片有機(jī)結(jié)合，是提高苦丁茶經(jīng)濟(jì)效益的一種切實(shí)可行的方法。目前，國內(nèi)大部分的茶酒大部分是以浸泡的方式制得，即將酒和茶湯原汁混合，或用白酒泡制而成，也有將蔗糖和茶葉混合加入釀酒酵母，但是這類方法制得的茶酒酒精度高、易上頭[11]，因此，探索采用固態(tài)發(fā)酵法研制茶酒的方法和條件顯得格外的重要。

我國傳統(tǒng)米酒是利用固態(tài)法發(fā)酵而成的酸甜可口、酒香醇厚的飲品，風(fēng)味特征是帶有水果香和花香，并伴有醇香和青草香[12-13]。在比較浸泡時(shí)茶葉的形態(tài)、苦丁茶浸提液的溫度、茶葉浸泡方式的選擇、苦丁茶的浸提時(shí)間、苦丁茶與浸提液的比例、蒸飯的方式等預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過在米酒發(fā)酵過程中添加適量的苦丁茶制得茶酒，同時(shí)兼顧酒與茶的風(fēng)味，其入口柔軟，后味回甜又伴有淡淡的茶香，其口味廣受大眾的喜愛，不乏是一款很好的保健飲料酒[14]。本研究以貴州本地特產(chǎn)苦丁茶和大米為原料制備苦丁茶米酒，通過對(duì)苦丁茶米酒發(fā)酵工藝的優(yōu)化，得到適宜的發(fā)酵條件，研發(fā)出一種新的保健型米酒類飲品，以期為貴州地區(qū)苦丁茶的開發(fā)提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

苦丁茶：貴州省遵義市余慶縣；大米：黑龍江秋然米業(yè)有限公司；安琪甜酒曲：安琪酵母股份有限公司。

1.1.2 化學(xué)試劑

七水合硫酸亞鐵（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；四水合酒石酸鉀鈉、磷酸氫二鈉（均為分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鉀（分析純）：南京化學(xué)試劑股份有限公司；胰蛋白胨（生化試劑）：京全隆生物技術(shù)有限公司；酵母浸膏（生化試劑）、葡萄糖（分析純）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；瓊脂粉（生化試劑）：天津永大化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇（分析純）：天津市富宇化工有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯培養(yǎng)基、煌綠乳糖膽鹽肉湯培養(yǎng)基：上海博微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-LS-100Sll立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊醫(yī)療股份有限公司；DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：常州潤滑電器有限公司；SW-CJ-2D雙人單面垂直凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；SPX-150B-Z恒溫培養(yǎng)箱：上海森信試驗(yàn)儀器有限公司；FA1204N電子分析天平：上海箐海儀器有限公司；UV-5100紫外分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；WZS 80糖度計(jì)：上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 苦丁茶米酒加工工藝流程及操作要點(diǎn)[15-16]

大米→洗凈→浸泡→瀝干→蒸飯→冷卻→加入苦丁茶湯→加酒曲攪拌→恒溫發(fā)酵→抽濾→精濾→裝瓶→殺菌→苦丁茶米酒成品

苦丁茶湯的制備：在1 000 mL水中加入40 g苦丁茶茶葉，100 ℃浸提70 min。

大米飯的制備：將大米洗至無白色渾濁，室溫條件下浸泡2 h，然后于高壓滅菌鍋中將大米蒸熟至松軟無白心，置于超凈滅菌臺(tái)上，滅菌冷卻30 min，冷卻至室溫后備用。

添加酒曲：在降至室溫的大米飲中添加苦丁茶湯和打量水，在溫?zé)犸埩Ｖ屑尤胍欢康陌茬魈鹁魄?，使其與大米飯和茶湯均勻混合。

恒溫發(fā)酵：30 ℃恒溫發(fā)酵一定時(shí)間。

過濾、殺菌：發(fā)酵完成后經(jīng)4層紗布過濾，巴氏殺菌（68 ℃、30 min），即得苦丁茶米酒。

1.3.2 苦丁茶米酒發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

以大米飯為發(fā)酵基質(zhì)，分別進(jìn)行發(fā)酵時(shí)間、料液比、酒曲添加量對(duì)苦丁茶米酒品質(zhì)影響的單因素試驗(yàn)[17-18]，確定較為適合的各個(gè)因素的最佳參數(shù)。

在發(fā)酵時(shí)間、料液比、酒曲添加量、發(fā)酵溫度分別為120 h、1∶0.6（g∶mL）、0.8%、30 ℃的基本條件下，保持其他因素不變，只改變一個(gè)因素，分別考察發(fā)酵時(shí)間（48 h、72 h、96 h、120 h、144 h）、料液比（1.0∶0.2、1.0∶0.4、1.0∶0.6、1.0∶0.8、1.0∶1.0（g∶mL））、酒曲添加量（0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%）對(duì)苦丁茶米酒茶多酚含量、糖度和感官評(píng)分的影響。每組單因素試驗(yàn)做3組平行。

1.3.3 苦丁茶米酒發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，固定發(fā)酵溫度為30 ℃，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)[19，21]，考察酒曲添加量（A）、料液比（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）對(duì)苦丁茶米酒的影響，以苦丁茶米酒的感官評(píng)分（Y）為響應(yīng)值，確定其最佳發(fā)酵工藝參數(shù)，響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 苦丁茶米酒發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for fermentation process optimization of Chinese bitter tea rice wine

1.3.4 檢測方法

感官評(píng)分：參考相關(guān)茶酒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)，結(jié)合苦丁茶米酒的特色制定感官評(píng)定方法[22-23]，由貴州省評(píng)委老師帶隊(duì)的10位品評(píng)人員組成的品酒團(tuán)隊(duì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行感官品質(zhì)評(píng)分，滿分100分，感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 苦丁茶米酒的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of Chinese bitter tea rice wine

理化指標(biāo)：酒精度的檢測采用酒精計(jì)法[24]、糖度的檢測采用糖度計(jì)法、茶多酚含量的檢測采用酒石酸亞鐵比色法[25]。

微生物指標(biāo)：菌落總數(shù)按照GB 4789.2—2022《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定》，大腸菌群按照GB 4789.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)苦丁茶米酒品質(zhì)的影響

分別考察發(fā)酵時(shí)間（48 h、72 h、96 h、120 h、144 h）對(duì)苦丁茶米酒茶多酚含量、糖度和感官評(píng)分的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可知，茶多酚含量、糖度、感官評(píng)分都隨著發(fā)酵時(shí)間在48～144 h的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間48～96 h時(shí)，茶多酚的含量、感官評(píng)分隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而增加，由于發(fā)酵時(shí)間較短苦丁茶米酒為淡米白色，酵母未完全發(fā)酵，整體香味雖濃，但酒精味偏淡；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為96 h時(shí)，苦丁茶米酒均呈透明淡綠色，有酒味，茶多酚含量、感官評(píng)分最高，分別為0.832 mg/mL、85分；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間＞96 h之后，茶多酚含量、感官評(píng)分呈現(xiàn)下降趨勢，色澤暗沉。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，糖度的變化也不大，因此，最適發(fā)酵時(shí)間為96 h。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)苦丁茶米酒品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of fermentation time on the quality of Chinese bitter tea rice wine

2.1.2 料液比對(duì)苦丁茶米酒品質(zhì)的影響

考察不同料液比（1.0∶0.2、1.0∶0.4、1.0∶0.6、1.0∶0.8、1.0∶1.0（g∶mL））對(duì)苦丁茶米酒茶多酚含量、糖度和感官評(píng)分的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知，當(dāng)料液比為1.0∶0.2～1.0∶0.8（g∶mL）時(shí)，茶多酚的含量、感官評(píng)分隨著苦丁茶浸提液添加的增加而增加；當(dāng)料液比為1.0∶0.8（g∶mL）時(shí)，茶多酚的含量、感官評(píng)分最高，分別為0.861 mg/mL、86分，此時(shí)大部分苦丁茶浸提液已經(jīng)發(fā)酵完全，酒液呈淡綠色，清透微亮且有光澤，酒汁酸甜適宜，有米酒的新鮮伴隨著苦丁茶浸提液發(fā)酵的濃厚口感，酒香和茶香怡人；當(dāng)料液比為1.0∶1.0（g∶mL）時(shí)，由于苦丁茶浸提液的增多，發(fā)酵被抑制，整體風(fēng)味也較差，苦丁茶浸提液過度發(fā)酵使酒液顏色加深，苦味被釋放，香氣不足，口感較差。茶多酚的含量、感官評(píng)分均有所下降，糖度變化不大。因此，確定最適料液比為1.0∶0.8（g∶mL）。

圖2 料液比對(duì)苦丁茶米酒品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of solid and liquid ratio on the quality of Chinese bitter tea rice wine

2.1.3 酒曲添加量對(duì)苦丁茶米酒的影響

考察不同酒曲添加量（0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%）對(duì)苦丁茶米酒茶多酚含量、糖度和感官評(píng)分的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著酒曲添加量在0.4%～0.8%范圍內(nèi)的增加，感官評(píng)分和茶多酚含量均呈現(xiàn)為先上升后下降的趨勢，而糖度則是隨著酒曲添加量的增加而降低。當(dāng)酒曲添加量為在0.4%～0.6%時(shí)，茶多酚的含量、感官評(píng)分隨著酒曲添加量的增加而增加，這是因?yàn)榍脑黾哟龠M(jìn)了大米與苦丁茶浸提液的發(fā)酵。當(dāng)酒曲添加量達(dá)到0.6%時(shí)，苦丁茶米酒茶多酚含量、感官評(píng)分最高，分別為0.859 mg/mL、86分，此時(shí)酒液呈微黃綠色，酸甜可口，米酒的香氣和茶香混合使得香氣豐富，風(fēng)味較好。當(dāng)酒曲添加量＞0.6%之后，茶多酚的含量、感官評(píng)分隨著酒曲添加量的增加而降低，此時(shí)酒體酸澀味逐漸加重，感官評(píng)價(jià)較差。因此，確定最適酒曲添加量為0.6%。

圖3 酒曲添加量對(duì)苦丁茶米酒品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of Jiuqu addition on the quality of Chinese bitter tea rice wine

2.2 苦丁茶米酒發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過Design-Expert 11.0.3對(duì)酒曲添加量（A）、茶汁料液比（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）3個(gè)自變量，并以感官評(píng)分（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表3 發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface tests for fermentation process optimization

2.2.1 響應(yīng)面回歸模型的分析

運(yùn)用Design-Expert 11.0.3軟件，對(duì)表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，得出方差分析結(jié)果見表4。以酒曲添加量（A）、茶汁料液比（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）為自變量，以苦丁茶米酒的感官評(píng)分（Y）為響應(yīng)值，經(jīng)過回歸擬合后，得出回歸方程如下：

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

由表4可知，該模型F值為82.63，P值＜0.000 1表示該回歸模型差異極顯著；失擬項(xiàng)P值，0.069 9＞0.05，不顯著。模型決定系數(shù)R2=0.979 7，校正決定系數(shù)R2=0.990 7，說明該回歸模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合程度高，可以用于苦丁茶米酒的工藝優(yōu)化預(yù)測和分析。由P值可知，一次項(xiàng)A，交互項(xiàng)AC，二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)苦丁茶米酒感官評(píng)分的影響極顯著（P＜0.01）；一次項(xiàng)B，交互項(xiàng)BC對(duì)苦丁茶米酒感官評(píng)分影響顯著（P＜0.05）。由F值可知，各因素對(duì)于苦丁茶米酒中感官評(píng)分的影響程度為酒曲添加量（A）＞料液比（B）＞發(fā)酵時(shí)間（C）。

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)交互作用分析

從響應(yīng)面試驗(yàn)的設(shè)計(jì)原理上看，三維曲線的彎曲度愈大，說明兩個(gè)因素之間的相互作用對(duì)感官得分的影響愈顯著。等高線圖為三維曲線在底部的投影，若表現(xiàn)為圓形，則表示兩因素間對(duì)感官評(píng)分的影響不顯著；若表現(xiàn)為橢圓，則表明兩因素間對(duì)感官評(píng)分的交互影響顯著。各因素及其交互作用對(duì)苦丁茶米酒感官評(píng)分的影響結(jié)果見圖4。

圖4 各因素間交互作用對(duì)苦丁茶米酒感官評(píng)分影響的響應(yīng)面和等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on sensory evaluation of Chinese bitter tea rice wine

據(jù)響應(yīng)面Design-Expert 11.0.3軟件分析得出苦丁茶米酒的最佳工藝為酒曲添加量0.61%、發(fā)酵時(shí)間98.41 h、料液比為1.00∶0.82（g∶mL），感官評(píng)分理論值為89.3分。為了試驗(yàn)的可操作性將軟件得出的最優(yōu)發(fā)酵工藝條件調(diào)整為酒曲添加量0.6%、發(fā)酵時(shí)間98.0 h、料液比為1.0∶0.8（g∶mL）。在此條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，其感官評(píng)分平均實(shí)際值為89.7分。因此，采用響應(yīng)面法優(yōu)化苦丁茶米酒工藝得到的工藝條件準(zhǔn)確可行。

2.3 成品指標(biāo)檢測結(jié)果與分析

2.3.1 感官分析

苦丁茶米酒產(chǎn)品整體呈淡綠色，呈微透明狀，有光澤、甜香，入口有大米和苦丁茶的香味，酒香和茶香協(xié)調(diào)，后味帶點(diǎn)茉莉花香，滋味爽口，其感官評(píng)分為89.7分。

2.3.2 理化指標(biāo)檢測

苦丁茶米酒產(chǎn)品酒精度為7.1%vol，糖度為19.7°Bx，茶多酚含量為0.867 mg/mL。

2.3.3 微生物指標(biāo)

苦丁茶米酒產(chǎn)品菌落總數(shù)＜50 CFU/mL，大腸菌群＜3 MPN/100 mL，致病菌未檢出。

3 結(jié)論

以大米和苦丁茶為主要原料制備苦丁茶米酒，通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)苦丁茶米酒發(fā)酵工藝主要影響因素進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，苦丁茶米酒最佳發(fā)酵工藝為發(fā)酵時(shí)間98 h、料液比1.0∶0.8（g∶mL）、酒曲添加量0.6%、發(fā)酵溫度30 ℃。在此最佳條件下，成品酒的酒精度為7.1%vol、茶多酚含量為0.867 mg/mL、糖度為19.7°Bx、感官評(píng)分為89.7分；產(chǎn)品的理化衛(wèi)生指標(biāo)中細(xì)菌總數(shù)＜70 CFU/mL，大腸菌群＜3.0 MPN/100 mL；產(chǎn)品的形態(tài)為淡綠色，透明發(fā)亮，甜度適中，富含茶多酚營養(yǎng)成分，入口有大米香味，后味有苦丁茶香味，口感悅?cè)?，酸甜適口，有新鮮感，香味純正，冷藏后飲用更佳。

該產(chǎn)品的開發(fā)與研究，為苦丁茶、大米開發(fā)出了良好的健康、巨大的市場前景。且該法采用水作為萃取液，充分發(fā)揮和保存了茶葉中的活性物質(zhì)，提高了它的營養(yǎng)價(jià)值和保健作用，同時(shí)在釀造工藝中，不添加人工色素、香料、化學(xué)穩(wěn)定性，產(chǎn)品能保持6個(gè)月以上，達(dá)到食品衛(wèi)生與保健的需要，具有很強(qiáng)的市場競爭力，該方法釀造茶酒工藝簡單，操作方便，生產(chǎn)可行。