郭楠楠,王 璇,李 曉,謝 立
(鄭州科技學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院 鄭州市食品安全快速檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州 450064)
蜂蜜營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高,是一種高碳水化合物的食物,其主要成分是果糖、葡萄糖以及約25種低聚糖,同時(shí)還含有少量蛋白質(zhì)、酶、氨基酸、礦物質(zhì)、微量元素、維生素、芳香化合物和多酚[1]。我國(guó)蜂蜜產(chǎn)量位居世界第一[2],但由于蜂蜜品質(zhì)低,缺少知名品牌,導(dǎo)致我國(guó)蜂蜜出口價(jià)格低[3]。開(kāi)發(fā)蜂蜜產(chǎn)品,提升蜂蜜附加值,為人民群眾創(chuàng)產(chǎn)增收,穩(wěn)固脫貧攻堅(jiān)成果有著十分重要深遠(yuǎn)的意義[4]。蜂蜜酒是蜂蜜加水稀釋經(jīng)發(fā)酵制成,蜂蜜酒中含17種氨基酸和葡萄糖、果糖、維生素A(vitaminA,VA)、VE以及礦物質(zhì)等,對(duì)人體有一定的保健作用[5]。董彩文等[6]以干桂花、蜂蜜為主要原料,制備干桂花蜂蜜酒,其最優(yōu)發(fā)酵工藝條件為糖度28%、酵母接種量0.2%、銨鹽質(zhì)量濃度0.9 g/L、麥曲添加量9%,在28 ℃發(fā)酵6 d。在此發(fā)酵條件下,干桂花蜂蜜酒酒精度為16.98%vol。張杰等[7]以黑米、蜂蜜和水為原料,通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化蜂蜜酒的發(fā)酵工藝,制得一款酒精度為12.7%vol的蜂蜜酒,酒體協(xié)調(diào),呈酒紅色,兼有黑米和蜂蜜特殊風(fēng)味。
五味子(Schisandra chinensis)是我國(guó)著名的傳統(tǒng)中藥材,其果實(shí)具有甘、苦、辛、咸和酸五種味道[8],五味子含有木脂素類、揮發(fā)油類等多種化學(xué)成分[9],具有抗炎、護(hù)肝保肝功效,可用于咳嗽虛喘、神經(jīng)和精神疾病、遺精、尿頻、久瀉不止等癥狀[10-11],鄭春英等[12]利用釀酒酵母發(fā)酵北五味子,發(fā)酵后的北五味子中4種主要木脂素類成分(五味子甲素、五味子乙素、五味子酯甲、五味子醇甲)的含量均顯著提高。目前,國(guó)內(nèi)已有五味子釀酒的研究報(bào)道,劉洋[13]以北五味子、大米為原料,甜酒曲為糖化發(fā)酵劑經(jīng)混合發(fā)酵工藝釀制北五味子米酒,并對(duì)其發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。榮軍等[14]以6種不同釀酒酵母發(fā)酵制備北五味子酒,發(fā)現(xiàn)不同酵母發(fā)酵之后的五味子酒的揮發(fā)性成分差異較大,這為五味子酒的釀酒酵母的選擇提供了一定的理論參考。五味子釀酒的歷史由來(lái)已久,但將其與蜂蜜復(fù)配用于釀造蜂蜜酒的研究較少,二者搭配制作的五味子蜂蜜酒可以兼具五味子功效和蜂蜜酒的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。
本研究以五味子和蜂蜜為主要原料制備五味子蜂蜜酒,通過(guò)單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面法優(yōu)化五味子蜂蜜酒的釀造工藝,并對(duì)五味子蜂蜜酒的揮發(fā)性風(fēng)味成分及理化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。以期為蜂蜜酒的研究發(fā)展提供一定的理論依據(jù),同時(shí)將五味子應(yīng)用于蜂蜜酒的釀造,以期能豐富五味子蜂蜜酒中特殊功能性成分的研究,為后續(xù)研究提供參考依據(jù)。
1.1.1 材料與菌株
北五味子干果:產(chǎn)自吉林長(zhǎng)白山;多花蜂蜜:北京百花蜂業(yè)科技發(fā)展股份公司;EXCELLENCETME2F酵母:法國(guó)LAMOTHE-ABIET公司。
1.1.2 試劑
檸檬酸(食品級(jí)):河南得立富食品配料有限公司;碳酸鈉(食品級(jí)):扶溝縣味思美食品廠;膨潤(rùn)土:法國(guó)OENOFRANCE公司;氫氧化鈉(分析純):無(wú)錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司;濃鹽酸(分析純):洛陽(yáng)昊華化學(xué)試劑有限公司。
1.1.3 培養(yǎng)基
平板計(jì)數(shù)瓊脂(plate count agar,PCA)培養(yǎng)基、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(lauryl sulfate tryptose,LST)肉湯培養(yǎng)基、煌綠乳糖膽鹽(brilliant green lactose bile,BGLB)肉湯培養(yǎng)基:北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。
TRACE1300-TSQ9000氣相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry,GC-MS/MS)聯(lián)用儀:賽默飛世爾科技有限公司;ES1200-4電子天平:沈陽(yáng)龍騰電子有限公司;PHB-05便攜式pH計(jì):上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;DZKW電熱恒溫水浴鍋:北京市永光明醫(yī)療儀器廠;GRP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱:上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;酒精計(jì):河北省武強(qiáng)滏陽(yáng)玻璃儀表廠;手持糖度計(jì):北京云華科儀科技有限公司;UV-2800H型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):尤尼科(上海)儀器有限公司。
1.3.1 五味子蜂蜜酒的加工工藝流程及操作要點(diǎn)
操作要點(diǎn):
五味子預(yù)處理:選擇無(wú)腐爛、無(wú)霉變的五味子干果、洗凈晾干,將五味子粉碎成粗顆粒之后過(guò)60目篩,便于五味子甲素等有效成分的浸出[15],然后加水調(diào)整五味子含量為1.9%,配置成五味子水溶液。
調(diào)整成分:使用蜂蜜調(diào)整五味子水溶液的糖度為25%,檸檬酸、碳酸鈉調(diào)整五味子蜂蜜混合液的pH值為4.0。
熱處理:在90 ℃條件下保持30 min殺菌,此外,使蜂蜜中轉(zhuǎn)化酶失活以提高發(fā)酵效率[16]。
接種、發(fā)酵:將活性干酵母于經(jīng)熱處理之后的發(fā)酵液5 mL中溶解,在30 ℃下保溫活化20~30 min,然后接種到五味子蜂蜜混合液中,接種量為0.16%。發(fā)酵溫度控制在26 ℃,發(fā)酵期間每天固定時(shí)間段測(cè)定可溶性固形物含量。當(dāng)可溶性固形物含量減少緩慢時(shí),即停止發(fā)酵。
陳釀:將發(fā)酵液置于室溫條件下陳釀10 d。
澄清:提前將膨潤(rùn)土溶于10倍質(zhì)量熱水(50 ℃左右)中,靜置膨化4 h。酒液中用量為1 g/L,搖勻,靜置澄清5 d[17],用殺菌后的多層紗布過(guò)濾取上清液。
巴氏殺菌:取澄清后的上清液,在高溫滅菌鍋中保持65 ℃,滅菌30 min,即得五味子蜂蜜酒成品。
1.3.2 五味子蜂蜜酒發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)
在參考其他文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上[18-23],固定發(fā)酵時(shí)間為7 d,設(shè)置五味子含量分別為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%,初始可溶性固形物含量分別為16%、20%、24%、28%、32%,酵母接種量分別為0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%,初始pH值分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0,發(fā)酵期間每天固定時(shí)間段測(cè)定可溶性固形物含量。發(fā)酵停止,澄清滅菌后對(duì)五味子蜂蜜酒進(jìn)行感官評(píng)分,并測(cè)定其酒精度。
1.3.3 五味子蜂蜜酒發(fā)酵工藝條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)
在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以感官評(píng)分(Y)為響應(yīng)值,五味子含量(A)、初始可溶性固形物含量(B)、酵母接種量(C)、初始pH值(D)四個(gè)因素為自變量,采用Design-Expert 13.0.1軟件對(duì)五味子蜂蜜酒的發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。五味子蜂蜜酒發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。
表1 發(fā)酵條件優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken test for fermentation process conditions optimization of Schisandra chinensis mead
1.3.4 感官評(píng)價(jià)
采用感官綜合評(píng)分法對(duì)五味子蜂蜜酒進(jìn)行感官評(píng)分。根據(jù)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》和QB/T 5475—2020《蜂蜜酒》,制定五味子蜂蜜酒感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),見(jiàn)表2,滿分為100分,由14名經(jīng)感官培訓(xùn)過(guò)的同學(xué)組成評(píng)定小組,對(duì)五味子蜂蜜酒的外觀(20分)、香氣(30分)、滋味(40分)和典型性(10分)對(duì)五味子蜂蜜酒進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。
表2 五味子蜂蜜酒感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of Schisandra chinensis mead
1.3.5 分析檢測(cè)
可溶性固形物:采用手持糖度計(jì)測(cè)定;酒精度:參照GB 5009.225—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)酒中乙醇濃度的測(cè)定》中的酒精計(jì)法;總糖、總酸:分別參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中直接滴定法、電位滴定法??偰局睾康臏y(cè)定:采用分光光度法[24],總多糖含量的測(cè)定:采用分光光度法[25]。
香氣成分采用GC-MS/MS分析。氣相色譜條件:柱流量1.0 mL/min;TG-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);柱溫40 ℃保留3 min,然后以3 ℃/min的升溫速度升至160 ℃保持2 min,以8 ℃/min的升溫速度升至230 ℃保持5min。質(zhì)譜條件:電子電離(electronic ionization,EI)源,電子能量70 eV,離子源溫度250 ℃;傳輸線溫度250 ℃;全掃描模式(掃描范圍30~450 amu)。
菌落總數(shù)及大腸菌群的測(cè)定:按照GB 4789.2—2022《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》以及GB 4789.3—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》。
1.3.6 數(shù)據(jù)處理
使用Microsoft office excel 2019、Origin 2021、Design-Expert 13.0.1進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、圖表制作以及數(shù)據(jù)分析。
2.1.1 五味子含量對(duì)五味子蜂蜜酒品質(zhì)的影響
五味子含量對(duì)五味子蜂蜜酒品質(zhì)的影響見(jiàn)圖1。
圖1 五味子含量對(duì)五味子蜂蜜酒品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of Schisandra chinensis contents on the quality of S.chinensis mead
由圖1可知,隨著五味子含量在1.0%~3.0%范圍內(nèi)的增加,酒精度呈現(xiàn)上升趨勢(shì),而可溶性固形物含量呈下降的趨勢(shì)。當(dāng)五味子含量在1.0%~2.0%范圍內(nèi)的增加時(shí),感官評(píng)分逐漸增加;當(dāng)五味子含量為2.0%時(shí),感官評(píng)分達(dá)到最大值,為86分;當(dāng)五味子含量>2.0%時(shí),感官評(píng)分逐漸下降。綜合考慮,最適五味子含量為2.0%。
2.1.2 初始可溶性固形物含量對(duì)五味子蜂蜜酒品質(zhì)的影響
初始可溶性固形物含量對(duì)五味子蜂蜜酒品質(zhì)的影響見(jiàn)圖2。
圖2 初始可溶性固形物含量對(duì)五味子蜂蜜酒品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of primary soluble solids contents on the quality of S.chinensis mead
由圖2可知,當(dāng)初始可溶性固形物含量在16%~32%范圍內(nèi)增加時(shí),可溶性固形物含量逐漸增加。當(dāng)初始可溶性固形物含量在16%~24%范圍內(nèi)增加時(shí),感官評(píng)分逐漸增加;當(dāng)初始可溶性固形物含量為24%時(shí),感官評(píng)分達(dá)到最高值,為83分;當(dāng)初始可溶性固形物含量>24%時(shí),感官評(píng)分逐漸下降。當(dāng)初始可溶性固形物含量在16%~28%范圍內(nèi)增加時(shí),酒精度逐漸增加,但初始可溶性固形物含量為24%、28%時(shí),其酒精度差異不大;當(dāng)初始可溶性固形物含量>28%時(shí),酒精度逐漸下降。其原因可能是,初始可溶性固形物含量較低時(shí),產(chǎn)生的酒精度也較低,導(dǎo)致了五味子蜂蜜酒酒體不豐滿,感官評(píng)分較低;當(dāng)初始可溶性固形物含量較高時(shí),發(fā)酵液滲透壓較高,會(huì)明顯抑制發(fā)酵[24],導(dǎo)致發(fā)酵結(jié)束后的可溶性固形物含量較高,酒精度較低。較高的殘?zhí)橇恳矔?huì)導(dǎo)致酒體甜味過(guò)重,影響口感,感官評(píng)分較低。此外,也會(huì)影響貨架期。綜合考慮,最適初始可溶性固形物含量為24%。
2.1.3 酵母接種量對(duì)五味子蜂蜜酒品質(zhì)的影響
酵母接種量對(duì)五味子蜂蜜酒品質(zhì)的影響見(jiàn)圖3。
圖3 酵母接種量對(duì)五味子蜂蜜酒品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of yeast inoculum on the quality of S.chinensis mead
由圖3可知,隨著酵母接種量在0.05%~0.25%范圍內(nèi)的增加,酒精度逐漸上升,而可溶性固形物含量下降。當(dāng)酵母接種量在0.05%~0.15%范圍內(nèi)的增加,感官評(píng)分逐漸增加;當(dāng)酵母接種量為0.15%時(shí),感官評(píng)分達(dá)到最大值,為84分;當(dāng)酵母接種量>0.15%時(shí),感官評(píng)分逐漸下降。酵母接種量越高,發(fā)酵越徹底,酒精度越高,發(fā)酵結(jié)束時(shí)可溶性固形物含量越低,但過(guò)高的酵母接種量會(huì)使酒液產(chǎn)生不悅口感,使感官評(píng)分降低。綜合考慮,最適酵母接種量為0.15%。
2.1.4 初始pH值對(duì)五味子蜂蜜酒品質(zhì)的影響
初始pH值對(duì)五味子蜂蜜酒品質(zhì)的影響見(jiàn)圖4。
圖4 初始pH值對(duì)五味子蜂蜜酒品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of initial pH on the quality of S.chinensis mead
由圖4可知,隨著初始pH值在3.0~4.0范圍內(nèi)的增加,可溶性固形物含量快速下降,而感官評(píng)分與酒精度快速上升;初始pH值為4.0時(shí),可溶性固形物含量為9.2%,感官評(píng)分為78分,酒精度為10.4%vol,當(dāng)初始pH值>4.0時(shí),可溶性固形物含量下降趨勢(shì)趨于穩(wěn)定,感官評(píng)分與酒精度的上升趨勢(shì)趨于平穩(wěn)。其原因可能是,當(dāng)初始pH值較低時(shí),發(fā)酵結(jié)束時(shí)的可溶性固形物含量較高,酒精度也比較低。酵母生長(zhǎng)受到了嚴(yán)重的抑制,發(fā)酵速度緩慢,不利于風(fēng)味物質(zhì)的形成[26]。初始pH值較高時(shí),對(duì)雜菌抑制作用減小,容易引起酒液風(fēng)味變差,品質(zhì)降低[27]。綜合考慮,最適初始pH值為4.0。
在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,以感官評(píng)分(Y)為響應(yīng)值,五味子含量(A)、初始可溶性固形物含量(B)、酵母接種量(C)和初始pH值(D)4個(gè)因素為自變量,采用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化,篩選出五味子蜂蜜酒的最佳發(fā)酵工藝條件,響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3,方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。
表3 發(fā)酵工藝條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface tests for fermentation process conditions optimization
表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model
對(duì)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)利用分析軟件Design-Expert 13.0.1進(jìn)行多元回歸方程擬合,得到感官評(píng)分(Y)的二次多項(xiàng)回歸模型方程為:
由表4可知,該模型極顯著(P<0.000 1),失擬項(xiàng)不顯著(P=0.359 5>0.05),說(shuō)明構(gòu)建的回歸模型擬合較好。決定系數(shù)R2為0.935 1,說(shuō)明該模型試驗(yàn)誤差小,擬合程度好,調(diào)整決定系數(shù)R2adj為0.870 2,表示該模型可以解釋87.02%的響應(yīng)值變化。變異系數(shù)(coefficient of variation,CV)=2.54%<5.00%,說(shuō)明模型重現(xiàn)性較好。信噪比=12.872 8>4,說(shuō)明該模型很適合五味子蜂蜜酒的預(yù)測(cè)。由P值可知,一次項(xiàng)A、B,二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對(duì)五味子蜂蜜酒感官評(píng)分的影響極顯著(P<0.01);一次項(xiàng)C、D,交互項(xiàng)AB對(duì)五味子蜂蜜酒感官評(píng)分的影響顯著(P<0.05),其他項(xiàng)對(duì)五味子蜂蜜酒感官評(píng)分的影響不顯著(P>0.05)。由F值可知,4個(gè)因素對(duì)五味子蜂蜜酒感官評(píng)分的影響主次順序?yàn)椋何逦蹲雍浚ˋ)>初始可溶性固形物含量(B)>酵母接種量(C)>初始pH值(D)。
各因素間交互作用對(duì)感官評(píng)分影響的響應(yīng)曲面及等高線見(jiàn)圖5。
圖5 各因素間交互作用對(duì)五味子蜂蜜酒感官評(píng)分影響的響應(yīng)面及等高線Fig.5 Responses surface plots and contour lines of effects of interaction of each factors on sensory scores of Schisandrae chinensis mead
由圖5可知,在該模型中,AB曲面較為陡峭,并且等高線呈現(xiàn)出橢圓形,說(shuō)明其交互作用顯著,固定酵母接種量和pH不變,感官評(píng)分隨著五味子含量和初始可溶性固形物的增多呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢(shì),存在極值。而AC、AD、CD、BD、BC交互作用不顯著。這與方差分析結(jié)果一致。
由Design-Expert 13.0.1軟件預(yù)測(cè)得出五味子蜂蜜酒最佳發(fā)酵工藝條件為:五味子含量1.93%、初始可溶性固形物含量24.77%、酵母接種量0.158%、初始pH值為4.08,感官評(píng)分理論值為84.88分。為了便于實(shí)際生產(chǎn)操作,將五味子蜂蜜酒發(fā)酵生產(chǎn)工藝修正為:五味子含量1.9%、初始可溶性固形物含量25%、酵母接種量0.16%、初始pH值4.0。在此優(yōu)化條件下進(jìn)行6次平行驗(yàn)證試驗(yàn),五味子蜂蜜酒的感官評(píng)分實(shí)際值為84.20分,實(shí)際值與預(yù)測(cè)值相差不大,表明該回歸模型可靠,具備應(yīng)用價(jià)值。
對(duì)五味子蜂蜜酒理化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定,其酒精度為11.2%vol,總糖(以葡萄糖計(jì))為24.6 g/L,總酸(以酒石酸計(jì))為6.1 g/L,可溶性固形物含量為8.8%。五味子蜂蜜酒中主要功能成分木脂素總含量為0.062 g/100 g,總多糖含量為0.047 g/100 g;五味子蜂蜜酒的菌落總數(shù)為42 CFU/mL,大腸菌群未檢出。
采用氣相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用法分析五味子蜂蜜酒中揮發(fā)性香氣物質(zhì),檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表5。
表5 五味子蜂蜜酒揮發(fā)性香氣成分GC-MS/MS檢測(cè)結(jié)果Table 5 Determination results of volatile aroma components in Schisandra chinensis mead analyzed by GC-MS/MS
由表5可知,五味子蜂蜜酒共鑒定出揮發(fā)性香氣成分17種,其中酯類6種,醇類7種,烯類3種,醚類1種。其主體風(fēng)味成分是醇類(75.25%)、烯類(10.48%)、酯類(9.85%)。醇類如乙醇、苯丙醇、橙花叔醇等賦予了酒液突出的酒香與果香[28];萜烯類物質(zhì)感官閾值較低,對(duì)酒液香氣形成也十分重要[29];酯類如乙酸乙酯、辛酸乙酯、葵酸乙酯等賦予了酒液獨(dú)特而又復(fù)雜的水果香味[30]。其中,乙醇相對(duì)含量最高,占比34.95%,其次分別為苯丙醇(23.31%)、2-甲基丁醇(12.31%)、D-檸檬烯(7.92%)、己酸乙酯(4.3%)、辛酸乙酯(2.12%)等。
本研究以五味子和蜂蜜為主要原料制備五味子蜂蜜酒,以感官評(píng)分作為評(píng)價(jià)指標(biāo),通過(guò)單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)確定五味子蜂蜜酒最佳發(fā)酵工藝條件為:五味子含量1.9%、初始可溶性固形物含量25%、酵母接種量0.16%、初始pH值4.0。在此優(yōu)化條件下,五味子蜂蜜酒的感官評(píng)分為84.2分,酒精度為11.2%vol,總糖(以葡萄糖計(jì))為24.6 g/L,總酸(以酒石酸計(jì))為6.1 g/L,可溶性固形物含量為8.8%,主要功能性物質(zhì)木脂素總含量為0.062 g/100 g,總多糖含量為0.047 g/100 g。其主要的香氣物質(zhì)為乙醇、苯丙醇、2-甲基丁醇、D-檸檬烯和己酸乙酯。五味子蜂蜜酒呈琥珀色,清澈透亮,蜜香、酒香突出,口感濃厚,酒體豐滿,有輕微苦澀感,整體風(fēng)格突出。本研究通過(guò)優(yōu)化五味子蜂蜜酒發(fā)酵工藝條件,為五味子蜂蜜酒的后續(xù)生產(chǎn)提供一定的參考意義。