五株有機高分子化合物降解菌的生物安全性分析

劉木蘭，唐白露*，曠琦穎，譚朵朵，劉 佳，何雪婷，王梓涵，周芷潔，夏 虎，2，陳中元

（1.湖南文理學院 生命與環(huán)境科學學院 常德市農(nóng)業(yè)生物大分子研究中心 水生動物重要疫病分子免疫技術湖南省重點實驗室環(huán)洞庭湖水產(chǎn)健康養(yǎng)殖及加工湖南省重點實驗室，湖南 常德 415000；2.大湖水殖股份有限公司，湖南 常德 415000）

幾丁質(zhì)和膠原蛋白都屬于難降解的有機高分子化合物。幾丁質(zhì)酶是幾丁質(zhì)生物降解的關鍵酶類，廣泛存在于各類物種中[1]。利用幾丁質(zhì)酶降解幾丁質(zhì)生產(chǎn)幾丁寡糖和殼聚糖等降解產(chǎn)物的方法具有反應條件溫和、綠色環(huán)保等優(yōu)點[2]。膠原蛋白酶是一類能夠在適宜條件下水解膠原蛋白，并且不損傷其他蛋白和結構的酶類[3]。利用膠原蛋白酶水解膠原蛋白，產(chǎn)物多為多肽和L-氨基酸，具有反應條件溫和、耗時短、無污染、產(chǎn)品營養(yǎng)價值高、產(chǎn)物易于消化吸收等優(yōu)點[4]。并且微生物胞外酶還具有來源廣、可分泌到胞外、生產(chǎn)周期短、易發(fā)酵、易提取、操作性強、經(jīng)濟效益好等優(yōu)點，在醫(yī)學、食品、化工和飼料等領域具有廣闊的應用前景和現(xiàn)實意義[5-6]。

目前比較常見的產(chǎn)幾丁質(zhì)酶細菌有氣單胞菌屬、沙雷氏菌屬、弧菌屬和芽孢桿菌屬[7]。有研究表明，來自枯草芽孢桿菌的幾丁質(zhì)酶在將廢棄的粗制蟹殼轉化為N-乙酰葡糖胺時的效果優(yōu)于作為商業(yè)化產(chǎn)品的灰色鏈霉菌的幾丁質(zhì)酶，轉化率可達60%[8]。LI Z K等[9]研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的珊瑚球菌EGB和鏈霉菌DA11對植物病原體米曲霉、黑曲霉和白色念珠菌有抑制效果。此外，有研究者通過優(yōu)化菌株發(fā)酵生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的工藝來制備幾丁寡糖或幾丁單糖[10-11]。目前研究較多的產(chǎn)膠原蛋白酶細菌主要有溶組織梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和溶藻弧菌[12]，其制備的膠原蛋白酶已作為商品酶進行出售。來自假交替單胞菌SM9913的膠原蛋白酶MCP-01在肉味改善和肉質(zhì)嫩化方面表現(xiàn)出良好的應用潛力[13]。但細菌在應用過程中可能會存在一定的安全風險，如某飼料添加劑中的蠟狀芽孢桿菌因攜帶含四環(huán)素耐藥基因（tetracyclin resistant gene B，tetB）的質(zhì)粒，存在潛在的安全風險而被停用[14]。

前期實驗從環(huán)洞庭湖水系的3個淡水湖漁場的表層底泥中篩選得到5株降解有機高分子化合物的細菌，其中2株為產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株，3株為產(chǎn)膠原蛋白酶菌株，但尚不了解這5株產(chǎn)酶菌株的生物安全性。本研究以篩選到的2株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株及3株產(chǎn)膠原蛋白酶菌株為研究對象，對其酶活力進行分析，對菌株進行分子生物學鑒定，并通過藥敏實驗、溶血性實驗、氨基酸脫羧酶活性和硝酸還原酶活性檢測實驗對其安全性進行評價，以期為產(chǎn)酶菌株的開發(fā)和利用奠定科學基礎，更好地實現(xiàn)產(chǎn)酶菌株的工業(yè)化應用，并充分開發(fā)菌株的利用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

2株降解幾丁質(zhì)的菌株：菌株AL1分離自漢壽縣安樂湖表層底泥，菌株BM1分離自澧縣北民湖表層底泥；3株降解膠原蛋白的菌株：菌株ALJ1分離自漢壽縣安樂湖表層底泥，菌株BMJ1分離自澧縣北民湖表層底泥，菌株DJ2分離自華容縣東湖表層底泥。所有菌株都保存于本實驗室。

1.1.2 試劑

1.1.3 培養(yǎng)基

血瓊脂平板培養(yǎng)基：江門市凱林貿(mào)易有限公司；LB液體/固體培養(yǎng)基：按照文獻[15]配制；明膠發(fā)酵培養(yǎng)基：按照文獻[16]配制。上述培養(yǎng)基均采用115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

氨基酸脫羧酶測定培養(yǎng)基：0.5%蛋白胨，0.3%酵母粉，0.1%葡萄糖，0.1%1.6%溴甲酚紫-乙醇溶液，0.5%L-賴氨酸/L-精氨酸/L-鳥氨酸（對照組不加氨基酸），pH 6.8，115 ℃高壓蒸汽滅菌10 min。

膠體幾丁質(zhì)發(fā)酵培養(yǎng)基：0.2%蛋白胨、0.1%葡萄糖、0.2%酵母粉、0.03%KH2PO4、0.07%K2HPO4、0.002%FeSO4、0.05% MgSO4·7H2O、0.001% ZnSO4、0.3%膠體幾丁質(zhì)，蒸餾水配制，pH 7.5，115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

THZ-98C恒溫振蕩器：上海一恒科學儀器有限公司；5417R臺式冷凍離心機：德國艾本德股份公司；Synergy HTX酶標儀：美國伯騰儀器有限公司；TC-96/G/H（b）C基因擴增儀：杭州博日科技有限公司；SPX-250生化培養(yǎng)箱：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；KW-1000DC HH恒溫水浴鍋：金壇市中大儀器廠；JY96-IIN超聲波細胞粉碎機：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 有機高分子化合物降解菌產(chǎn)酶活力的測定

（1）幾丁質(zhì)酶活測定

菌液按1%接種量接種于膠體幾丁質(zhì)發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，取發(fā)酵液上清，采用DNS法[17]進行幾丁質(zhì)酶活測定。以N-乙酰葡糖胺濃度（μmol/mL）（X）為橫坐標，OD550nm值（Y）為縱坐標繪制N-乙酰葡糖胺標準曲線，得到標準曲線回歸方程Y=0.789X-0.145。根據(jù)回歸方程計算篩選菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活。

幾丁質(zhì)酶活單位定義：在28 ℃、pH 7.5的條件下，1 mL酶液每小時催化產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量為一個酶活單位（U）。

（2）膠原蛋白酶活測定

菌液按0.1%接種量接種于明膠發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)1 d。取發(fā)酵液上清，采用甘氨酸-茚三酮顯色法[18]進行膠原蛋白酶活測定。以甘氨酸質(zhì)量濃度（μg/mL）（X）為橫坐標，OD570nm值（Y）為縱坐標，繪制甘氨酸標準曲線，得到標準曲線回歸方程Y=0.006 86X+0.026 09。根據(jù)回歸方程計算篩選菌株產(chǎn)膠原蛋白酶活。

膠原蛋白酶活單位定義：在28 ℃、pH 7.5的條件下，1 mL酶液每分鐘水解膠原蛋白產(chǎn)生相當于1 μg甘氨酸的酶量為一個酶活單位（U）。

1.3.2 分子生物學鑒定

16S rDNA基因序列的擴增：以上述DNA為模板，使用細菌通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增，PCR擴增體系和PCR擴增程序參考文獻[19]中的方法。

16S rDNA基因序列的測序及分析：將擴增得到的DNA片段送至擎科生物科技有限公司測序，測序結果通過美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫和Eztaxon數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對。隨后將菌株及其近緣種的16SrRNA基因序列通過分子進化遺傳分析（molecular evolutionarygenetics analysis，MEGA）7.0軟件的Clutal W程序進行比對，在MEGA 7.0中使用鄰接（neighbor joining，NJ）法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。用Bootstrap值分析（1 000個重復）來評估進化樹的拓撲關系，并使用Jukes和Cantor提出的模型對進化距離進行計算。

1.3.3 菌株的安全性評價

（1）抗生素敏感性檢測

采用常規(guī)紙片擴散法（Kirby-Bauer，K-B）對5株降解有機高分子化合物的細菌進行抗生素敏感性檢測實驗[20]。依據(jù)抑菌圈直徑大小結合《藥敏試驗紙片法的抑菌范圍解釋標準》判斷菌株對20種抗生素的敏感性[21]。抗生素敏感性可表明菌株抵抗外來藥物干擾的能力及抗性基因轉移的潛在風險。

（2）溶血性檢測

使用血瓊脂平板，通過劃線法檢測菌株的溶血性。用無菌接種環(huán)沾取少量菌液于血瓊脂平板表面，通過四區(qū)劃線法于血平板上劃出目標菌株的單菌落。將血瓊脂平板放入恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)1～2 d，觀察菌落周圍有無溶血現(xiàn)象出現(xiàn)，結果判斷依據(jù)Luis-Villasenor的方法[22]。若菌落周圍出現(xiàn)草綠色環(huán)，則為α-溶血；若菌落周圍出現(xiàn)透明溶血環(huán)，則為β-溶血；若菌落周圍無任何變化，則為γ-溶血，即不溶血。

（3）氨基酸脫羧酶活性檢測

分別設置無氨基酸的菌株組和分別含L-賴氨酸、L-精氨酸或L-鳥氨酸的菌株組。取50 μL OD600nm值約為1.0的5株待測菌的菌液分別接種到5 mL氨基酸脫羧酶測定培養(yǎng)基，向試管中加入無菌液體石蠟覆蓋液面，液體石蠟的高度為3～6 mm，從而形成一個密封的無氧環(huán)境。每組設3次重復，在28 ℃下靜置培養(yǎng)48 h后觀察培養(yǎng)基顏色變化[23]。當指示劑呈紫色為陽性結果，呈黃色為陰性結果，無氨基酸的菌株組為對照組，應呈黃色。

（4）硝酸還原酶活性檢測

有些細菌具有硝酸還原酶活性，可將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽。按照硝酸還原酶活性測定試劑盒的說明書進行菌株硝酸還原酶活性的測定[23]。

2 結果與分析

2.1 有機高分子化合物降解菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶和產(chǎn)膠原蛋白酶酶活力測定結果

5株降解有機高分子化合物菌株的產(chǎn)幾丁質(zhì)酶及產(chǎn)膠原蛋白酶酶活力測定結果見圖1。

由圖1可知，菌株AL1和菌株BM1可降解幾丁質(zhì)，菌株ALJ1、菌株BMJ1和菌株DJ2可降解膠原蛋白。菌株AL1、菌株BM1的幾丁質(zhì)酶活分別為（0.54±0.01）U/mL和（0.47±0.02）U/mL。菌株ALJ1、菌株BMJ1、菌株DJ2的膠原蛋白酶活分別為（82.38±3.00）U/mL、（71.24±4.19）U/mL和（53.78±3.74）U/mL。有研究從其他環(huán)境中分離到的產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株酶活在0.25～3.48 U/mL之間[24-25]，產(chǎn)膠原蛋白酶菌株酶活在21.19～36.80 U/mL之間[26-31]。本研究中的2株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株酶活為0.47～0.54 U/mL，3株產(chǎn)膠原蛋白酶菌株酶活為53.78～82.38 U/mL。

圖1 5株菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶及產(chǎn)膠原蛋白酶酶活力測定結果Fig.1 Determination results of enzyme activities of chitinase and collagenase produced by 5 strains

2.2 有機高分子化合物降解菌的分子生物學鑒定

對5株產(chǎn)酶菌株的16SrRNA基因進行測序，基于16SrRNA基因序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果見圖2。

圖2 基于16S rRNA基因序列5株菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic trees of 5 strains based on the 16S rRNA gene sequences

由圖2可知，菌株AL1、BM1、ALJ1、BMJ1、DJ2分別與蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）ATCC 14579T（AE016877）、陰城假單胞菌（Pseudomonas umsongensis）DSM 16611T（NIWU 01000003）、地中海假單胞菌（Pseudomonas mediterranea）CFBP 5447T（AUPB01000004）、杰西尼假單胞菌（Pseudomonas jessenii）DSM 17150T（NIWT01000013）和印度微小桿菌（Exiguobacterium indicum）HHS31T（AJ846291）以≥60%的自展值在系統(tǒng)發(fā)育樹上形成一個內(nèi)分支，說明兩者之間具有較近的親緣關系。將菌株AL1、BM1、ALJ1、BMJ1、DJ2分別鑒定為Bacillussp.、Pseudomonassp.、Pseudomonassp.、Pseudomonassp.和Exiguobacteriumsp.。

2.3 安全性評價

2.3.1 耐藥性

隨著抗生素的廣泛使用，細菌耐藥性問題也日益突出，減少耐藥菌株的傳播成為維護公共衛(wèi)生安全的關鍵之一。2013年歐洲食品安全局安全資格認證列表中將抗生素耐藥性列為微生物菌種通用安全評估項目[32]。采用K-B法對5株菌進行了20種抗生素敏感性檢測，結果見表1。由表1可知，Bacillussp.AL1對13種抗生素表現(xiàn)為耐藥，對6種抗生素表現(xiàn)為中度敏感，對1種抗生素表現(xiàn)為高度敏感。Pseudomonassp.BM1對16種抗生素表現(xiàn)為耐藥，對3種抗生素表現(xiàn)為中度敏感，對1種抗生素表現(xiàn)為高度敏感。Pseudomonassp.ALJ1對18種抗生素表現(xiàn)為耐藥，對1種抗生素表現(xiàn)為中度敏感，對1種抗生素表現(xiàn)為高度敏感。Pseudomonassp.BMJ1對16種抗生素表現(xiàn)為耐藥，對4種抗生素表現(xiàn)為高度敏感。Exiguobacteriumsp.DJ2對7種抗生素表現(xiàn)為耐藥，對7種抗生素表現(xiàn)為中度敏感，對6種抗生素表現(xiàn)為高度敏感。結果表明，Exiguobacteriumsp.DJ2的安全性較好，Pseudomonassp.ALJ1的安全風險較高。

表1 5株菌株抗生素敏感性試驗結果Table 1 Test results of antibiotic sensitivity of 5 strains

2.3.2 溶血性的測定

菌株分泌的溶血素能夠溶解細胞，使機體發(fā)生紅細胞內(nèi)在缺陷、抗原抗體反應、細胞死亡等，從而導致敗血癥[33]，并且溶血素還能引起有核細胞和血小板的損傷和死亡[34]。5株降解有機高分子化合物的細菌的溶血性結果見圖3。

由圖3可知，產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株Bacillussp.AL1菌落周圍由于紅細胞的完全破裂形成了透明溶血環(huán)，有溶血現(xiàn)象，為β-溶血，表明Bacillussp.AL1具有溶血性，能產(chǎn)生致病物質(zhì)溶血素；其他4株菌菌落周圍均沒有明顯的變化，無溶血現(xiàn)象，呈γ-溶血，表明這4株菌都沒有溶血性，不具有引發(fā)敗血癥的隱患。結果表明，產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株Bacillussp.AL1存在潛在的安全性風險。

圖3 5株菌株溶血性試驗結果Fig.3 Hemolytic test results of 5 strains

2.3.3 氨基酸脫羧酶活性的測定

生物胺主要存在于蛋白質(zhì)含量豐富的發(fā)酵食品中，由微生物分泌的氨基酸脫羧酶催化游離氨基酸形成[35]。生物胺是世界范圍內(nèi)公認的影響人體健康的物質(zhì)，食品中的生物胺是潛在的食品安全問題[36]。為確保產(chǎn)品的安全性，有必要對生物胺的產(chǎn)生進行研究[37]。5株降解有機高分子化合物菌株的氨基酸脫羧酶活性測定結果表明，L-賴氨酸菌株組中Pseudomonassp.BM1和Exiguobacteriumsp.DJ2呈黃色，為陰性；Bacillussp.AL1和Pseudomonassp.BMJ1出現(xiàn)藍紫色，為陽性。L-精氨酸菌株組除Exiguobacteriumsp.DJ2呈黃色，結果為陰性外，其他菌株均呈藍紫色，為陽性。L-鳥氨酸菌株組中Pseudomonassp.BM1和Exiguobacteriumsp.DJ2呈黃色，為陰性，Bacillussp.AL1、Pseudomonassp.ALJ1和Pseudomonassp.BMJ1出現(xiàn)藍紫色，為陽性。結果表明，Exiguobacteriumsp.DJ2無賴氨酸、精氨酸和鳥氨酸脫羧酶活性，不會將氨基酸分解成相應的生物胺，具有較好的安全性。

2.3.4 硝酸還原酶活性的測定

具有硝酸還原酶的菌株，能將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，進而形成腸毒素和致癌物質(zhì)，危害健康[23]。因此，對菌株硝酸還原酶活性的測定也是菌株安全性評價必不可少的[38]。結果表明，5株菌均沒有硝酸還原酶的產(chǎn)生，不會將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，具有一定的安全性。

3 討論

目前，安全性評價的研究以乳酸菌為主，但是相關的安全性評價方法和體系還不完善。一般都是從耐藥性評價、有害代謝產(chǎn)物評價和動物性實驗幾個方面進行菌株的安全性評估[39]?？股孛舾行詫嶒灲Y果表明5株菌對多種抗生素表現(xiàn)為耐藥。在使用過程中，應防止菌株成為抗生素耐藥基因的來源，對于存在耐藥性的菌株應盡可能地消除其耐藥性。目前，對病原菌耐藥性及耐藥消除的研究較多，而對工業(yè)發(fā)酵菌株的耐藥消除和消除后菌株的特性變化的研究還不夠全面。干酪乳桿菌攜帶的四環(huán)素耐藥基因tetW和林肯酰胺克林霉素耐藥基因lnuA的耐藥質(zhì)粒消除后，菌株耐藥性消失但益生特性得到保留[40]。采用十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）結合高溫培養(yǎng)對乳酸菌的耐藥性質(zhì)粒進行消除，消除后乳酸菌的生長速度、產(chǎn)酸能力以及后儲過程中的存活率均受到了影響[41]。進一步研究產(chǎn)酶菌株的發(fā)酵特性及降解有機高分子化合物的作用在消除耐藥性后的變化，可為發(fā)酵企業(yè)獲得低耐藥性或非轉移耐藥性的工業(yè)菌株提供理論保證。溶血性細菌的侵入會引起溶血現(xiàn)象，從而導致敗血癥。除Bacillussp.AL1具有溶血性，其他4株菌都沒有溶血性，不會引起溶血現(xiàn)象。Bacillussp.AL1使用時應防止接觸傷口或進入人體。氨基酸脫羧酶能夠將氨基酸脫羧還原成生物胺，造成安全隱患。該酶的產(chǎn)生需要酸性條件，并且氨基酸的分解需要在厭氧條件下進行。5株菌中僅Exiguobacteriumsp.DJ2的氨基酸脫羧酶活性試驗結果為陰性，對氨基酸脫羧酶活性試驗陽性的菌株，在其應用時可對pH進行調(diào)節(jié)，避免菌株處于酸性條件，并保證通氧量，防止氨基酸分解。硝酸還原酶可將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，5株菌株均沒有檢測到硝酸還原酶活性。由菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶和產(chǎn)膠原蛋白酶活力測定結果可知，5株菌具有進一步發(fā)酵產(chǎn)酶及降解高分子化合物產(chǎn)生有應用價值的小分子物質(zhì)的潛力。

4 結論

該研究對來自環(huán)洞庭湖水系的3個淡水湖漁場的表層底泥樣品中的2株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株及3株產(chǎn)膠原蛋白酶菌株的酶活進行分析，結果表明菌株具有產(chǎn)幾丁質(zhì)酶和膠原蛋白酶的能力，經(jīng)16S rRNA序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹分析，2株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株AL1和BM1分別被鑒定為芽孢桿菌（Bacillussp.）和假單胞菌（Pseudomonassp.）；3株產(chǎn)膠原蛋白酶菌株ALJ1、BMJ1及DJ2分別被鑒定為Pseudomonassp.、Pseudomonassp.和微小桿菌（Exiguobacteriumsp.）。安全性試驗結果表明，菌株BMJ1、DJ2分別對4種和6種抗生素高度敏感，其余菌株僅對1種抗生素高度敏感；除菌株AL1外，其他4株菌無溶血性；除菌株DJ2外，其他4株菌具有氨基酸脫羧酶活性；5株菌均無硝酸還原酶活性。由此可知，菌株BM1和DJ2是降解有機高分子化合物的較安全菌株，更適合于進一步應用。