大鯢肝肽酒制備及其對小鼠酒后肝臟保護作用研究

曾允灝，蘇 文，2，鄭小莉，王景華，陳德經，2

（1.陜西理工大學 生物科學與工程學院，陜西 漢中 723001；2.陜西理工大學 陜西省資源生物重點實驗室，陜西 漢中 723001；3.漢中市科技資源統籌中心，陜西 漢中 723001）

我國具有傳統深厚的酒文化，酒在生活中成為不可缺少的飲品。乙醇進入機體后，10%由腎臟和肺排出，90%在肝臟內進行代謝和分解[1]，在肝臟中由乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）氧化為乙醛，乙醛經乙醛脫氫酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）氧化為乙酸進入三羧酸循環(huán)，最終代謝為二氧化碳和水[2]。飲酒過量會產生酒精中毒，長期嗜酒會形成酒精依賴癥[3]，長期飲酒誘發(fā)肝硬化以及肝癌[4]，還會引起肥胖、高血脂癥、動脈硬化等[5]。世界衛(wèi)生組織指出，酒精性肝損傷已成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝臟疾病[6]。如何降低飲酒對肝臟的損傷成為當前研究的熱點問題。研究表明，生物小分子肽具有較高的抗氧化、抗腫瘤、抗衰老活性、易吸收[7]，促進乙醇脫氫酶及乙醛脫氫酶活性，能加快酒精代謝速率，減少代謝產物對肝組織的損害作用[8]。LI G M等[9]研究發(fā)現，玉米肽具有抗氧化、抗高血壓、保肝、促進酒精代謝等功能；陳頔等[10]用魚皮低聚肽灌胃酒精性肝損傷小鼠，發(fā)現魚皮低聚肽對酒精性肝損傷小鼠具有保護作用。

大鯢（Andrias davidianus）屬大型兩棲綱、有尾目、隱鰓鯢科，在地球上有3.5億年生活史，具有極強的耐饑能力和抗逆境能力[11]。大鯢肝臟占體質量的3%～5%，是大鯢加工的主要副產物[12]。大鯢肝臟具有較高營養(yǎng)價值，含有豐富的蛋白質和酶[13]，富含不飽和脂肪酸[14]，但大鯢肝臟腥味重，難以加以利用，多作為廢棄物直接丟棄，將肝臟制備小分子肽，提高大鯢附加值[15]。近年來，將多肽與酒結合制備多肽保健酒是多肽利用的重要途徑，關于多肽酒的研究報道越來越多，如植物源的多肽酒：山藥肽酒[16]、檸檬肽酒[17]，蠶豆肽酒[18]等；動物物源多肽酒：海參肽酒[19]、甲魚肽酒[20]、鹿茸血肽酒[21]、大鯢肽酒[22]、牡蠣肽酒[23]等，但是以大鯢肝肽（giant salamander liver peptide，GSLP）制備的大鯢肝肽酒研究較少。

本研究以大鯢肝臟與白酒為原料制備大鯢肝肽酒，通過酶解法制備肝肽，對其體外乙醇脫氫酶（ADH）激活活性、體外抗氧化活性和溶解度進行測定，并測定大鯢肝肽酒對小鼠肝臟乙醇脫氫酶（ADH）和乙醛脫氫酶（ALDH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力與還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）、丙二醛（malonaldehyde，MDA）、甘油三酯（triglyceride，TG）含量及血清中谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）活性的影響，以期探討大鯢肝肽酒對酒后小鼠的肝臟保護作用，為大鯢肝臟高值化利用和多肽酒的開發(fā)提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

大鯢肝臟：陜西鯢生元科技有限公司；53%vol醬香型白酒：貴州茅臺酒廠保健酒業(yè)有限公司；無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級雄性昆明種小鼠：4周齡，體質量（22±2）g，實驗動物使用許可證號SCXK（陜）2018-001，由西安交通大學醫(yī)學院部實驗動物中心提供，飼養(yǎng)條件為溫度（22±2）℃，濕度50%～60%，晝夜交替。

1.1.2 試劑

風味蛋白酶（酶活40000U/g）、胰蛋白酶（酶活4000U/g）：廣西南寧龐博生物工程有限公司；碳酸氫鈉、檸檬酸：天津市富宇精細化工有限公司；乙醇脫氫酶（ADH）（1.0 U/mL）：美國Sigma公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷：上海源葉生物科技有限公司；硫酸亞鐵、水楊酸：天津市北聯精細化學品開發(fā)有限公司；鐵氰化鉀：成都市科龍化學試劑廠；三氯乙酸：上海精析化工科技有限公司；三氯化鐵：天津市福晨化學試劑廠；維生素C（vitamin C，VC）：成都市科龍化工試劑廠；二喹林甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法微量蛋白定量試劑盒、血乙醇（blood ethanol，ALC）試劑盒、谷丙轉氨酶（ALT）試劑盒、谷草轉氨酶（AST）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、還原型谷胱甘肽（GSH）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、甘油三酯（TG）試劑盒、乙醇脫氫酶（ADH）試劑盒、乙醛脫氫酶（ALDH）試劑盒：南京建成生物工程研究所。本研究所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

DK-98-Ⅱ恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；TGL-20M冷凍離心機：湖南湘儀離心機儀器有限公司；LC-800低速臺式離機：科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；Xinyi-100F真空冷凍干燥機：寧波新藝超聲設備有限公司；Epoch 2酶標儀：美國BioTek公司；UV-1750紫外-可見分光光度計：日本島津儀器公司；PE28型pH計：梅特勒-托利多儀器有限公司；陶瓷膜過濾機、納濾膜過濾機及超濾膜（截留分子質量3 000 Da）：南京艾宇琦膜科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大鯢肝肽酒的加工工藝流程及操作要點

操作要點：

原料預處理：流水清洗大鯢肝臟，按料液比1∶5（g∶mL）添加0.9%生理鹽水浸泡30 min，1%酵母發(fā)酵液（按大鯢肝臟質量1%酵母粉和2%白砂糖在37 ℃活化1 h）浸泡30 min，清洗瀝干，絞碎制成肝糜。

酶解：在肝糜中加入1%的風味蛋白酶，以肝糜和蒸餾水的料液比為1∶1（g∶mL）添加蒸餾水、于pH 7.0、53 ℃條件下攪拌酶解4 h；再添加0.5%胰蛋白酶，于pH 8.0、37 ℃條件下酶解3 h；滅酶活（95 ℃、10 min）。

離心、脫色脫腥：酶解液離心（5 500 r/min、15 min），去除上清液中油脂及沉淀，收集上清液。在上清液中加入1%活性炭，50 ℃、0.08 Pa下抽真空，攪拌脫色脫腥1 h。

過濾、超濾：用過壓濾機脫活性炭后陶瓷膜過濾，得到分子質量＜10 000 Da多肽的酶解液。用截留分子質量3 000 Da的超濾膜對其進行超濾分級分離，得到3種不同分子質量段的多肽液。

冷凍干燥：在溫度-50～20 ℃、真空度13～40 Pa條件下，經冷凍干燥后制得大鯢肝肽粉：GSLP-Ⅰ（分子質量＞10 000 Da）、GSLP-Ⅱ（分子質量3 000～10 000 Da）、GSLP-Ⅲ（分子質量＜3 000 Da）。

調配：于1%大鯢肝肽粉中，按料液比1∶100（g∶mL）添加53%vol醬香型白酒，即得大鯢肝肽酒。

1.3.2 不同分子質量大鯢肝肽體外ADH激活活性

大鯢肝肽ADH激活率參考劉鵬[24]的方法進行測定，其計算公式如下：

式中：A1為樣品反應初始的OD340nm值；A2為樣品反應結束的OD340nm值。

1.3.3 不同分子質量大鯢肝肽體外抗氧化活性測定

DPPH自由基（DPPH·）清除率的測定[25]：將不同分子質量肝肽加蒸餾水溶解，配制樣品質量濃度為10.0 mg/mL。取3 mL樣品溶液于試管中，加入3 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液，振蕩混勻后避光放置30 min，在波長517 nm處測吸光度值，用蒸餾水調零，抗壞血酸溶液（0.5 mg/mL）作陽性對照。平行測定吸光度值3次。DPPH·清除率計算公式如下：

式中：A0為蒸餾水-DPPH溶液的吸光度值；A1為樣品-DPPH溶液的吸光度值；A2為樣品-乙醇溶液的吸光度值。

羥自由基（·OH）清除率的測定[26]：將不同分子質量肝肽加蒸餾水溶解，配制樣品質量濃度為10.0mg/mL。取2mL樣品溶液于試管中，加2 mL 9 mmol/L FeSO4溶液、2 mL 9 mmol/L水楊酸乙醇溶液，再加2 mL 9 mmol/L H2O2溶液，于37 ℃水浴條件下加熱30 min，待冷卻后離心。以蒸餾水作為空白對照，抗壞血酸溶液（0.5 mg/mL）作陽性對照。在波長510 nm處測定吸光度值，實驗重復3次，·OH的清除率計算公式如下：

式中：A0為蒸餾水-水楊酸乙醇吸光度值；A1為樣品-水楊酸乙醇溶液吸光度值；A2為加入樣品溶液但不加水楊酸乙醇溶液吸光度值。

超氧陰離子自由基（O-2·）清除率測定[27]：采用鄰苯三酚自氧化法測定，將不同分子質量肝肽加蒸餾水溶解，配制樣品質量濃度為10.0 mg/mL。取1 mL樣品溶液于試管中，各加入4.5 mL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液和0.1 mL 3 mmol/L鄰苯三酚溶液充分混勻，于25 ℃水浴反應10 min，加入1 mL 8 mmol/L HCl溶液終止反應。在波長320 nm處測定吸光度值，以蒸餾水作為空白對照，抗壞血酸溶液（0.5 mg/mL）作為陽性對照。實驗重復3次，O-2·清除率計算公式如下：

式中：A0為不加樣品溶液，加鄰苯三酚溶液的吸光度值；A1為加樣品溶液和鄰苯三酚溶液的吸光度值；A2為加樣品溶液但不加鄰苯三酚溶液的吸光度值。

總還原力的測定[28]：將不同分子量肝肽加蒸餾水溶解，配制樣品質量濃度為10.0 mg/mL。取樣品溶液2 mL，加入2 mL 0.2 mol/L pH 6.6磷酸鹽緩沖液和2 mL 1%鐵氰化鉀溶液充分混勻后，于50 ℃水浴條件下靜置20 min后，加入10%三氯乙酸2 mL，充分混合，4 000 r/min離心10 min，取2.5 mL上清液，再加入2 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵后混勻，室溫條件下靜置10 min，在波長700 nm處測定吸光度值，實驗重復3次，以蒸餾水作為空白對照，抗壞血酸溶液（0.5 mg/mL）作為陽性對照。

1.3.4 不同分子質量大鯢肝肽溶解度的測定

稱取0.250 0 g 3個不同分子質量大鯢肝肽粉置入50 mL于離心管中，再分別加入酒精度為12%vol、35%vol、45%vol、53%vol的醬香型白酒25 mL搖勻，室溫靜置7 d后4 000 r/min離心15 min，上清液倒入坩鍋置于105 ℃烘箱，烘至恒質量[29]，計算溶解度，其計算公式如下：

式中：m為坩鍋的質量，g；M為坩鍋和溶解肽粉的質量，g；w為肽粉的質量，g。

1.3.5 大鯢肝肽酒的動物實驗

遵循實驗動物倫理規(guī)程和標準，取昆明種雄性小鼠45只，經7 d適應期，按隨機數字標法分3組，即空白對照組、白酒組、大鯢肝肽酒組，每組15只?？瞻讓φ战M小鼠每日灌胃生理鹽水（0.12 mL/10 g體質量），白酒組小鼠每日灌胃53%vol醬香型白酒（0.12 mL/10 g體質量）[30]，大鯢肝肽酒組小鼠每日灌胃最適條件制備的大鯢肝肽酒（0.12 mL/10 g體質量），連續(xù)灌胃10 d。

1.3.6 樣品的采集及處理

末次灌胃2 h后從每個實驗組中各取3只小鼠，眼球取血（4 ℃、3 000 r/min離心15 min，取上層血清保存于-80 ℃冰箱中），解剖小鼠取肝臟，在4 ℃的生理鹽水中反復沖洗，濾紙吸干后稱取肝臟質量，剪取一部分肝組織，用10%甲醛溶液固定；剩余肝組織-80 ℃冰箱保存，其他小鼠用于血液和肝臟的生化指標檢測。在實驗期間，每日固定時間對小鼠灌胃前進行稱量并記錄，及時調整給酒灌胃體積，觀察小鼠有無死亡、精神狀態(tài)、活動能力等。

1.3.7 生化指標的測定

（1）血液乙醇含量

根據血乙醇試劑盒的說明書測定小鼠血液乙醇含量。

（2）肝臟生化指標

以9倍肝組織體積加入預冷生理鹽水，冰浴條件下勻漿制成10%肝組織勻漿，離心（3 000 r/min、4 ℃、20 min），取上清液，按照試劑盒的說明書測定小鼠肝臟SOD活力、GSH、MDA、TG含量，以及乙醇代謝相關酶ADH、ALDH活力。

（3）血清生化指標

根據試劑盒的說明書測定小鼠血清的谷丙轉氨酶（ALT）和谷草轉氨酶（AST）活力。

1.3.8 數據分析

采用OriginPro 2018軟件進行繪圖，SPSS 20.0軟件進行數據統計分析，P＜0.05，表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同分子質量肝肽對ADH激活率的影響

ADH是一種含鋅金屬蛋白酶，主要存在于肝臟，是酒精代謝最主要的參與酶和代謝酶，不同分子質量的多肽對ADH激活率不同[31]。不同分子質量肝肽對體外ADH的激活作用見圖1。

圖1 不同分子質量肝肽對體外乙醇脫氫酶的激活作用Fig.1 Activation of liver peptides with different molecular mass on alcohol dehydrogenase in vitro

由圖1可知，在相同質量濃度下，不同分子質量的肝肽對體外ADH激活作用具有顯著性差異（P＜0.05），對ADH激活率從大到小排序為：GSLP-Ⅲ＞GSLP-Ⅰ＞GSLP-Ⅱ，其中，GSLP-Ⅲ對ADH激活率最高，達83.53%，GSLP-Ⅰ激活率為73.47%，GSLP-Ⅱ激活率最低，為61.53%。結果表明，大鯢肝肽對體外ADH的激活作用并不受分子質量大小的影響，這與張帥[32]的研究結果一致。

2.2 不同分子質量肝肽體外抗氧化活性測定

不同分子質量肝肽的體外抗氧化活性測定結果見表1。

表1 不同分子質量肝肽體外抗氧化活性Table 1 Antioxidant activity in vitro of liver peptides with different molecular mass

由表1可知，VC的抗氧化能力最強，不同分子質量肝肽對DPPH·、·OH和均具有較強清除能力，按抗氧化能力大小對肝肽樣品排序為：GSLP-Ⅲ＞GSLP-Ⅱ＞GSLP-Ⅰ。其中，GSLP-Ⅲ肝肽對DPPH·、·OH和清除率均達到了83.50%以上，顯著高于其他肝肽組分；GSLP-Ⅲ肝肽還原力顯著高于其他肝肽組分（P＜0.05）。在相同質量濃度下，肝肽分子質量越小，體外抗氧化能力越強，這是因為疏水性氨基酸和芳香族氨基酸含量增加，具有抗氧化性的氨基酸增加[33]。

2.3 大鯢肝肽的溶解度

不同分子質量肝肽在不同酒精度白酒中的溶解度見表2。

表2 不同分子質量肝肽在不同酒精度白酒中的溶解度Table 2 Solubility of liver peptides with different molecular mass in Baijiu with different alcohol content%

由表2可知，不同分子質量肝肽在不同酒精度白酒中的溶解度不同，在同一分子質量肝肽條件下，隨著酒精度的增加，溶解度逐漸降低。在同一酒精度的條件下，分子質量小的肝肽在白酒中的溶解度顯著高于分子質量大的肝肽（P＜0.05）。GSLP-Ⅲ肝肽在12%vol～53%vol酒精中溶解度均＞94.00%。不同分子質量肝肽，在不同酒精度中溶解度不同，究其原因可能是，肽的分子質量大小、肽的結構及端基極性基團決定了肽在酒中的溶解度[34]。

2.4 大鯢肝肽酒對小鼠血液乙醇含量及肝臟代謝酶活性的影響

飲酒后，大部分的酒精經胃腸道進入血液，使血液中乙醇含量升高，在60 min左右達到最高[35]，最終進入肝臟進行分解代謝，酒精分解代謝與肝臟中的乙醇脫氫酶（ADH）和乙醛脫氫酶（ALDH）的活力有密切關系。小鼠飲酒后2 h血乙醇含量及肝臟中的乙醇脫氫酶（ADH）和乙醛脫氫酶（ALDH）的活性見表3。

表3 大鯢肝肽酒對小鼠血乙醇含量及肝臟代謝酶活性的影響Table 3 Effect of Andrias davidianus liver peptide wine on ethanol concentration of blood and metabolic enzyme activity of mouse liver

由表3可知，與空白對照組相比，白酒組、肝肽酒組的ADH活性分別降低55.77%、26.33%，ALDH活性分別降低25.33%、5.29%，白酒組、肝肽酒組ADH活力顯著低于空白對照組（P＜0.05），肝肽酒組ALDH活力與空白組無顯著差異（P＞0.05）；與白酒組相比，肝肽酒組的ADH和ALDH活性分別顯著升高66.58%、26.84%（P＜0.05），血液乙醇含量顯著降低14.29%（P＜0.05），說明大鯢肝肽酒在一定程度上具有激活ADH和ALDH的活性，可以加速酒精代謝，降低血乙醇含量。

2.5 大鯢肝肽酒對小鼠肝臟氧化應激代謝酶活性的影響

氧化應激是體內氧化與抗氧化作用失衡，是由自由基在體內產生的一種負面作用。長期大量飲酒后，酒精在肝組織代謝會超過肝臟的正常生理代謝能力，使肝組織發(fā)生脂質過氧化，降低谷胱甘肽（GSH）含量和超氧化物歧化酶（SOD）酶活，增加丙二醛（MDA）和甘油三脂（TG）含量[36]。大鯢肝肽酒對小鼠肝臟氧化應激謝酶活性的影響見表4。

表4 大鯢肝肽酒對小鼠肝臟氧化應激代謝酶活性的影響Table 4 Effect of Andrias davidianus liver peptide wine on oxidative stress metabolic enzyme activity of mouse liver

由表4可知，與空白組相比，白酒組、肝肽酒組的SOD活性分別顯著降低30.78%、19.82%（P＜0.05），GSH含量分別顯著降低47.58%、28.23%，MDA含量分別顯著升高76.03%、45.45%（P＜0.05），TG含量分別顯著升高140.00%、76.67%（P＜0.05）。與白酒組相比，肝肽酒組的SOD活力和GSH含量分別顯著升高15.84%、36.92%（P＜0.05），MDA、TG含量分別顯著降低17.37%、26.39%（P＜0.05），說明大鯢肝肽酒在一定程度上可提高小鼠肝臟SOD活力和GSH含量，降低脂質過氧化物MDA和TG含量，減輕肝臟的氧化應激反應。

2.6 大鯢肝肽酒對小鼠血清轉氨酶指標的影響

谷丙轉氨酶（ALT）和谷草轉氨酶（AST）是評價肝受損的重要指標[37]，肝細胞發(fā)生異常時，可引起炎癥反應和肝細胞壞死，細胞膜的通透性增加，使肝細胞ALT和AST進入血液。大鯢肝肽酒對小鼠血清ALT和AST活性的影響見圖2。

由圖2可知，與空白對照組相比，白酒組、肝肽酒組小鼠血清中ALT活性分別顯著升高了107.33%、62.09%（P＜0.05），AST活性分別顯著升高108.46%、58.24%（P＜0.05），白酒組和肝肽酒組小鼠血清中ALT和AST的活性均顯著高于空白對照組（P＜0.05）；與白酒組相比，肝肽酒組小鼠血清中ALT和AST的活性分別顯著降低21.82%、23.61%（P＜0.05）。說明大鯢肝肽酒在一定程度上能降低灌胃酒精小鼠血清中ALT和AST活性。

圖2 大鯢肝肽酒對小鼠血清谷丙轉氨酶（A）和谷草轉氨酶（B）活性的影響Fig.2 Effect of Andrias davidianus liver peptide wine on alanine aminotransferase (A) and aspartate aminotransferase (B)activity of mouse serum

3 結論

本研究以大鯢肝臟和白酒為原料制備大鯢肝肽酒。利用酶解法和膜分離法制備了不同分子質量的肝肽，研究了其體外抗氧化活性及其在不同酒精度白酒中的溶解度，并測定大鯢肝肽酒對小鼠肝臟損傷相關的各項生化指標的影響。結果表明，分子質量＜3 000 Da（10 mg/mL）的大鯢肝肽體外對ADH激活率最高，為83.53%，對DPPH·、·OH和清除率均＞83.50%，且具有較強的還原力（吸光度值0.440）。分子質量越小，在白酒中溶解度越大，其中分子質量＜3 000 Da的肝肽溶解度均達到94%以上。與灌胃白酒組小鼠相比，大鯢肝肽酒組小鼠肝臟ADH、ALDH、SOD活力及GSH含量顯著提高（P＜0.05），分別提高66.58%、26.84%、15.84%，36.92%，肝臟MDA、TG含量顯著降低（P＜0.05），分別降低17.37%、26.39%，血清ALT和AST活性顯著降低（P＜0.05），分別降低21.82%、23.61%。大鯢肝肽酒能增強機體抗氧化能力，減輕肝臟的氧化應激反應；提高乙醇、乙醛代謝酶的活性，降低乙醇對肝細胞損傷。