秸稈纖維素降解菌的分離篩選、復(fù)合菌系構(gòu)建及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

宋 雨，白紅娟，胡錦俊，趙啟超，韓群英，葉宇晗

（中北大學(xué) 環(huán)境與安全工程學(xué)院，山西 太原 030051）

隨著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，糧食產(chǎn)量大幅提高，導(dǎo)致秸稈數(shù)量增多，出現(xiàn)秸稈資源供給過剩的問題[1]。秸稈的主要成分為纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等，在自然條件下難以降解[2]。纖維素含量約占植物干質(zhì)量的45%左右[3]，秸稈中纖維素的降解成為了秸稈處理的關(guān)鍵。與傳統(tǒng)的物理化學(xué)降解方式相比，生物降解具有條件溫和、成本低、有害副產(chǎn)物少等優(yōu)點[4]。因此，利用微生物降解秸稈成為國內(nèi)外該領(lǐng)域研究熱點。

目前，纖維素降解菌來源大多為腐敗的樹葉、昆蟲腸道及反芻動物的糞便等，從山西老陳醋源中篩選產(chǎn)纖維素酶微生物的報道較少。山西老陳醋作為我國“四大名醋”之一，選用優(yōu)質(zhì)高粱、大麥、豌豆等五谷釀造而成[5]，其釀造環(huán)境中具有豐富的微生物資源，是選育高效發(fā)酵菌株的天然寶庫。近年來，關(guān)于單菌株降解秸稈纖維素的研究較多，但單菌株存在產(chǎn)酶單一，難以破壞木質(zhì)素的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)導(dǎo)致降解酶接觸纖維素困難等問題，無法達到秸稈纖維素的高效降解[6]。因此，越來越多的學(xué)者開始利用復(fù)合菌系的協(xié)同作用提高秸稈纖維素降解率。李靜等[7]從土壤中分離篩選出由類芽孢桿菌屬（Paenibacillussp.）、芽孢桿菌屬（Bacillussp.）、不動桿菌屬（Acinetobactersp.）以及鏈霉菌屬（Streptomycessp.）組成的復(fù)合菌系對纖維素的降解能力優(yōu)于其中任何單一菌株；CHU X D等[8]將黃孢原毛平革菌（Phane-rochaete chrysosporium）、變色栓菌（Trametes versicolor）和糙皮側(cè)耳（Pleurotus ostreatus）組合構(gòu)建成復(fù)合菌系，其對纖維素、半纖維素以及木質(zhì)素都具有高效降解能力；GONG X J等[9]將篩選出的3株鏈霉菌（Streptomycessp.）復(fù)合后分解能力明顯增強，其中菌株G1、G2對纖維素、半纖維素分解能力較強；菌株G3對木質(zhì)素分解能力較強。研究表明，與單菌株相比，復(fù)合菌系對于纖維素、半纖維素以及木質(zhì)素的降解具有明顯優(yōu)勢，且復(fù)合菌系多由真菌和放線菌組成，細菌組合構(gòu)建的復(fù)合菌系的研究報道較少[10-11]，尤其對復(fù)合菌系產(chǎn)酶條件優(yōu)化的研究相對不足。細菌具有來源廣、種類多、生長快等特點[12]。因此，篩選高效的秸稈纖維素降解細菌構(gòu)建復(fù)合菌系具有重要意義。

本研究以羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na）為唯一碳源，采用剛果紅染色法及濾紙條崩解法從山西老陳醋源中分離篩選纖維素降解菌，通過形態(tài)觀察及分子生物學(xué)技術(shù)對其進行菌種鑒定，并以濾紙酶活性為篩選指標(biāo)，對無拮抗作用的菌株進行復(fù)配構(gòu)建高效復(fù)合菌系。以濾紙酶活性為響應(yīng)值，采用單因素試驗及Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合菌系的產(chǎn)酶條件，并評估其在最佳條件下對不同秸稈的降解能力，以期證實該復(fù)合菌系在秸稈降解方面的實用性，為高效降解秸稈復(fù)合菌劑的研制和開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來源

醋糟、醋醅：山西省太原市清徐縣某醋廠；玉米秸稈、小麥秸稈、高粱秸稈、大豆秸稈：河南省商丘市柘城縣某農(nóng)田；水稻秸稈：浙江省某農(nóng)田。秸稈用無菌水沖洗后干燥，研磨過40目篩，置于陰涼干燥處儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑

CMC-Na（分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；酒石酸鉀鈉、剛果紅（均為分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；苯胺藍（分析純）：生工生物工程（上海）股份有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

CMC-Na培養(yǎng)基[13]：CMC-Na 10 g，KH2PO42.5 g，Na2HPO41.5 g，蛋白胨2.5 g，NH4NO31.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，酵母浸粉1.0 g，蒸餾水1 L，pH自然。

篩選培養(yǎng)基[13]：CMC-Na 10 g，KH2PO42.5 g，Na2HPO41.5 g，蛋白胨2.5 g，瓊脂20 g，NH4NO31.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，酵母浸粉1.0 g，蒸餾水1 L，pH自然。

LB培養(yǎng)基[14]：胰蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 L，pH 7.0。

赫奇遜無機鹽培養(yǎng)基[15]：KH2PO41.0 g，NaCl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaNO32.5 g，CaCl20.1 g，F(xiàn)eCl30.01 g，蒸餾水1 L，pH自然。

苯胺藍培養(yǎng)基[16]：胰蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g，瓊脂粉20 g，苯胺藍0.4 g，蒸餾水1 L，pH自然。

以上培養(yǎng)基均在121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

BXM-30R型立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HZ-9511KB型臺式恒溫搖床：太倉市科教器材廠；SW-CJ-1F型潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；MGC-350HP-2型人工氣候箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；UV-2100型紫外可見分光光度計：上海尤尼柯儀器有限公司；HC-3018型高速離心機：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；ABI-2720型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國Applied Biosystems公司；EM GP2共聚焦顯微鏡：德國徠卡公司。

1.3 方法

1.3.1 纖維素降解菌的分離純化

將10 g醋糟、醋醅樣品加入90 mL無菌水中，35 ℃振蕩2 h，混勻。取5 mL上清液于CMC-Na培養(yǎng)基中，35 ℃、180 r/min培養(yǎng)2 d，重復(fù)3～4次。取富集液按10倍系列梯度稀釋至10-7，取稀釋度為10-1、10-3、10-5、10-7的稀釋液涂布于篩選培養(yǎng)基上，35 ℃條件下培養(yǎng)3 d，挑取不同形態(tài)的菌落重復(fù)劃線分離多次得到單菌株，編碼，并置于LB斜面培養(yǎng)基于4 ℃保存。

1.3.2 纖維素降解菌的篩選

初篩：采用剛果紅染色法[17]初篩。將分離得到的單菌株點種于篩選培養(yǎng)基上，35 ℃倒置培養(yǎng)3 d，采用1 mg/mL剛果紅溶液染色后，采用l mol/L NaCl溶液脫色，測量透明圈直徑和菌落直徑，并計算水解值，水解值=透明圈直徑/菌落直徑。

復(fù)篩：選取水解值較大的菌株使用濾紙條崩解法[18]進行復(fù)篩。在40 mL赫奇遜無機鹽培養(yǎng)基中加入2條1 cm×6 cm的濾紙條和2 mL菌液，35 ℃、180 r/min培養(yǎng)7 d，以添加等量無菌水作為空白對照，觀察濾紙崩解情況。同時，采用苯胺藍脫色法[16]檢測篩選出的菌株是否具有木質(zhì)素降解能力。

1.3.3 纖維素降解菌的鑒定

形態(tài)學(xué)觀察：將篩選得到的菌株劃線接種于LB培養(yǎng)基，35 ℃培養(yǎng)3 d后，觀察菌落形態(tài)，使用共聚焦顯微鏡對菌體形態(tài)進行觀察。

分子生物學(xué)鑒定：參照曾林等[19]的方法提取篩選菌株的基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），以其為模板，采用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'）PCR擴增16S rDNA基因序列。PCR擴增體系：DNA（20 ng/μL）1.0 μL，10×Buffer（含2.5 mmol/L Mg2+）5.0 μL，Taq聚合酶（5 U/μL）1.0 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（10 mmol/L）1.0 μL，引物27F（10 μmol/L）1.5 μL，引物1492R（10 μmol/L）1.5 μL，雙蒸水（ddH2O）39.0 μL。PCR擴增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共循環(huán)35次；72 ℃終延伸7 min。菌株的16S rDNA測序由上海派森諾生物科技有限公司完成。

將測序結(jié)果提交至美國國立生物技術(shù)信息中心（nationalcenterforbiotechnologyinformation，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中，采用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進行同源性比對搜索，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA基因序列，利用MEGA 11.0軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[20]。

1.3.4 生長曲線的測定

采用比濁法[21]測定單菌株生長曲線。將過夜培養(yǎng)的菌液以5%（V/V）的接種量接種于CMC-Na培養(yǎng)基中，于35 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)至菌的平穩(wěn)期，每隔2 h取樣，采用紫外分光光度計在波長600 nm處測定吸光度值（OD600nm），以培養(yǎng)時間（x）為橫坐標(biāo)，OD600nm值（y）為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。

1.3.5 復(fù)合菌系的構(gòu)建

參照嵇少澤等[22]的實驗方法判斷菌株間的拮抗關(guān)系。根據(jù)郝鵬等[23]方法制備菌懸液，將無拮抗作用的單菌株菌懸液（OD600nm值=0.5）以等體積隨機配對的方式按5%（V/V）接種量接種至CMC-Na培養(yǎng)基中，35 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)5 d，發(fā)酵液經(jīng)8 000 r/min離心10 min后，取上清液，采用DNS法[18]測定濾紙酶活性，選取酶活性最高的菌株組合進行后續(xù)優(yōu)化試驗。

1.3.6 復(fù)合菌系產(chǎn)酶發(fā)酵條件優(yōu)化

單因素試驗：初始發(fā)酵條件為初始pH 6.5、接種量5%、發(fā)酵溫度35 ℃。采用控制變量法，在單一條件變量下分別考察初始pH值（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0）、接種量（1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%、15%）、發(fā)酵溫度（25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃）對于復(fù)合菌系濾紙酶活性及OD600nm值的影響。

響應(yīng)面試驗：在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以濾紙酶活性（Y）為響應(yīng)值，選取初始pH值（A）、接種量（B）、發(fā)酵溫度（C）為自變量，利用軟件Design Expert 13.0中的Box Behnken模型設(shè)計3因素3水平響應(yīng)面試驗，試驗因素及水平見表1。

表1 復(fù)合菌系產(chǎn)酶發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for enzyme production fermentation conditions optimization of composite microbial system

1.3.7 秸稈降解效果評價

按9%（V/V）接種量將單菌株菌懸液與復(fù)合菌液分別接種于以10 g/L不同秸稈為唯一碳源的赫奇遜無機鹽培養(yǎng)基中，以添加等量無菌水為空白對照，40 ℃、180 r/min培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)后取出殘渣用無菌水沖凈，80 ℃烘干至恒質(zhì)量，采用質(zhì)量損失法計算秸稈降解率，其計算公式如下：

式中：η為降解率，%；W0為對照秸稈殘渣干質(zhì)量，g；W為降解后秸稈殘渣干質(zhì)量，g。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

采用Origin 2021軟件繪圖，利用Design-Expert 13.0軟件進行響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)分析，每組試驗重復(fù)3次，取均值，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素降解菌的分離篩選

采用富集、分離培養(yǎng)后從醋糟和醋醅樣品中共分離得到15株單菌株，通過剛果紅染色法初篩及濾紙條崩解法復(fù)篩得到3株具有較高纖維素酶活性的菌株，分別命名為J1、J2、J3，其剛果紅染色結(jié)果及濾紙條崩解情況見表2。由表2可知，菌株J1、J2、J3的水解值依次為5.33、4.00、8.33，培養(yǎng)7 d后均能將溶液中的濾紙條降解為白色糊狀，表明篩選出的3株菌均具有較好的纖維素降解能力。秸稈中具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的木質(zhì)素緊緊包圍著纖維素，導(dǎo)致纖維素降解酶難以接觸纖維素，因此兼具木質(zhì)素降解能力的纖維素降解菌能夠更好的降解秸稈中的纖維素[24]。進一步采用苯胺藍脫色法檢測3株菌株的木質(zhì)素降解能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有菌株J2具有木質(zhì)素降解能力，其對木質(zhì)素的降解效果見圖1。由圖1可知，菌株J2在苯胺藍培養(yǎng)基上表現(xiàn)出明顯的脫色效果，表明其具有良好的木質(zhì)素降解能力。

表2 篩選菌株的剛果紅染色結(jié)果及濾紙條崩解情況Table 2 Congo red staining results and filter paper strips disintegration situation of the screened strains

圖1 菌株J2培養(yǎng)前（a）、后（b）的苯胺藍脫色效果Fig.1 Aniline blue decolorization effect of strain J2 before (a) and after incubation (b)

2.2 纖維素降解菌的鑒定

2.2.1 形態(tài)觀察

菌株J1、J2、J3的形態(tài)學(xué)特征見圖2。由圖2可知，菌株J1、J2、J3的細胞均呈桿狀，端圓。培養(yǎng)3 d后，菌株J1呈半透明圓形菌落，邊緣粗糙且有褶皺透明邊；菌株J2呈不透明乳白色，表面隆起有同心圓，邊緣光滑；菌株J3呈較小的圓形菌落，邊緣粗糙。根據(jù)菌體形態(tài)初步判斷菌株J1、J2、J3均為桿菌。

圖2 菌株J1、J2及J3的細胞（a）及菌落（b）形態(tài)Fig.2 Cell (a) and colony (b) morphology of strains J1,J2 and J3

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

基于16S rDNA序列構(gòu)建菌株J1、J2、J3的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。由圖3可知，菌株J1、J2、J3分別與燦爛類芽胞桿菌（Paenibacillus lautus）E7593-69、千葉類芽胞桿菌（Paenibacillus chibensis）JCM9905 16S、窖泥類芽胞桿菌（Paenibacillus vini）LAM0504 16S聚于一支，親緣關(guān)系最近。結(jié)合形態(tài)觀察，最終將菌株J1、J2、J3分別鑒定為燦爛類芽胞桿菌（Paenibacillus lautus）、千葉類芽胞桿菌（Paenibacillus chibensis）和窖泥類芽胞桿菌（Paenibacillus vini）。

圖3 基于16S rDNA基因序列菌株J1、J2和J3的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strains J1,J2 and J3 based on 16S rDNA gene sequences

2.3 菌株的生長曲線

菌株J1、J2、J3的生長曲線見圖4。由圖4可知，菌株J1、J2、J3的生長速度較快且增長趨勢與魯雷震等[25-26]的研究結(jié)果基本保持一致。0～4 h為遲緩期，菌體數(shù)量增長極少；4 h后進入對數(shù)生長期，菌體大量繁殖，且生長速率較快，具有較強的適應(yīng)能力和較高的繁殖速率[27]；10 h后生長速率逐漸降低進入平穩(wěn)期，菌體數(shù)量基本穩(wěn)定。

圖4 菌株J1、J2及J3的生長曲線Fig.4 Growth curve of strains J1,J2 and J3

2.4 最佳復(fù)合菌系的確定

由拮抗試驗可知，3株菌兩兩相交處均無斷開現(xiàn)象，不存在拮抗作用。根據(jù)菌株的篩選試驗及拮抗關(guān)系構(gòu)建了4組復(fù)合菌系，分別為A：J1+J2；B：J1+J3；C：J2+J3；D：J1+J2+J3。不同復(fù)合菌系的濾紙酶活性見圖5。由圖5可知，不同復(fù)合菌系的濾紙酶活性差別較大，其中復(fù)合菌系D的濾紙酶活性明顯高于其他菌系，達到21.98 U/mL，相比單菌株J1、J2和J3，分別提高71.8%、171.1%和62.7%。與單菌株相比，菌株J1、J2和J3構(gòu)建的復(fù)合菌系在纖維素分解方面具有互補能力，能夠提高纖維素的降解效果。最終確定復(fù)合菌系D具有較高的纖維素降解能力，作為最優(yōu)復(fù)合菌系進行后續(xù)的產(chǎn)酶條件研究及秸稈發(fā)酵試驗。

圖5 菌株J1、J2及J3和復(fù)合菌系濾紙酶活性的測定結(jié)果Fig.5 Determination results of filter paper enzyme activity of strains J1,J2 and J3 and composite microbial system

2.5 復(fù)合菌系D產(chǎn)酶條件優(yōu)化

2.5.1 單因素試驗

初始pH值、接種量和發(fā)酵溫度對復(fù)合菌系D濾紙酶活性以及生長速率的影響見圖6。

圖6 復(fù)合菌系D產(chǎn)酶發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗結(jié)果Fig.6 Results of single-factor tests for enzyme production fermentation conditions optimization of composite microbial system D

初始pH值影響細菌的生長繁殖與產(chǎn)物積累[28]。由圖6a可知，復(fù)合菌系D在初始pH 5～9范圍內(nèi)生長良好，表明其具有相對較廣泛的pH適應(yīng)性。隨著初始pH值的升高，濾紙酶活性呈先升高后下降的趨勢，當(dāng)初始pH值達到7.5時，其濾紙酶活性最高，為26.67 U/mL，表明復(fù)合菌系D更適宜在中性環(huán)境中生長、繁殖和代謝，過酸、過堿的環(huán)境都不利于細菌產(chǎn)酶[29]。因此，確定最佳初始pH值為7.5。

由圖6b可知，在接種量＜7%之前，OD600nm值隨接種量的增加而增大，濾紙酶活性呈上升趨勢，表明在該范圍內(nèi)接種量越多，菌體數(shù)量越多，產(chǎn)酶量也隨之增加；當(dāng)接種量為7%～11%之間時，菌體生長良好，且在接種量為9%時，濾紙酶活性最高，為23.25 U/mL；在接種量＞11%之后，OD600nm值減小，濾紙酶活性呈下降趨勢，這可能是由于菌體生長速度過快，培養(yǎng)基內(nèi)含氧量降低，后期營養(yǎng)不足所致[30]。因此，確定最佳接種量為9%。

由圖6c可知，復(fù)合菌系D在25～45 ℃范圍內(nèi)生長良好，表明其具有一定的耐熱性。隨著發(fā)酵溫度的升高，復(fù)合菌系D的濾紙酶活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，分析原因可能是在較低溫度下，細菌生長緩慢，產(chǎn)酶量較低，且酶與底物的結(jié)合能力也較弱[31]；在較高溫度下，容易引起酶蛋白變形，使酶的活性變低。當(dāng)發(fā)酵溫度為40 ℃時，濾紙酶活性最高，為27.21 U/mL。因此，確定最佳發(fā)酵溫度為40 ℃。

2.5.2 響應(yīng)面試驗

響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

表3 復(fù)合菌系D產(chǎn)酶發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface tests for enzyme production fermentation conditions optimization of composite microbial system D

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

續(xù)表

采用Design Expert 13.0對表3數(shù)據(jù)進行多元二次回歸擬合，得到濾紙酶活性（Y）的二次回歸方程：Y=35.06-0.765A-0.27B-0.225C+0.54AB-0.27AC-0.09BC-3.66A2-2.58B2-6.72C2。

由表4可知，模型P＜0.000 1，極顯著；失擬項P=0.283＞0.05，不顯著，表明回歸方程與試驗結(jié)果擬合較好。模型的決定系數(shù)R2=0.998 7，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.997 1，兩者差值＜0.2，變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）＜10%，表明模型的可信度和精確度較高。由表4亦可知，一次項B、C對結(jié)果影響顯著（P＜0.05），一次項A、交互項AB及二次項A2、B2、C2對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），其他項對結(jié)果影響均不顯著（P＞0.05）。

初始pH值、接種量及發(fā)酵溫度間交互作用對濾紙酶活性影響的響應(yīng)曲面及等高線見圖7。由圖7可知，AB的響應(yīng)曲面坡度較陡且顏色變化快，等高線呈橢圓形，較密集，說明AB間的交互作用影響顯著（P＜0.05）；反之，AC、BC間的交互作用不顯著（P＞0.05）。結(jié)果與方差分析結(jié)果一致。

圖7 各因素間交互作用對濾紙酶活性影響的響應(yīng)面及等高線Fig.7 Response surface plots and contour lines of the effects of interactions between each factors on the filter paper enzyme activity

利用Design Expert 13.0對影響濾紙酶活性的各項參數(shù)進行最優(yōu)求解，得出最優(yōu)工藝參數(shù)：初始pH值7.446，接種量8.874%，發(fā)酵溫度39.930 ℃，濾紙酶活性預(yù)測值為35.116 U/mL。為便于實際操作，將最優(yōu)產(chǎn)酶條件調(diào)整為：初始pH值7.4，接種量9%，發(fā)酵溫度40 ℃。在此優(yōu)化條件下進行3次驗證試驗，得到實際酶活性為（35.10±0.04）U/mL，相對誤差＜2%，證實響應(yīng)面預(yù)測的優(yōu)化數(shù)據(jù)可靠。

2.6 秸稈降解率測定

3株單菌株以及復(fù)合菌系D對水稻秸稈、玉米秸稈、小麥秸稈、大豆秸稈以及高粱秸稈發(fā)酵7 d的降解效果見圖8。

圖8 菌株J1、J2、J3以及復(fù)合菌系D對不同秸稈的降解效果Fig.8 Degradation effects of strains J1,J2,J3 and composite microbial system D on different straws

由圖8可知，3株菌株及復(fù)合菌系D對不同秸稈均具有降解性，且復(fù)合菌系D的降解效果優(yōu)于單菌株。復(fù)合菌系D對不同秸稈的降解效果排序為：小麥（27.63%）＞高粱（26.1%）＞水稻（25.5%）＞玉米（21.2%）＞大豆（17.67%）。其中，對小麥秸稈降解率最高，為27.63%，比對照組高26.03%，這與夏強[32]的研究結(jié)論相似。秸稈中木質(zhì)素和半纖維素的包裹作用及木質(zhì)素的難降解是制約纖維素降解率提高的重要因素，木質(zhì)素含量越低，秸稈降解相對越容易。

在以往的研究中，梅新蘭等[33]對篩選出的4株秸稈降解菌進行組合復(fù)配，其中2株和3株菌組合發(fā)酵8 d，稻草降解率達到20.20%～21.03%；QING G E等[34]構(gòu)建了復(fù)合菌系GF-20，其發(fā)酵7 d，秸稈降解率約為20%；張秧等[35]將由枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、米根霉（Rhizopus oryzae）、畢赤酵母菌（Pichia pastoris）和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）等組成的菌劑DH接種于小麥秸稈中進行好氧堆肥，30 d降解率僅達到24.48%。本研究以復(fù)合菌系D為研究對象，相比目前已構(gòu)建的復(fù)合菌系而言，對多種秸稈的降解效果較好，在降解秸稈方面具有更大的潛力。

3 結(jié)論

本研究以CMC-Na為唯一碳源，采用剛果紅染色法和濾紙條崩解法從山西老陳醋源中篩選出3株纖維素降解菌，編號分別為J1、J2和J3，經(jīng)形態(tài)觀察及分子生物學(xué)技術(shù)分別鑒定為燦爛類芽胞桿菌（Paenibacillus lautus）、千葉類芽胞桿菌（Paenibacillus chibensis）和窖泥類芽胞桿菌（Paenibacillus vini）。通過無拮抗作用菌株間的復(fù)配得到一組高效降解秸稈纖維素菌系D（菌株J1、J2和J3等比例混合），其濾紙酶活性達到21.98 U/mL。通過單因素試驗及響應(yīng)面試驗確定復(fù)合菌系D的最優(yōu)產(chǎn)酶條件為：初始pH 7.4，接種量9%，發(fā)酵溫度40 ℃。在此優(yōu)化條件下，濾紙酶活性為35.10 U/mL，是優(yōu)化前的1.6倍。此外，該復(fù)合菌系D對不同秸稈均具有較好的降解效果，其中對小麥秸稈的降解率最高可達到27.63%。與單菌株相比，復(fù)合菌系D在秸稈纖維素分解方面的互補能力能夠有效提高其降解效果，表明該復(fù)合菌系有良好的秸稈降解潛力，可為木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)的轉(zhuǎn)化提供一定的理論指導(dǎo)。