高通量測序分析新疆不同產(chǎn)區(qū)葡萄酒對大鼠腸道菌群多樣性的影響

王妍凌，薛 潔，趙 昊，于佳俊，陳杉彬，張曉蒙，白曉雪，呂嘉偉，武 運

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學 食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052；2.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京 100015；3.國家酒類品質(zhì)與安全國際聯(lián)合研究中心，北京 100015）

腸道是重要的消化和解毒器官，同時也是與外界接觸最大的器官之一，其具有營養(yǎng)吸收、傳遞信息、調(diào)節(jié)新陳代謝以及行使部分免疫的功能[1]。腸道微環(huán)境產(chǎn)生的先天性和獲得性免疫，與中樞、外周免疫等免疫器官的機制不同，形成了腸道的區(qū)域性免疫[2]。腸道菌群及其產(chǎn)生的膽汁酸、短鏈脂肪酸、吲哚等多種代謝物，能使腸道免疫系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，使免疫微環(huán)境得到重塑，進而影響或干擾特定疾病的發(fā)展[3]。過去研究人員通常關(guān)注消化系統(tǒng)疾病與腸道微生物之間的關(guān)系，但目前研究表明，腸道微生物區(qū)系與其他身體主要系統(tǒng)的各種疾病也有關(guān)，如代謝疾病、肺部疾病、癌癥等[4]，許多肝臟類型疾病都被報道與腸道微生物區(qū)系的變化相關(guān)[5]。改善腸道微生物區(qū)系能夠改善疾病，益生菌可通過增加雙歧桿菌和乳桿菌等有益細菌來改善輕度酒精性肝損傷患者腸道微生物區(qū)系的組成，進而對酒精性肝損傷患者起到一定有益作用[6]。

葡萄酒是以新鮮葡萄或葡萄汁為原料經(jīng)發(fā)酵后產(chǎn)生的天然酒精型飲品[7]。葡萄酒中含有豐富的多酚物質(zhì)、益生菌、礦物質(zhì)等活性物質(zhì)，由于其較高的營養(yǎng)價值，在食品和營養(yǎng)科學領(lǐng)域引起了極大的關(guān)注[8-9]。研究表明，因葡萄酒含有豐富的多酚類化合物，機體適量攝入葡萄酒對心腦血管疾病、癌癥、炎癥、認知功能障礙以及骨質(zhì)等具有一定程度的預(yù)防和保護作用[10-13]。酚類物質(zhì)與腸道微生物之間的相互作用已有報道。多酚物質(zhì)在腸道中分解、代謝、轉(zhuǎn)化成活性代謝物的同時，對腸道菌群結(jié)構(gòu)也起到一定有益調(diào)節(jié)作用[14-15]。如茶多酚通過調(diào)節(jié)腸道功能預(yù)防小鼠非酒精性脂肪性肝病[16]，在人體健康中具有重要生理意義。

因此，本研究以新疆天山北麓、伊犁河谷、焉耆盆地產(chǎn)區(qū)主要種植品種赤霞珠釀造的干紅葡萄酒和吐哈盆地主要種植品種霞多麗釀造的干白葡萄酒為研究對象，利用高通量測序技術(shù)，分析新疆不同產(chǎn)區(qū)葡萄酒灌胃健康雄性大鼠后腸道群落結(jié)構(gòu)變化情況，以期為葡萄酒健康飲酒評價體系以及葡萄酒中生理活性物質(zhì)篩選提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄酒樣品：赤霞珠干紅葡萄酒采于新疆焉耆盆地、伊犁河谷、天山北麓產(chǎn)區(qū)，霞多麗干白葡萄酒采于新疆吐哈盆地產(chǎn)區(qū)，每個產(chǎn)區(qū)采樣5～6瓶葡萄酒；實驗動物：健康雄性無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級SD大鼠60只，6周齡，平均體質(zhì)量為（195.6±9.26）g，購于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，動物許可證號為SCXK（京）2019-0010，動物的護理和使用程序得到了北京醫(yī)學倫理委員會的批準，并遵守所有適用的有關(guān)動物倫理使用的機構(gòu)和政府法規(guī)；脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：德國Omega Bio·Tek公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒：美國AXYGEN公司；聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增所用試劑：大連寶生生物公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-50KBS高壓滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；SpectraMaxiD3多功能酶標儀：美國Molecular Devices公司；Micro 21R小型臺式離心機：美國Thermo公司；BG-sub-MIDI多用途水平電泳儀：上海珂淮儀器有限公司；BC-C57 PCR儀：上海天能科技有限公司；Tanon1600凝膠成像系統(tǒng)：上海天能科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠分組及灌胃

將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機分為焉耆盆地干紅葡萄酒組（A1）、伊犁河谷干紅葡萄酒組（A2）、天山北麓干紅葡萄酒組（A3）、吐哈盆地干白葡萄酒組（A4）及空白組（A5），每組10只?？瞻捉M灌胃蒸餾水，其他各組灌胃相應(yīng)新疆不同產(chǎn)區(qū)干紅、干白葡萄酒，共持續(xù)56 d，葡萄酒樣品的灌胃劑量參照《實驗生理科學》[17]，干紅葡萄酒組灌胃劑量為13.9 mL/kg體質(zhì)量，干白葡萄酒組灌胃劑量為16.0 mL/kg體質(zhì)量。灌胃樣品及分組具體信息見表1。

表1 灌胃樣品及分組信息Table 1 Intragastric samples and grouping information

1.3.2 糞便收集

灌胃結(jié)束后禁食12 h，在無菌條件下收集各組大鼠糞便，隨機分3個平行，收集到對應(yīng)無菌EP管中，-80 ℃保存，備用。

1.3.3 DNA提取及測序

按照DNA提取試劑盒說明書提取糞便樣品DNA后，將合格的DNA送至北京諾禾致源公司，采用IonS5TMXL高通量測序平臺對實驗大鼠糞便樣本中細菌16S rDNA V4區(qū)基因序列進行測序分析。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

使用Trimmomatic軟件對原始序列進行質(zhì)控與過濾，舍去質(zhì)量較低的序列，用FLASH軟件對原始序列進行拼接，使用UCHIME軟件剔除嵌合體。利用Uparse v7.0.1001軟件對所有樣品的全部Clean Reads進行聚類，以97%的一致性將序列聚類成為操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs）。利用Silva v123的SSU rRNA數(shù)據(jù)庫比對注釋，得到每個OTU對應(yīng)的物種信息，物種比對注釋使用RDP classifier軟件，保留置信區(qū)間＞0.7的注釋結(jié)果。使用Qime 1.9.1軟件計算Chaol指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Ace指數(shù)、Goods·coverage。再根據(jù)OTU結(jié)果，進行α、β（非度量多維尺度分析（non-metric multidimensional scaling，NMDS））多樣性分析，采用Origin 2021繪制樣品門、屬水平下的群落結(jié)構(gòu)圖[18]、線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）值分布條形圖和LDA效應(yīng)值（LDA effect size，LEfSe）進化分支圖，進行多級物種差異判別分析[19]；運用軟件SPSS 26.0進行差異顯著性分析，多組均數(shù)間采用單因素方差分析（oneway analysis of variance，one-way ANOVA），樣本均數(shù)的兩兩比較采用最小顯著差（least significance difference，LSD）檢驗，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠腸道菌群的α多樣性分析

Chaol指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpsion指數(shù)是判斷菌群物種豐富度、多樣性的常用指數(shù)。Observed-species、Goods·coverage可反映物種數(shù)目及樣品的測序深度[20]。不同處理大鼠腸道菌群的α多樣性分析結(jié)果見表2。

表2 不同處理大鼠腸道菌群的α多樣性分析結(jié)果Table 2 Alpha diversity analysis results of intestinal flora in rats with different treatments

由表2可知，與空白組（A5）相比，A2組的Chaol指數(shù)、Ace指數(shù)顯著降低（P＜0.05），說明機體長期攝入一定量的A2干紅葡萄酒能顯著調(diào)節(jié)大鼠腸道菌群；A1、A3及A4組差異不顯著（P＞0.05）。所有樣品的Goods·coverage均＞0.99，說明樣品序列未被檢測到的幾率較低，數(shù)據(jù)具有可靠性。因此，推測不同處理大鼠腸道菌群多樣性的差異可能是由各產(chǎn)區(qū)的自然環(huán)境、葡萄酒的釀造工藝及各產(chǎn)區(qū)葡萄酒中酚類物質(zhì)的種類和含量不同造成的[21]。

2.2 大鼠腸道菌群OTU數(shù)量分析

不同處理大鼠腸道菌群OTU的Venn圖見圖1。由圖1可知，A1組大鼠腸道菌群OTU數(shù)為1 137個、A2組大鼠腸道菌群的OTU數(shù)為929個、A3組大鼠腸道菌群的OTU數(shù)為1 165個、A4組大鼠腸道菌群的OTU數(shù)為1 134個、A5空白組大鼠腸道菌群的OTU數(shù)為1 119個；其中A1組大鼠特有的腸道菌群OTU數(shù)為63個、A2組大鼠特有的腸道菌群OTU數(shù)為30個、A3組大鼠特有的腸道菌群OTU數(shù)為131個、A4組大鼠特有的腸道菌群OTU數(shù)為103個、A5空白組大鼠特有的腸道菌群OTU數(shù)為64個。各組OTU數(shù)量由高到低排序為：A3組、A1組、A4組、A5組、A2組，說明葡萄酒干預(yù)后，大鼠腸道菌群OTU數(shù)量有增加的趨勢，且A3組增加較多。

圖1 不同處理大鼠腸道菌群的操作分類單元Venn圖Fig.1 Venn diagram of operational taxonomic units of intestinal flora in rats with different treatments

2.3 大鼠腸道菌群的β多樣性分析

通過β多樣性分析不同處理大鼠腸道菌群群落組成的差異性，對所有樣品進行NMDS分析，結(jié)果見圖2。圖中各組間的差異程度用點與點間的距離表示，距離越遠，差異越大[22]。

圖2 不同處理大鼠腸道菌群非度量多維尺度分析Fig.2 Non-metric multidimensional scaling analysis of intestinal flora in rats with different treatments

由圖2可知，不同處理的大鼠腸道菌群被分為5個部分，說明機體長期攝入一定量葡萄酒可在一定程度上影響腸道菌群結(jié)構(gòu)；攝入葡萄酒的A2、A3、A4組較空白組距離遠，說明A2、A3、A4組大鼠腸道菌群組成與空白組差異較大，推測攝入A2、A3、A4葡萄酒對大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)有一定影響；A3組與空白組相距最遠，說明A3干紅葡萄酒干預(yù)后，大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)變化較為明顯。

2.4 大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

2.4.1 基于門水平大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

不同處理大鼠腸道菌群在門水平上的群落組成見圖3。由圖3可知，從所有樣本中共檢測出9種優(yōu)勢細菌門（相對豐度＞1%），分別為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、螺旋體門（Spirochaetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、放線菌門（Actinobacterita）、廣古菌門（Eur yarchaeota）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Acidobacteriota）、脫硫菌門（Desulfobacterota）。與WANG K等[23-25]研究得到的葡萄酒對大鼠腸道菌群的影響中含量位居前列的菌群研究結(jié)論一致。不同處理大鼠腸道優(yōu)勢菌群存在差異。其中A1組9種，A2組7種，A3～A5組均為8種，共有的優(yōu)勢菌群主要為厚壁菌門和擬桿菌門，各組兩個菌門的相對豐度之和均＞80%，相對豐度之和由高到低排序為：A2組、A4組、A3組、A1組、A5組。另外，與空白組相比，A1、A2、A3、A4組中變形菌門（Proteobacteria）、脫硫菌門（Desulfobacterota）相對豐度顯著降低（P＜0.05）。研究表明，長期攝入過量酒精的人群，通過顯著增加腸道菌群中變形菌門的相對豐度和顯著降低擬桿菌門的相對豐度，給機體帶來一些疾病[26]，然而本研究中，大鼠攝入一定量葡萄酒后，變形菌門相對豐度顯著降低，說明葡萄酒不同于酒精，對機體有一定程度的健康作用。變形菌門對腸道疾病具有一定程度的調(diào)節(jié)作用[27]，并且當這類菌群數(shù)量異常升高時，可能會引發(fā)機體的某些炎癥反應(yīng)[28]。脫硫菌門具有穿過腸道粘液層，在腸道定植的能力，腸道中脫硫菌門菌群豐度較高時，可能會引發(fā)潰瘍性結(jié)腸炎[29]。各葡萄酒組間相比較，A1組中螺旋體門、A2組中疣微菌門（Verrucomicrobia）相對豐度顯著升高（P＜0.05）。疣微菌門（Verrucomicrobia）的代謝產(chǎn)物之一丁酸鹽，可通過降低機體食欲，進而減少機體進食，從而對肥胖相關(guān)疾病起到一定的調(diào)節(jié)作用[30]。結(jié)果表明，機體適量攝入一定量的葡萄酒可以調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，對一些病征的改善具有一定的潛力，實際效果與具體機制需要進一步試驗深入研究。

圖3 基于門水平不同處理大鼠腸道菌群的組成Fig.3 Intestinal microflora composition of rats with different treatments based on phylum level

2.4.2 基于屬水平大鼠腸道菌群組成分析

在屬水平上，不同處理大鼠腸道菌群的組成見圖4。由圖4可知，所有樣品中共檢出10種優(yōu)勢細菌屬（相對豐度＞1%），分別為乳桿菌屬（Lactobacillus）、羅姆布茨菌（Romboutsia）、密螺旋體屬（Treponema）、LachnospiraceaeNK4A136-group、糞桿菌（Faecalibaculum）、普雷沃氏菌屬（Prevotella）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、艾克蔓菌屬（Akkermansia）、Turicibacter、Clostridium_sensu_stricto_1。不同處理大鼠腸道優(yōu)勢菌群存在差異，其中A1組8種，A2～A4組均為7種，A5組6種，共有的優(yōu)勢菌群主要為乳桿菌屬，平均相對豐度為33.5%，各組相對豐度由高到低排序為：A2組、A4組、A1組、A3組、A5組。另外，與空白組相比，A1組密螺旋體屬相對豐度顯著升高（P＜0.05）；A2、A3、A4組密螺旋體屬相對豐度顯著降低（P＜0.05）；A1、A2、A3組羅姆布茨菌屬相對豐度顯著升高（P＜0.05）；A2組艾克蔓菌屬（Akkermansia）和乳桿菌屬相對豐度顯著升高（P＜0.05）。研究表明，乳桿菌屬與維持腸道系統(tǒng)的微生態(tài)平衡、pH值和腸道上皮完整性有關(guān)，可預(yù)防Ⅱ型糖尿病、非酒精性脂肪肝等與肥胖相關(guān)的疾病[31]。艾克蔓菌屬可通過改善人體腸道黏液和腸道屏障狀態(tài)，降低機體的糖分吸收率，從而控制機體肥胖相關(guān)指標[32]。A3組糞桿菌（Faecalibaculum）和普雷沃氏菌屬（Prevotella）顯著升高（P＜0.05）。糞桿菌和普雷沃氏菌屬相對豐度增高，可促進甘油的分解、改善膽固醇代謝相關(guān)蛋白信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）表達水平，從而降低動脈粥樣硬化、高脂高糖的風險[33]，這也與OJELABI O A等[34]葡萄酒存在一定降血糖作用的研究結(jié)論一致。因此，以上各菌屬相對豐度的增加可對于宿主發(fā)揮一定的益生功能。綜上所述，機體適量攝入一定葡萄酒可能具有優(yōu)化宿主腸道菌群結(jié)構(gòu)，發(fā)揮益生功能的潛力。

圖4 基于屬水平不同處理大鼠腸道菌群的組成Fig.4 Intestinal microflora composition of rats with different treatments based on genera level

2.5 各處理組大鼠腸道菌群的物種差異分析

LEFSe常用于分析對樣品劃分產(chǎn)生統(tǒng)計學差異影響的群落或物種；LDA常用來計算產(chǎn)生差異影響的群落或物種對差異效果的貢獻值[35]。從門到種水平下大鼠糞便樣本的LDA及LEfSe分析結(jié)果見圖5。

由圖5可知，攝入葡萄酒后，不同處理大鼠腸道差異性富集的菌群存在差異。A1組腸道菌群中螺旋體綱（Spirochaetia）、螺旋體科（Spirochaetales）、螺旋體目（Spirochaetaceae）的富集最具差異性（P＜0.05）；A2組腸道菌群中腸乳桿菌（Lactobacillus intestinalis）的富集最具差異性（P＜0.05）；A3組腸道菌群中迪茨氏菌科（Dietziaceae）的富集最具差異性（P＜0.05）；A4組腸道菌群中微多毛目（Microtrichales）、叢毛單胞菌科（Comamonadaceae）富集最具差異性（P＜0.05）；A5組腸道菌群中消化鏈球菌科（Peptostreptococcaceae）富集最具差異性（P＜0.05）。乳桿菌屬與維持腸道系統(tǒng)的微生態(tài)平衡、pH值和腸道上皮完整性有關(guān)[31]，因此，推測適量攝入A2葡萄酒后一定程度上能促進腸道菌群良性發(fā)展。

圖5 不同處理大鼠糞便樣本線性判別分析條形圖（a）及LDA效應(yīng)大小進化分支圖（b）Fig.5 Bar chart of linear discriminant analysis (a) and evolution branch chart of LDA effect size (b) of fecal samples of rats with different treatments

3 討論

腸道菌群的組成及代謝物與人體健康狀況密切相關(guān)，在人體中發(fā)揮重要作用[31]。腸道菌群能影響葡萄酒中多酚的代謝，并且葡萄酒多酚及其代謝產(chǎn)物如表兒茶素、兒茶素、沒食子酸等，還可以改變腸道微生物的組成，發(fā)揮益生元作用，促進有益菌生長，抑制病原菌的繁殖[15]。本研究中，各葡萄酒處理組大鼠腸道中主要的共有優(yōu)勢菌門厚壁菌門、擬桿菌門較空白組相對豐度之和升高；主要的共有優(yōu)勢菌屬乳桿菌屬較空白組相對豐度顯著升高，這與張文慧等[36]對葡萄酒的腸道菌群作用研究結(jié)果一致。趙昊等[21]研究發(fā)現(xiàn)，干紅葡萄酒的酚類物質(zhì)含量較干白葡萄酒高，本研究中，在門、屬水平上，各組優(yōu)勢菌群厚壁菌門、擬桿菌門、乳桿菌屬相對豐度由高到低排序為：A2組、A4組、A3組、A1組、A5組，A2組在門、屬水平上優(yōu)勢菌群相對豐度增加幅度較大，說明A2干紅葡萄酒較好，推測這與不同產(chǎn)區(qū)、不同品種葡萄酒的釀造工藝及酚類物質(zhì)的含量和種類差異有一定關(guān)系，且不同濃度的酚類物質(zhì)具有不同的作用效果，不同酚類物質(zhì)之間存在拮抗或協(xié)同作用，這也與WATERHOUSE A L等[37]對酚類物質(zhì)的研究結(jié)果一致。因此，關(guān)于葡萄酒對腸道菌群的作用以及與酚類物質(zhì)之間的關(guān)系，還需要進一步深入研究。

4 結(jié)論

通過高通量測序技術(shù)分析不同處理大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，攝入葡萄酒后，不同處理大鼠腸道優(yōu)勢菌群存在差異。在門、屬水平上，各組共有優(yōu)勢細菌門主要為厚壁菌門、擬桿菌門，共有優(yōu)勢細菌屬主要為乳桿菌，各葡萄酒組其相對豐度之和均顯著高于空白對照組（P＜0.05），且A2組（伊犁河谷干紅葡萄酒）升高幅度最大，其大鼠腸道菌群中有害菌門變形菌門、脫硫菌門相對豐度較空白組顯著降低（P＜0.05）；有益菌屬羅姆布茨菌、艾克蔓菌屬及乳桿菌屬相對豐度顯著增加（P＜0.05）。結(jié)合多級物種差異判別分析結(jié)果可知，A2組大鼠腸道菌群中腸乳桿菌（Lactobacillus intestinalis）的富集最具差異性（P＜0.05），因此，推測機體適量攝入葡萄酒一定程度上能夠改善肥胖相關(guān)菌群豐度、促進腸道菌群良性發(fā)展。