乳酸菌發(fā)酵對枸杞果汁體外抗氧化和抗炎活性的影響

張金蘭，魏 巍，楊 云，魯 緋

（1.北京市營養(yǎng)源研究所有限公司，北京 100069；2.北京市科學技術研究院，北京 100089；3.中國農業(yè)大學 食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083）

枸杞（Lycium chinense）屬于茄科植物，通常分布在亞洲，尤其是中國的西北地區(qū)。枸杞的果實，通常被稱為枸杞或枸杞子。我國的商品枸杞主要產自寧夏、新疆、甘肅、青海和內蒙古，每年生產干果25 000～30 000 t[1]。枸杞具有極高的食用價值，因其抗氧化、抗衰老、抗糖尿病、抗癌、調節(jié)免疫等功能而成為超級食物[2]。枸杞被廣泛用于中餐烹飪和草藥茶中，并被用于生產果汁、糖果、果酒等。在各種枸杞產品中，枸杞果汁是最受歡迎的產品之一，既能保持高營養(yǎng)價值，又能延長保質期。枸杞果汁的部分感官特征，如糖酸比過高導致甜味不協調，降低了消費者的購買意愿[3]。有必要采用新的加工技術來優(yōu)化枸杞果汁的品質，豐富其產品種類并提高健康功效[4]。

乳酸菌作為益生菌或功能發(fā)酵劑廣泛應用于食品飲料行業(yè)。乳酸菌發(fā)酵可以保持和/或改善原料的營養(yǎng)和感官特性，并延長產品的貨架期[5]。近年來，由于素食主義、乳糖不耐受、牛奶蛋白過敏和高膽固醇風險等消費者的增加，對非乳制品發(fā)酵產品的需求急劇上升[6]。水果富含糖、有機酸和酚類、纖維素等成分，是乳酸菌發(fā)酵的理想基質。研究表明，發(fā)酵果汁表現出更強的功能特性。鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）GG和植物乳桿菌（L.plantarum）-1發(fā)酵的藍莓果渣可以提高其抗氧化活性和膽固醇清除率[7]。植物乳桿菌Lp-115TM發(fā)酵的桑椹汁可顯著提高自由基清除能力，花青素和黃酮醇與2,2'-聯氮雙（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS）清除能力提高相關，酚酸和黃酮醇與1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）清除能力和還原力提高相關[8]。植物乳桿菌（L.plantarum）NCU116發(fā)酵胡蘿卜汁具有血糖、血脂與氧化應激的調節(jié)能力，同時提高了結腸中短鏈脂肪酸水平，具有緩解糖尿病癥狀的功能[9]。ZHOU C等[10]通過植物乳桿菌（L.plantarum）C17和戊糖乳桿菌Lp-B（L.pentosus）Lp-B共發(fā)酵得到富含γ-氨基丁酸的柿子汁，具有潛在的抗宿醉和降血壓功能特性。CATALDO P等[11]用短乳桿菌（L.brevis）CRL 2013作為發(fā)酵劑發(fā)酵草莓汁獲得高活性的發(fā)酵果汁，在Toll樣受體4（toll-like receptors 4，TLR4）激活的情況下，發(fā)酵草莓汁可調節(jié)脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激的RAW264.7巨噬細胞中環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，Cox-2）表達，并在體內發(fā)揮顯著的抗炎作用。與未發(fā)酵的石榴汁相比，AKTER R等[12]證實，來源于大胡蜂消化道的乳桿菌（L.vespulae）DCY75發(fā)酵后石榴汁劑量依賴性地減少一氧化氮（NO）生成和抑制誘導型一氧化氮合酶（inductible nitric oxide synthase，iNOS），具有更好的抗炎活性。

不同的乳酸菌菌株對不同的食物基質具有菌株特異性。本研究前期從商業(yè)直投式發(fā)酵劑中篩選得到適合枸杞果汁發(fā)酵的發(fā)酵劑-鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）LGG。在此基礎上，采用DPPH·、ABTS·+和鐵離子還原法（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）法研究枸杞果汁在發(fā)酵后的體外抗氧化活性、過氧化氫（H2O2）損傷的結腸癌細胞Caco-2評價抗氧化活性、LPS處理的巨噬細胞RAW264.7評價抗炎活性，為發(fā)酵枸杞果汁的功能特性提供基礎數據，有助于枸杞在食品工業(yè)中得到更廣泛的應用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

枸杞果汁（可溶性固形物21.1%，總糖（以葡萄糖計）5.9%，總酸（以檸檬酸計）0.68%）：青海康普生物科技股份有限公司。

1.1.2 菌株與細胞

鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus）LGG直投式發(fā)酵劑：科·漢森有限公司；巨噬細胞RAW264.7、結腸癌細胞Caco-2：中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所基礎醫(yī)學細胞中心。

1.1.3 試劑

氫氧化鈉、無水乙醇、過氧化氫、甲醇、醋酸鈉、冰乙酸、鹽酸、氯化鐵（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；DPPH、2,4,6-三（2-吡啶）-1,3,5-三嗪（2,4,6-tripyridin-2-yl-1,3,5-triazine，TPTZ）、脂多糖（LPS）（均為分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；ABTS+自由基清除能力測定試劑盒、6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox）：美國Sigma公司；胎牛血清、胰蛋白酶、雙抗：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）（pH 7.2）、細胞計數試劑盒（cell counting kit 8 CCK-8）、細胞因子測定試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.1.4 培養(yǎng)基

Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco's modification of Eagle's medium，DMEM）、洛斯維·帕克紀念研究所1640培養(yǎng)基（Roswell Park Memorial Institute medium 1640，RMPI 1640）：默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2 儀器與設備

FE28臺式pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；MCO-15M二氧化碳培養(yǎng)箱：三洋電機株式會社；iMark酶標儀：美國BIO-RAD公司；HH-2恒溫水浴鍋：上海力辰邦西儀器科技有限公司；E-5298A旋轉蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；3K15冷凍離心機：美國Sigma公司；HWS-250Y電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 枸杞果汁發(fā)酵

在無菌條件下，將枸杞果汁（300 mL）裝入500 mL螺旋蓋透明玻璃瓶中。在無菌室中進行接種試驗，所用菌種是鼠李糖乳桿菌LGG直投式發(fā)酵劑，根據前期預實驗感官評價結果，確定發(fā)酵條件為：接種量0.05%，發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時間8 h，發(fā)酵結束后置于-20 ℃保存待用。以未發(fā)酵的枸杞果汁相同處理作為對照。

1.3.2 枸杞果汁和枸杞發(fā)酵果汁提取物制備

枸杞果汁和枸杞發(fā)酵果汁水提物的制備[13]：50 mL枸杞果汁或枸杞發(fā)酵果汁加入NaOH調節(jié)pH至7.0，在70 ℃水浴中加熱提取2 h，然后將枸杞果汁離心（4 ℃、3 000×g，15 min），取上清液，提取過程重復3次，55 ℃條件下旋轉蒸發(fā)儀濃縮至50 mL，用0.45 μm的膜過濾，保存于-20 ℃?zhèn)溆?，枸杞果汁樣品標記為C-GOJI，發(fā)酵枸杞果汁樣品標記為F-GOJI。

1.3.3 體外抗氧化活性的測定

體外抗氧化活性的測定采用Trolox等效抗氧化能力（trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC）測定法。

DPPH自由基清除能力的測定[14]：將2 mL樣品加入4 mL DPPH甲醇溶液（0.045 mg/mL）中。將混合物在黑暗中保持30 min，然后將0.2 mL的混合物迅速轉移到96孔的酶標板上，在波長517 nm處測量吸光度值。

ABTS+自由基清除能力的測定[15]：根據試劑盒說明書，在96孔酶標板上，每孔反應體系中加入10 μL樣品（或標準品）和20 μL肌紅蛋白工作液，再加入150 μL ABTS工作液（每10 mL ABTS工作液含有25 μL 3%的過氧化氫），混勻后反應5 min，加入100 μL 終止液，波長405 nm處測量吸光度值。

鐵還原抗氧化能力（FRAP）的測定[16]：將0.3 mol/L醋酸鹽緩沖液（pH 3.6）、10 mmol/L TPTZ和20 mmol/L氯化鐵按10∶1∶1的比例混合，混合溶液在37 ℃孵育30 min，得到FRAP溶液。將10 μL樣品加入190 μLFRAP溶液中，室溫下暗處孵育3～5 min，波長593 nm處測定吸光度值。

分別采用濃度為0、0.015 mmol/L、0.045 mmol/L、0.105 mmol/L、0.21 mmol/L、0.42 mmol/L的Trolox（水溶性維生素E 類似物）溶液作為樣品繪制標準曲線，通過回歸方程將樣品的抗氧化能力換算成當量mmol/L的Trolox，結果表示為mmol/L Trolox當量（Trolox equivalent，TE）/L）。

1.3.4 細胞毒性

取對數生長期的Caco-2細胞或RAW264.7細胞接種于96 孔細胞板中，Caco-2細胞在DMEM（含質量分數10%胎牛血清、青霉素G 100 IU/mL、鏈霉素100 IU/mL）中進行培養(yǎng)，RAW264.7 細胞在RMPI 1640（含質量分數10%胎牛血清、青霉素G 100 IU/mL、鏈霉素100 IU/mL）中進行培養(yǎng)。Caco-2細胞接種密度為5.0×104cells/mL，RAW264.7細胞接種密度為1.0×105cells/mL，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。棄去原培養(yǎng)基，加入100 μL含樣品（不同稀釋度的樣品）的培養(yǎng)液，對照組只加100 μL的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

使用CCK-8試劑盒檢測不同樣品處理后細胞的存活率：移去培養(yǎng)基，用PBS清洗一次，加入新鮮培養(yǎng)基，每孔加入10 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)箱內孵育4 h。用酶標儀測定在波長450 nm 處的吸光度值。細胞活力在90%以上表示樣品無細胞毒性。細胞活力計算數學式如下：

式中：A樣品為樣品孔的吸光度值；A空白為僅含CCK-8溶液的培養(yǎng)基的空白孔吸光度值；A對照為含有細胞、CCK-8溶液的培養(yǎng)基的對照孔吸光度值。

1.3.5 枸杞提取物對細胞氧化損傷的保護作用

細胞氧化損傷模型的建立：接種密度為5.0×104cells/mL的Caco-2細胞于96 孔板中，分別設置空白組和模型組。細胞在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，模型組分別加入終濃度為100 μmol/L、200 μmol/L、300 μmol/L、400 μmol/L、500 μmol/L的H2O2，繼續(xù)孵育24 h后，CCK-8法測定細胞存活率，當細胞存活率約為50%時，對應的H2O2濃度即為建立Caco-2細胞氧化損傷模型的濃度。

對H2O2氧化損傷的細胞的保護作用：將密度為5.0×104cells/mL的Caco-2細胞接種于96 孔板中，分別設置對照組、模型組和干預組。細胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)基，干預組加入含10 μL不同樣品的培養(yǎng)基，同時模型組和對照組僅加入培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育24 h，干預組和模型組加入最佳損傷濃度的H2O2溶液，繼續(xù)孵育12 h后，CCK-8法測定細胞存活率。

1.3.6 枸杞提取物對細胞炎癥因子的影響[17]

將密度為1.0×105cells/mL的RAW264.7細胞接種于培養(yǎng)板，分別設置對照組、模型組和干預組。細胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)基，干預組加入100 μL含樣品的培養(yǎng)液，對照組和模型組加入100 μL的培養(yǎng)液，預處理4 h。隨后除對照組外均加入LPS至終質量濃度為1 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用于測定細胞因子的含量。根據試劑盒說明書，測定不同組別的RAW264.7細胞分泌細胞因子：腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-6（interleukin 6，IL-6）、一氧化氮（nitric oxide，NO）、白細胞介素-10（interleukin 10，IL-10）的含量。

1.3.7 統(tǒng)計學分析

每個數據均為3次測定的平均值，使用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行方差分析（analysis of variance，ANOVA）（P＜0.05表示差異顯著）。數據結果以“平均值±標準差”表示，采用Origin 9.0作圖。

2 結果與分析

2.1 枸杞果汁的體外抗氧化活性

Trolox等效抗氧化能力（TEAC）測定法已廣泛應用于食品樣品的測定。不同的抗氧化成分可能通過不同的機制起作用，因此，采用三種抗氧化評價方法研究枸杞樣品提取物的抗氧化能力，結果見圖1。由圖1可知，未發(fā)酵枸杞果汁提取物的DPPH·、ABTS+·、FRAP的Trolox等效抗氧化能力（TEAC）值分別為12.46 mmol/L、30.25 mmol/L和15.43mmol/L。與未發(fā)酵枸杞果汁提取物相比，經鼠李糖乳桿菌LGG發(fā)酵后，枸杞發(fā)酵果汁提取物抗氧化活性顯著增加，DPPH·、ABTS+·、FRAP的TEAC值分別達到17.53 mmol/L、42.72 mmol/L和21.12 mmol/L。

圖1 基于ABTS+、DPPH和FRAP方法發(fā)酵前后枸杞果汁提取物的抗氧化活性Fig.1 Antioxidant activities of Goji berry juice extract before and after fermentation based on ABTS+,DPPH,and FRAP methods

DPPH·和ABTS+·是測定樣品通過電子轉移反應清除自由基的能力，主要歸因于樣品中羥基的總數和反應性。FRAP自由基清除活性取決于樣品在TPTZ存在下將Fe（III）還原為Fe（II）的能力，用于測量樣品的還原力。多糖、類胡蘿卜素、萜類和酚類化合物（酚酸、類黃酮和單寧）是枸杞中發(fā)現的主要生物活性化合物，這些成分與DPPH·、ABTS+·和FRAP之間存在正相關關系[18]。在本研究中，發(fā)酵后的提取物具有更高的抗氧化活性，這與其他發(fā)酵果汁的研究結果一致，如石榴汁的發(fā)酵提高了基于DPPH和ABTS+測定的抗氧化活性[19]、植物乳桿菌發(fā)酵桑椹汁具有較強的還原能力[20]、經瑞士乳桿菌發(fā)酵的紅棗汁抗氧化能力有顯著提升[21]。這可能是由于乳酸菌發(fā)酵過程中的酶（如β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶等）將高分子質量的酚類化合物轉化為游離酚類物質，以及高分子質量的多糖降解而暴露出更多的活性基團。

2.2 枸杞果汁對Caco-2細胞氧化損傷的保護作用

采用蒸餾水稀釋枸杞果汁提取物的含量分別為0、100 μL/mL、200 μL/mL、400 μL/mL、600 μL/mL、800 μL/mL、1 000 μL/mL，考察枸杞提取物含量對Caco-2細胞氧化損傷的保護作用，結果見圖2。由圖2可知，樣品中0～600μL/mL的果汁提取物含量對Caco-2細胞存活率無顯著影響（P＞0.05）。樣品中果汁提取物含量800 μL/mL和1 000 μL/mL使Caco-2細胞存活率顯著下降（P＜0.05）。因此，選用果汁提取物含量600 μL/mL進行Caco-2細胞的下一步實驗。

圖2 發(fā)酵前后枸杞果汁提取物含量對Caco-2細胞存活率的影響Fig.2 Effects of Goji berry juice extract addition before and after fermentation on the viability of Caco-2 cell

為建立H2O2誘導的Caco-2細胞氧化損傷模型，首先研究了不同H2O2濃度對Caco-2細胞活力的影響，選用100μmol/L、200 μmol/L、300 μmol/L、400 μmol/L和500 μmol/L的H2O2濃度作用Caco-2細胞，結果見圖3。由圖3可知，H2O2濃度范圍100～500 μmol/L細胞活力隨濃度的增加也顯著降低（P＜0.05），其中200 μmol/L H2O2濃度使得細胞達到約半數致死量，該結果與之前對H2O2誘導Caco-2細胞的研究結果一致[22]。因此，選擇200 μmol/LH2O2建立氧化損傷模型。

圖3 不同濃度的H2O2對Caco-2細胞存活率的影響Fig.3 Effects of different H2O2 concentration on the viability of Caco-2 cell

H2O2常常被用作氧化劑，可直接損傷DNA、蛋白質和脂質等大分子，引起細胞氧化損傷，導致細胞損傷或死亡。細胞抗氧化活性考慮了細胞內的吸收、代謝和分布等多個方面，能較好地預測物質在體內的抗氧化能力?？疾扈坭教崛∥飳2O2誘導的Caco-2細胞氧化損傷的細胞存活率的影響，結果見圖4。

圖4 發(fā)酵前后枸杞果汁提取物對H2O2誘導Caco-2氧化損傷細胞存活率的影響Fig.4 Effects of Goji berry juice extract before and after fermentation on the viability of oxidative damage cell induced by H2O2

由圖4可知，H2O2處理的模型對照組細胞存活率（50.2%）約為空白對照組的一半，經過未發(fā)酵枸杞果汁和發(fā)酵枸杞果汁提取物處理后，細胞存活率分別達到65.0%和79.4%，細胞存活率分別較未經處理的模型細胞存活率增高1.29倍和1.58倍。LI Z X等[14]用植物乳桿菌（L.plantarum）ATCC14917發(fā)酵蘋果汁的細胞抗氧化值約為未發(fā)酵蘋果汁的2倍；ZHANG Y等[23]用植物乳桿菌（L.plantarum）J26發(fā)酵提高了藍莓汁的細胞抗氧化活性。馮琳[24]用多菌種混合發(fā)酵枸杞汁，以Hep G2細胞為評價模型，結果發(fā)現，發(fā)酵枸杞汁可以明顯緩解細胞內氧化損傷。細胞抗氧化活性的增強同樣是由于乳酸菌代謝會耗盡酚類等功能化合物的葡萄糖分子，產生羥基數量更多的游離苷元，或者轉換成空間位阻更低的羥基[14]，從而促進在枸杞汁發(fā)酵過程中產生一些抗氧化活性更高的代謝物。

2.3 枸杞果汁對LPS 誘導的RAW264.7細胞炎癥的抗炎活性

炎癥是宿主對刺激、損傷和感染的一種正常的保護性反應，是維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)所必需的。過度的炎癥與慢性疾病相關，包括癌癥、類風濕關節(jié)炎和血管疾病、肥胖、糖尿病等[25]。巨噬細胞在免疫系統(tǒng)中起到關鍵作用，抑制巨噬細胞活化是一種潛在的改善炎性疾病的方法[26]。脂多糖（LPS）來源于革蘭氏陰性菌，可與細胞膜表面toll樣受體（TLR）4結合，刺激巨噬細胞產生炎癥細胞因子和炎癥介質，是常見的炎癥誘導因子之一。LPS誘導的RAW 264.7模型常被用來模擬炎癥組織，評價樣品的體外抗炎活性[27]。

采用蒸餾水稀釋枸杞果汁提取物的含量分別為0、100 μL/mL、200 μL/mL、400 μL/mL、600 μL/mL、800 μL/mL、1 000μL/mL，考察枸杞果汁提取物對LPS誘導的RAW264.7細胞存活率的影響，結果見圖5。由圖5可知，樣品中0～600 μL/mL的果汁提取物含量對RAW264.7細胞存活率無顯著抑制作用（P＞0.05）。樣品中800 μL/mL和1 000 μL/mL果汁提取物含量使RAW264.7細胞存活率顯著下降（P＜0.05）。因此，選用果汁提取物含量為600 μL/mL進行下一步實驗。

圖5 發(fā)酵前后枸杞果汁提取物含量對RAW264.7細胞存活率的影響Fig.5 Effects of Goji berry juice extract content before and after fermentation on the viability of RAW264.7 cell

枸杞果汁提取物對LPS誘導的RAW264.7細胞分泌TNF-α、IL-6、NO及IL-10的影響，結果見圖6。

圖6 發(fā)酵前后枸杞果汁提取物對LPS誘導的RAW264.7細胞分泌TNF-α（A）、IL-6（B）、NO（C）及IL-10（D）的影響Fig.6 Effects of Goji berry juice extract before and after fermentation on LPS-induced RAW264.7 cells secreting TNF-α(A),IL-6(B),NO(C)and IL-10(D)

TNF-α和IL-6是活化的巨噬細胞釋放的主要促炎細胞因子[28]。TNF-α通過介導急性炎癥反應和慢性炎癥而啟動或參與疾病病理。由圖6A可知，與空白對照組（0.50 ng/mL）相比，LPS處理導致細胞釋放TNF-α顯著增加（30.12 ng/mL）（P＜0.05）。與模型對照組相比，C-GOJI和F-GOJI可顯著降低TNF-α的釋放量（分別為26.21 ng/mL、23.14 ng/mL）（P＜0.05），其中F-GOJI組顯著低于C-GOJI組（P＜0.05）。

IL-6是急性期炎癥反應的強激活劑，引發(fā)全身和局部炎癥反應，過量的IL-6可誘發(fā)多種慢性炎癥疾病。由圖6B可知，與空白對照組相比，LPS刺激下模型對照組IL-6的釋放量顯著增加（P＜0.05）。給予枸杞果汁提取物干預后，與模型對照組（610 pg/mL）相比，C-GOJI和F-GOJI可顯著降低IL-6的釋放量（分別為520 pg/mL、450 pg/mL）（P＜0.05），其中F-GOJI組顯著低于C-GOJI組（P＜0.05）。結果表明，枸杞果汁提取物可以通過降低TNF-α和IL-6分泌量發(fā)揮抗炎特性，發(fā)酵枸杞果汁提取物的效果高于未發(fā)酵枸杞果汁提取物。

NO是炎癥反應的標志。它由誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）等通過L-精氨酸途徑合成。病理條件下，巨噬細胞產生大量的NO，并在慢性感染、炎癥中發(fā)揮雙重作用。減少NO的產生是治療多種炎癥性疾病的有效策略。由圖6C可知，與空白對照組（1.53 μmol/L）相比，LPS處理顯著增加了NO的產生（15.57 μmol/L）（P＜0.05），這可能是因為LPS激活巨噬細胞，誘導局部炎癥和抗體的產生，并影響體內iNOS的表達，從而影響NO的產生。當細胞用C-GOJI和F-GOJI處理時LPS誘導的NO生成的增加被顯著抑制（分別為12.41 μmol/L、10.72 μmol/L）（P＜0.05），且F-GOJI的抑制效果更好。結果表明，枸杞果汁提取物能夠通過抑制NO分泌發(fā)揮抗炎作用，發(fā)酵后的枸杞果汁作用效果高于未發(fā)酵的枸杞果汁。

RAW264.7細胞在不同的狀態(tài)下具有不同的功能。第一種是促炎（通常是激活的巨噬細胞）功能（M1型），第二種是抗炎（交替激活的巨噬細胞）功能（M2型）。M1型巨噬細胞產生高水平的促炎介質，包括IL-6和TNF-α，而M2型巨噬細胞產生高水平的抗炎介質，如IL-10。IL-10是一種有效的抗炎因子，它通過抑制各種促炎介質來控制炎癥過程[29]。由圖6D可知，與空白對照組相比，LPS誘導的RAW 264.7細胞上清中IL-10水平顯著增加，表明細胞有M2型巨噬細胞特征。與模型組相比，各組樣品對RAW264.7細胞分泌IL-10沒有促進作用，說明枸杞果汁和發(fā)酵枸杞果汁均不能通過促進IL-10的分泌發(fā)揮抗炎作用。

許多研究表明，益生菌及其活性產物具有抗炎作用。LGG減輕LPS誘導的結腸癌細胞HT-29炎癥反應[30]，LGG分泌的可溶性蛋白P40下調了參與先天免疫的促炎細胞因子，包括巨噬細胞產生的TNF-α和IL-6[31]。大腸桿菌（Escherichia coli）Nissle 1917分泌的胞外囊泡刺激RAW264.7細胞使IL-10的產生增加到更高的水平，IL-10可強烈抑制細胞因子信號轉導中促炎細胞因子的產生[32]。漿果或漿果化合物的抗炎特性已被證實，一些研究中發(fā)現乳酸菌發(fā)酵漿果能更有效的抑制炎癥。KANG Y F等[33]將枸杞汁與植物乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、嗜熱鏈球菌共發(fā)酵，發(fā)酵后的枸杞汁中多糖、氨基酸、游離酚和類黃酮含量增加，抗炎作用提升。YOUNU J等[34]從諾麗果發(fā)酵果汁中分離得到新的化合物2和7顯示出抗炎活性。藍莓和黑莓發(fā)酵飲料中的花青素和原花青素通過NF-κB介導途徑降低了LPS誘導的巨噬細胞炎癥反應[35]。在RAW264.7細胞模型中，枸杞中的一些酚酸酰胺對NO的產生表現出顯著的抑制作用，特別是咖啡酸衍生物，具有良好的抗炎性能和功能成分[36]。東莨菪素是枸杞中的一種香豆素，在自身免疫性腦脊髓炎小鼠模型中，東莨菪素治療可顯著減少中樞的炎癥。益生菌發(fā)酵將促進枸杞中復雜的植物化學分子降解為更小的生物活性成分，有利于抑制炎癥細胞因子的產生，從而抑制炎癥反應[37-38]。

3 結論

本研究選用鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）LGG對枸杞果汁進行發(fā)酵，探討發(fā)酵對枸杞果汁體外抗氧化、抗炎活性的影響。研究表明，枸杞果汁經乳酸菌發(fā)酵后抗氧化和抗炎特性有顯著提升。發(fā)酵后的枸杞果汁具有更強的清除DPPH、ABTS+自由基的作用和鐵離子還原能力、改善氧化損傷細胞存活力的特性。與未發(fā)酵枸杞果汁相比，發(fā)酵枸杞果汁可以通過更強的抑制LPS誘導的巨噬細胞RAW264.7分泌TNF-α、IL-6和NO來發(fā)揮抗炎功效，表明發(fā)酵枸杞果汁在預防或減輕氧化應激和炎癥方面具有更好的潛力。本研究可為枸杞的抗氧化和抗炎活性帶來了一些科學見解，拓展枸杞的加工利用方式，為枸杞開發(fā)健康新產品提供依據。