山西老陳醋和懷仁醋酒精發(fā)酵階段細菌菌群多樣性分析

楊 玲，劉 春，彭佳偉，郭旭凱，段 冰，邵 強，郭 睿，溫賢將，王 琪

（1.山西農(nóng)業(yè)大學 高粱研究所，山西 晉中 030600；2.山西大學 生命科學學院，山西 太原 030006）

山西老陳醋歷史悠久，因具有綿、酸、甜、香、鮮等特點而位居“四大名醋”之首。但是山西老陳醋生產(chǎn)依然面臨著很多問題，如生產(chǎn)機械化程度低、原輔料利用率低，導(dǎo)致食醋成本較高[1]。當?shù)仄髽I(yè)為降低成本，進行了一定的工藝改良，形成了多種地方釀造技藝，有回糟固態(tài)發(fā)酵工藝[2]、生料發(fā)酵工藝[3]和多微液態(tài)發(fā)酵工藝[4]。其中具有代表性的是懷仁醋釀造工藝（團體標準T/SXMYT 0601—2020《懷仁醋釀造工藝規(guī)程》），它與山西老陳醋工藝（國標GB/T 19777—2013《地理標志產(chǎn)品山西老陳醋》）的醋酸發(fā)酵階段是一致的，差別主要在酒精發(fā)酵階段，兩種工藝雖然都使用了傳統(tǒng)大曲，但是用量不同，山西老陳醋工藝中大曲用量僅為62.5%，而懷仁醋釀造工藝除了使用30%大曲以外，還使用了一定量的酶制劑和純化酵母。眾所周知，食醋釀造是特定工藝下的微生物種群動態(tài)演替的過程，釀造工藝的不同會直接影響微生物的種群結(jié)構(gòu)，進而導(dǎo)致其代謝產(chǎn)物的不同，最終體現(xiàn)為食醋品質(zhì)的差異。因此，解析食醋不同釀造工藝下的微生物種群結(jié)構(gòu)，對于食醋釀造工藝的改進至關(guān)重要。

目前，針對山西食醋工藝中微生物菌群的研究材料大多是山西老陳醋[5-7]，但是對基于山西老陳醋工藝發(fā)展起來的其他食醋工藝對微生物菌群影響的研究較少。近些年，研究山西食醋微生物菌群多采用高通量測序技術(shù)，該技術(shù)具有通量大、快速、高效方便等特點。范三紅等[8]對山西陳醋動態(tài)釀造過程的細菌菌群進行高通量測序分析，結(jié)果顯示，魏斯氏菌屬（Weissella）和乳桿菌屬（Lactobacillus）是酒精發(fā)酵階段的主要優(yōu)勢菌；寇蓉等[9]對山西陳醋釀造微生物的研究也得出相似的結(jié)論，酒精發(fā)酵階段乳桿菌屬（Lactobacillus）相對含量最高，除此之外是醋酸桿菌屬（Acetobacter）、魏斯氏菌屬（Weissella）和假單胞菌屬（Pseudomonas）。

本研究通過高通量測序手段，比較了山西老陳醋和懷仁醋酒精發(fā)酵階段樣品的細菌菌群差異，旨在為懷仁醋工藝的改進提供一定的指導(dǎo)，并在一定程度上能更好地對山西老陳醋工藝進行創(chuàng)新傳承。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

從山西省晉中市榆次區(qū)某大型醋廠，于酒精發(fā)酵第3天分別采集山西老陳醋工藝的發(fā)酵樣品（編號S）和懷仁醋釀造工藝的發(fā)酵樣品（編號X），各3個平行，置于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑

TGuide S96磁珠法土壤/糞便基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；OMEGA DNA純化試劑盒：美國Bio-Tek公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒：日本寶生物工程株式會社；2×Phusion High-Fidelity聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix：美國紐英倫生物技術(shù)公司；Ion Plus建庫試劑盒：美國賽默飛世爾科技公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

W5L-1恒溫水浴槽：杭州瑞誠儀器有限公司；SL8高速離心機、Veriti Dx PCR熱循環(huán)儀：美國Thermo Scientific公司；XH-B漩渦振蕩儀：無錫沃信儀器制造有限公司；Mini-20雪花制冰機：上海豫明儀器有限公司；DYY-6C型電泳儀：北京六一儀器廠；GelDoc2000UV凝膠成像系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司；Nova-Seq6000測序儀：美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品細菌基因組DNA的提取及檢測

將樣品用磷酸緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）洗滌3次后收集菌體，采用十六烷基三甲基溴化銨（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法提取菌體的基因組DNA，采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA提取效果。

1.3.2 16S rRNA V4區(qū)基因的獲得、文庫的構(gòu)建及高通量測序

以提取的基因組DNA為模板，采用引物515F（5'-TGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTTCTAAT-3'）PCR擴增16S rRNA基因V4區(qū)基因序列。PCR擴增體系：基因組DNA10μL（5～10ng），515F（2μmol/L）3 μL，806R（2 μmol/L）3 μL，2×Mix 15 μL，雙蒸水（ddH2O）補至30 μL。PCR擴增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。通過2%瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產(chǎn)物進行檢測。采用合格的擴增產(chǎn)物構(gòu)建文庫，將質(zhì)檢合格的文庫委托百邁客生物工程有限公司進行高通量測序。

1.3.3 生物信息分析

使用FLASH v1.2.7軟件對測序數(shù)據(jù)進行拼接，使用Trimmomatic v0.33軟件對拼接序列進行過濾，使用UCHIME v4.2軟件去除嵌合體序列，獲得有效序列。使用Usearch軟件，將序列相似性達到97%以上的有效序列歸為同一個操作分類單元（operational taxonomic units，OTU），即分子水平的“種”[10]。選取每一個OTU的代表序列，在美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中通過基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進行物種注釋。

1.3.4 多樣性分析

采用Mothur（網(wǎng)址：http：//mothur.org/wiki/download_mothur/）計算文庫的庫容Coverage和樣品的α-多樣性指數(shù)（香農(nóng)（Shannon）指數(shù)、辛普森（Simpson）指數(shù)、超1（Chao 1）指數(shù)）和β-多樣性[11]。

1.3.5 物種組成分析

基于微生物多樣性分析軟件Qiime 2[12]和核糖體數(shù)據(jù)庫項目（ribosomal database project，RDP）的貝葉斯算法對OTU代表序列進行分類學注釋[13]，參照SILVA核糖體核糖核酸（ribosomal ribonucleic acid，rRNA）數(shù)據(jù)庫[14]，分別在門和屬水平統(tǒng)計各樣品的群落組成，再利用R語言工具繪制成樣品門和屬水平下的群落結(jié)構(gòu)柱狀圖。

1.3.6 LEfSe分析

采用線性判別分析效應(yīng)大?。╨ine discriminant analysis effect size，LEfSe）（http：//huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/root?_id=lefse_upload）獲得造成樣品間顯著性差異的物種[15]。

1.3.7 物種相關(guān)性分析

選取屬水平總相對豐度排名前50的物種，計算物種之間的斯皮爾曼（Spearman）相關(guān)系數(shù)，篩選相關(guān)性＞0.1且P＜0.05的數(shù)據(jù)，利用Gephi 0.9.2軟件進行物種相關(guān)網(wǎng)絡(luò)圖的繪制[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種食醋釀造工藝酒精發(fā)酵階段樣品中細菌菌群的OTU分析

兩種樣品細菌菌群的原始序列數(shù)、有效序列數(shù)和OTU數(shù)統(tǒng)計結(jié)果見表1。由表1可知，山西老陳醋工藝酒精發(fā)酵階段樣品的有效序列數(shù)及OTU數(shù)均高于懷仁醋工藝酒精發(fā)酵階段樣品，說明山西老陳醋工藝樣品的細菌種類多于懷仁醋工藝樣品。

表1 兩種食醋釀造工藝樣品細菌菌群的高通量測序結(jié)果及操作分類單元數(shù)Table 1 High-throughput sequencing results and operational taxonomic unit numbers of bacterial diversity of vinegar samples made by two brewing processes

韋恩（Venn）圖可以展示樣品之間共有、特有的OTU數(shù)目，兩種食醋工藝酒精發(fā)酵階段樣品細菌菌群的OTU韋恩圖見圖1。由圖1可知，兩種食醋釀造工藝酒精發(fā)酵階段樣品的共有序列數(shù)有93條；山西老陳醋工藝樣品的特有序列數(shù)為77條，而懷仁醋工藝樣品的特有序列數(shù)為42條，說明食醋的不同釀造工藝對酒精發(fā)酵時期樣品中細菌物種數(shù)量有較大影響。

圖1 兩種食醋釀造工藝樣品細菌菌群的操作分類單元韋恩圖Fig.1 Venn figure of operational taxonomic unit of bacterial flora in vinegar samples made by two brewing processes

稀釋曲線用于驗證測序數(shù)據(jù)量是否足夠反映樣品的物種多樣性，當曲線逐漸平坦時，說明測序深度基本可以覆蓋樣品中的所有物種[17]。樣品物種的豐富度和均勻度則是通過豐度等級聚類曲線體現(xiàn)的，在橫軸方向上，曲線越寬，則物種豐富度越高；在縱軸方向上，曲線越平坦，則物種均勻度越高[18]。兩種食醋釀造工藝酒精發(fā)酵階段樣品細菌菌群的稀釋曲線及豐度等級聚類曲線見圖2。

圖2 兩種食醋釀造工藝樣品細菌菌群的稀釋曲線（a）和等級聚類曲線（b）Fig.2 Rarefaction curves (a) and hierarchical clustering curves (b) of vinegar samples made by two brewing processes

由圖2a可知，隨著測序深度的增加，兩種工藝樣品的稀釋曲線基本逐漸平緩，說明測序量達到基本要求。由圖2b可知，與懷仁醋工藝樣品相比，山西老陳醋工藝樣品的豐度等級聚類曲線跨度更大、更平緩，說明其物種更豐富、分布更均勻。

2.2 兩種食醋釀造工藝酒精發(fā)酵階段樣品中細菌菌群的多樣性分析

2.2.1α-多樣性分析

Coverage反映了測序的庫容，數(shù)值越大，表明庫容越大，越能反映樣品的真實情況[17]。樣品的α-多樣性程度通常用Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)表示，Shannon指數(shù)越大，Simpson指數(shù)越小，說明樣品內(nèi)物種多樣性越高[19-20]，而Chao1指數(shù)可以預(yù)測樣品中細菌的總種類數(shù)[21]。兩種食醋釀造工藝酒精發(fā)酵階段樣品中細菌菌群的α-多樣性分析結(jié)果見表2。由表2可知，山西老陳醋和懷仁醋釀造工藝樣品的Coverage均＞0.99，說明庫容均滿足了基本要求。與山西老陳醋工藝的樣品相比，懷仁醋工藝樣品的Shannon指數(shù)更小，Simpson指數(shù)更大，說明懷仁醋工藝降低了樣品細菌菌群的多樣性。由表2亦可知，懷仁醋工藝樣品的Chao1指數(shù)低于山西老陳醋工藝樣品的Chao1指數(shù)，表明懷仁醋釀造工藝降低了樣品中細菌物種的豐富度。

表2 兩種食醋釀造工藝樣品細菌菌群的α-多樣性分析結(jié)果Table 2 α-diversity analysis results of bacterial flora in vinegar samples made by two brewing processes

2.2.2β-多樣性分析

主成分分析（principal component analysis，PCA）是一種分析和簡化數(shù)據(jù)集的技術(shù)，通過將方差進行分解，將多組數(shù)據(jù)的差異反映在二維坐標圖上，兩個樣品距離越近，則表示這兩個樣品的組成越相似[22]?；贠TU對兩種樣品進行主成分分析，結(jié)果見圖3。由圖3可知，在酒精發(fā)酵過程中，山西老陳醋工藝的樣品與懷仁醋工藝的樣品之間的距離很遠，說明兩種工藝樣品的細菌組成差別很大。

圖3 基于操作分類單元兩種食醋釀造工藝樣品的主成分分析結(jié)果Fig.3 Result of principal component analysis of vinegar samples made by two brewing processes based on operational taxonomic unit

2.3 兩種食醋釀造工藝酒精發(fā)酵階段樣品中細菌群落結(jié)構(gòu)的組成

2.3.1 細菌菌群在門水平上的組成

在門水平上，兩種工藝樣品的細菌群落結(jié)構(gòu)見圖4。由圖4可知，從兩個工藝樣品中共注釋到11個細菌門，在山西老陳醋工藝樣品和懷仁醋工藝樣品中分別為11個和9個。樣品中平均相對豐度排名前10的細菌門分別為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、藍藻門（Cyanobacteria）、擬桿菌門（Bacteroides）、梭桿菌門（Fusobacteria）、埃普西隆桿菌門（Epsilonbacter aeota）、綠彎菌門（Chloroflexi）、脫鐵桿菌門（Deferribacteres）和未確定分類地位（unclassified）。在山西老陳醋工藝樣品中，除未確定分類地位（unclassified）以外，其他9個門均能檢測到，其中，占絕對優(yōu)勢的細菌門為厚壁菌門。除脫鐵桿菌門外，其余9個細菌門均存在于懷仁醋工藝樣品中，絕對優(yōu)勢細菌門也是厚壁菌門。與范三紅等[8-9]的研究結(jié)果類似，厚壁菌門在兩種工藝樣品中均是絕對優(yōu)勢類群，且在懷仁醋工藝樣品中的平均相對豐度（88.48%）低于山西老陳醋工藝樣品（97.21%）。此外，變形菌門、放線菌門和藍藻門在山西老陳醋工藝樣品中的相對豐度也高于懷仁醋釀造工藝樣品。

圖4 基于門水平兩種食醋釀造工藝樣品的細菌菌群結(jié)構(gòu)Fig.4 Bacterial community structure of vinegar samples made by two brewing processes based on phylum level

2.3.2 細菌菌群在屬水平上的組成

在屬水平上，兩種工藝樣品的細菌群落結(jié)構(gòu)見圖5。由圖5可知，從兩個工藝樣品中共注釋到123個細菌屬，在山西老陳醋工藝樣品和懷仁醋工藝樣品中分別為123個和98個。樣品中平均相對豐度排名前10的細菌屬分別為乳桿菌屬（Lactobacillus）、片球菌屬（Pediococcus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、魏斯氏菌屬（Weissella）、泛菌屬（Pantoea）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、乳球菌屬（Lactococcus）、短狀桿菌屬（Brachybacterium）和腸桿菌屬（Enterobacter）、未培養(yǎng)細菌（uncultured bacterium）。這10個細菌屬在兩種工藝樣品中均存在。在山西老陳醋工藝樣品中，乳桿菌屬、片球菌屬、明串珠菌屬的平均相對豐度較高，分別為41.87%、28.13%、17.03%；而在懷仁醋工藝樣品中，乳桿菌屬、魏斯氏菌屬、片球菌屬的平均相對豐度較高，分別為73.74%、15.01%、5.53%。第一優(yōu)勢屬乳桿菌屬在懷仁醋工藝樣品中的平均相對豐度遠高于山西老陳醋工藝樣品。山西老陳醋工藝樣品的第二優(yōu)勢屬片球菌屬則成為懷仁醋工藝樣品中的第三優(yōu)勢屬。在山西老陳醋工藝樣品中的第三優(yōu)勢屬明串珠菌屬在懷仁醋工藝樣品中的平均相對豐度較低；相反，數(shù)量極少的魏斯氏菌屬則成為懷仁醋工藝樣品中的優(yōu)勢細菌屬。另外，在山西老陳醋工藝樣品中存在的泛菌屬、鏈霉菌屬、短狀桿菌屬、腸桿菌屬（Enterobacter）和非培養(yǎng)細菌（uncultured bacterium）在懷仁醋工藝樣品中的數(shù)量都有所降低；相反，在懷仁醋工藝樣品中較多的乳球菌屬則在山西老陳醋工藝樣品中極少。

圖5 基于屬水平兩種食醋釀造工藝樣品的細菌菌群結(jié)構(gòu)Fig.5 Bacterial community structure of vinegar samples made by two brewing processes based on genus level

綜上，山西老陳醋工藝和懷仁醋工藝樣品的主要細菌均為乳酸菌。乳酸菌產(chǎn)生的乳酸是老陳醋的第二主體酸[23]，不僅能降低乙酸的刺激口感、平衡酸味，使得食醋更加柔和[24-25]，還可生成重要功能物質(zhì)川芎嗪的前體物質(zhì)—乙偶姻，提高食醋的保健功能[23，26-27]。乳酸菌產(chǎn)生的蛋白酶能水解蛋白質(zhì)為氨基酸，賦予食醋醇厚風味[28]。另外，乳酸菌還能產(chǎn)生少量的天然抑菌劑—乳酸鏈球菌素，具有非常好的抑菌效果，有助于延長食醋的保存期[29]。

本研究中，乳桿菌屬在山西老陳醋工藝和懷仁醋工藝的樣品中都是第一優(yōu)勢菌，這與聶志強等[30-32]的研究報道相一致。通常，醋醅的微生物類群受大曲微生物類群的影響巨大。已有研究表明，山西食醋大曲中優(yōu)勢微生物主要是芽孢桿菌屬（Bacillus）和魏斯氏菌屬，并不是乳桿菌屬[33-34]。結(jié)合本研究的兩種工藝樣品均取自酒精發(fā)酵中期，但并未檢測到高水平的芽孢桿菌屬，反而是乳桿菌屬占據(jù)優(yōu)勢。這可能是芽孢桿菌屬在食醋釀造酒精發(fā)酵階段的前期發(fā)揮作用，提供了乳桿菌屬生長繁殖的營養(yǎng)物質(zhì)。盡管乳桿菌屬在兩種工藝樣品中都是第一優(yōu)勢屬，但是其在懷仁醋工藝樣品中的相對豐度更高。這可能是由于懷仁醋工藝使用了酶制劑，能快速分解高粱原料，為乳桿菌屬細菌的迅速生長提供了大量前體物質(zhì)，從而產(chǎn)生了大量乳酸[35]。但與此同時，懷仁醋工藝的大曲用量減半，致使細菌菌群的多樣性降低。

本研究結(jié)果與其他文獻結(jié)果有所差異[30-34]，導(dǎo)致這些差異化的因素包括釀造原料、大曲、釀造工藝等。山西老陳醋的釀造主料是高粱，高粱單寧對發(fā)酵微生物的生長有一定的影響作用[36]；不同高粱子粒的糊化差異較大[37]，對潤糧和糖化的影響較大[38]，進而影響發(fā)酵過程中微生物的菌群類型。山西老陳醋釀造的大曲為清香型大曲，來自清徐和榆次周邊的大曲基地，微生物類群相對穩(wěn)定，但其他地區(qū)醋廠所用大曲的來源不一定相同；而不同來源的大曲的微生物差異較大[39]，從而造成釀造過程中微生物種群的不同。在后續(xù)研究中，需要將山西老陳醋工藝和懷仁醋工藝的細菌菌群與各自產(chǎn)品的理化成分、香味物質(zhì)等指標結(jié)合分析，才能較全面、較科學地指導(dǎo)釀造工藝的改進和創(chuàng)新。

2.4 兩種食醋釀造工藝酒精發(fā)酵階段樣品的LEfSe分析

LEfSe可以發(fā)現(xiàn)不同樣品間在豐度上有顯著差異的物種[15]，兩種食醋釀造工藝酒精發(fā)酵階段樣品的LEfSe分析結(jié)果見圖6。圖6展示了線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）分值大于設(shè)定值（4.0）的物種，不同顏色表示不同樣品的物種，柱狀圖的長度代表差異物種的影響大小。由圖6可知，在所有細菌屬中，導(dǎo)致兩種工藝樣品有差異的細菌屬有7個，在山西老陳醋工藝樣品中為片球菌屬（Pediococcus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、鏈霉菌屬（Streptomyces）和泛菌屬（Pantoea），其中片球菌屬的影響最大；而在懷仁醋工藝樣品中則為乳桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）和乳球菌屬（Lactococcus），其中乳桿菌屬的影響最大。

圖6 兩種食醋釀造工藝樣品的LEfSe分析結(jié)果Fig.6 LEfSe analysis results of vinegar samples made by two brewing processes

2.5 兩種食醋釀造工藝酒精發(fā)酵階段樣品中細菌屬間相關(guān)性分析

基于各個細菌屬在各個樣品中的豐度及變化情況，繪制物種相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖，從而可以獲得物種在環(huán)境樣本中的共存關(guān)系，得到物種在同一環(huán)境下的相互作用情況[40]。本研究選取山西老陳醋和懷仁醋工藝酒精發(fā)酵階段樣品中相關(guān)性最高的前50個細菌屬繪制物種相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果見圖7。圖7中網(wǎng)絡(luò)節(jié)點大小代表該物種豐度高低；連線顏色表示物種間的相關(guān)性（紅色表示正相關(guān)，綠色表示負相關(guān)），線的粗細表示相關(guān)性大?。ň€粗表示相關(guān)性高），線的多少表示該物種與其他物種的聯(lián)系密切程度。

圖7 兩種食醋釀造工藝樣品中細菌屬相關(guān)性分析網(wǎng)絡(luò)圖Fig.7 Correlation analysis network diagram of bacterial genera in vinegar samples made by two brewing processes

由圖7可知，連接節(jié)點最多的是乳桿菌屬（Lactobacillus）、泛菌屬（Pantoea）和埃希氏菌屬-沙門氏菌屬（Escherichia-Shigella）。乳桿菌屬在山西老陳醋工藝和懷仁醋工藝樣品中均是第一優(yōu)勢屬，其與Faecalibacterium和脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）高度正相關(guān)，與魏斯氏菌屬（Weissella）呈正相關(guān)；而與片球菌屬（Pediococcus）和泛菌屬（Pantoea）高度負相關(guān)，與埃希氏菌屬-沙門氏菌屬（Escherichia-Shigella）和喬治菌屬（Georgenia）呈負相關(guān)。泛菌屬雖然并不是兩種工藝樣品的主要優(yōu)勢屬，而且在懷仁醋工藝樣品中的相對豐度少于山西老陳醋工藝樣品，但是它卻與片球菌屬（Pediococcus）高度正相關(guān)、與Georgenia和埃希氏菌屬-沙門氏菌屬（Escherichia-Shigella）正相關(guān)；與乳桿菌屬（Lactobacillus）高度負相關(guān)，與魏斯氏菌屬（Weissella）、短波單胞桿菌屬（Brevundimonas）和Provotellaceae-UCG-00負相關(guān)。

連接節(jié)點居第二位的是魏斯氏菌屬（Weissella），其在懷仁醋工藝樣品是第二優(yōu)勢屬，與乳桿菌屬（Lactobacillus）和梭菌屬（Clostridium）呈正相關(guān)；而與埃希氏菌屬-沙門氏菌屬（Escherichia-Shigella）高度負相關(guān)，與短狀桿菌屬（Brachybacterium）和泛菌屬（Pantoea）呈負相關(guān)。連接節(jié)點居第三位的是短桿菌屬（Brevibacterium）和克魯格氏菌屬（Klugiella）。連接節(jié)點居第四位的是片球菌屬（Pediococcus）和短狀桿菌屬（Brachybacterium）。片球菌屬在山西老陳醋工藝樣品中是第二優(yōu)勢屬，在懷仁醋工藝樣品是第三優(yōu)勢屬，其與泛菌屬（Pantoea）高度正相關(guān)，與埃希氏菌屬-沙門氏菌屬（Escherichia-Shigella）呈正相關(guān)；與乳桿菌屬（Lactobacillus）呈高度負相關(guān)，與魏斯氏菌屬（Weissella）呈負相關(guān)。

研究表明，通過網(wǎng)絡(luò)中微生物間的相互作用可以推測[41-43]，處于互利共生關(guān)系的微生物呈正相關(guān)[44]，而處于競爭關(guān)系的微生物呈負相關(guān)[45]。因此，在山西老陳醋工藝和懷仁醋工藝樣品中的第一優(yōu)勢屬乳桿菌屬（Lactobacillus）與Faecalibacterium和脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）處于高度互利共生關(guān)系，與魏斯氏菌屬（Weissella）為互利共生關(guān)系。有研究發(fā)現(xiàn)，在山西老陳醋的酒精發(fā)酵過程中，乳桿菌屬及魏斯氏菌屬與酸度呈正相關(guān)，乳桿菌屬與乳酸、乙酸、檸檬酸、丙酮酸、草酸和琥珀酸有較高相關(guān)性，魏斯氏菌屬與3種酯類相關(guān)性較高[35]。本研究中的第一優(yōu)勢屬乳桿菌屬與片球菌屬（Pediococcus）、泛菌屬（Pantoea）為高度競爭關(guān)系，與埃希氏菌屬-沙門氏菌屬（Escherichia-Shigella）和Georgenia存在競爭關(guān)系。張?zhí)煺餥35]發(fā)現(xiàn)，山西老陳醋的酒精發(fā)酵中的片球菌屬與溫度呈正相關(guān)，與3種酯類相關(guān)性較高；泛菌屬與pH呈正相關(guān)。由此可見，山西老陳醋發(fā)酵過程中細菌菌群的改變會影響發(fā)酵產(chǎn)物的種類。而發(fā)酵過程中的細菌菌群之間通過何種方式相互影響，有待深入研究。因此，對山西老陳醋工藝的改進，包括大曲的用量和酶制劑的使用等必須要考慮對第一優(yōu)勢屬及其相關(guān)細菌菌群的影響，再結(jié)合產(chǎn)品的性狀綜合考慮工藝改進的方向。

3 結(jié)論

本研究利用高通量測序技術(shù)對山西老陳醋工藝（S）和懷仁醋釀造工藝（X）酒精發(fā)酵中期樣品中的細菌群落結(jié)構(gòu)進行分析。多樣性分析結(jié)果表明，S樣品的細菌菌群多樣性更高。兩種工藝樣品的細菌菌群組成差別較大，與S樣品相比，X樣品中相對豐度較高的乳桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、乳球菌屬（Lactococcus）均增多，片球菌屬（Pediococcus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、泛菌屬（Pantoea）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、短狀桿菌屬（Brachybacterium）、腸桿菌屬（Enterobacter）和非培養(yǎng)細菌（uncultured bacterium）均減少。LEfse分析結(jié)果表明，引起兩種工藝樣品有顯著差異的細菌在S樣品中為片球菌屬、明串珠菌屬、鏈霉菌屬和泛菌屬，在X樣品中則為乳桿菌屬、魏斯氏菌屬和乳球菌屬。物種相關(guān)性分析表明，乳桿菌屬、泛菌屬、魏斯氏菌屬和片球菌屬與其他物種的聯(lián)系緊密。