基于HPLC結(jié)合多元統(tǒng)計方法分析不同種類酒中有機酸的差異

余松柏，吳奇霄，黃張君*，賈俊杰，許 濤，王松濤，3，沈才洪，3

（1.瀘州品創(chuàng)科技有限公司，四川 瀘州 646000；2.瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646000；3.國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川 瀘州 646000）

酒是人們在宴請、慶典和日常生活中不可或缺的飲品，不同品類酒含有豐富的風味成分，其中酸類成分對酒的品質(zhì)具有十分重要的作用。酒中的酸類成分主要為有機酸，其對酒的色澤、香氣和口感有著十分重要的作用[1]，能使白酒產(chǎn)生酸味、回甘味，消除苦味、燥辣味、新酒味[2-3]。有機酸作為酒中的重要風味成分，是需要重點檢測和分析的成分之一。

測定酒中有機酸的方法主要有高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[4-5]、氣相色譜（gas chromatography，GC）法[6-9]、離子色譜（ion chromatography，IC）法[10-12]。在有機酸檢測方法中，高效液相色譜檢測方法由于操作簡便、快速、準確度高、適應性好等優(yōu)點應用較為廣泛。目前，高效液相色譜法測定白酒有機酸的研究報道集中于乙酸、乳酸的測定[13-17]，測定的樣品主要集中于米酒發(fā)酵液和白酒尾酒[18-19]。關于高效液相色譜法同時測定市售成品酒樣中的多種有機酸研究報道較少。近年來，為更細致和全面的解析白酒風味成分，通常將多元統(tǒng)計分析方法與檢測技術(shù)相結(jié)合，以深入挖掘風味數(shù)據(jù)價值，WANG G N等[20]利用多元統(tǒng)計分析方法結(jié)合代謝組學，分別實現(xiàn)對白酒發(fā)酵曲藥類型、容器類別及白酒香型的識別；ZHANG J等[21]利用白酒有機酸含量結(jié)合多元統(tǒng)計實現(xiàn)對白酒產(chǎn)地的劃分。因此，有必要開發(fā)一種簡單、高效的方法用于測定酒樣中的多種有機酸。

本研究采用樣品直接進樣的方式，通過優(yōu)化色譜條件，利用高相液相色譜同時測定酒樣中的13種有機酸，對30個市售不同種類酒（白酒、露酒、配制酒、果酒（配制型）、黃酒）樣品中有機酸的含量進行測定，運用聚類分析（cluster analysis，CA）和正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discrimination analysis，OPLS-DA）將酒樣進行分類；使用主成分分析（principal component analysis，PCA）解析不同種類酒種所含有機酸種類及含量的差異和影響各酒樣分布的特征有機酸。以期建立穩(wěn)定、高效、簡便測定酒樣中多種有機酸的方法，為酒類飲品風味成分的檢測和品質(zhì)評價提供借鑒方法，并結(jié)合多元統(tǒng)計分析手段，為酒分類判別和明確各酒樣中的特征酸類成分提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

酒樣按國標GB/T 17204—2021《飲料酒術(shù)語和分類》進行分類。所有酒樣皆購自市場零售渠道。不同種類酒樣信息見表1。

表1 不同種類酒樣信息Table 1 Information of different kinds of alcoholic beverage samples

續(xù)表

1.1.2 試劑

有機酸標準品（純度均＞98%）：上海安譜實驗科技股份有限公司；甲醇（色譜級）：成都市科隆化學品有限公司。

1.2 儀器與設備

1260 Infinity液相色譜系統(tǒng)：美國Agilent公司；Milli-Q Synergy超純水系統(tǒng)：德國Merck公司；ME型分析天平：瑞士METTLER TOLEDO公司；C18色譜柱（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）、SB-aq色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、Polaris C18-A色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：美國Agilent公司；Hypersil Gold aq色譜柱（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）：美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制

精密稱取適量0.50 g有機酸標準品，以0.1%磷酸水溶液為溶劑，戊酸、己酸配制成4 000.00 mg/L的單標溶液，其余有機酸配制成10 000.00 mg/L的單標溶液。取戊酸、己酸單標溶液各12.50 mL，其余單標溶液各2.50 mL于50.00 mL容量瓶中，以溶劑定容后得到各有機酸質(zhì)量濃度為1 000.00 mg/L的標準品混合溶液，按比例稀釋依次配制成質(zhì)量濃度為0.25 mg/L、1.00 mg/L、5.00 mg/L、20.00 mg/L、50.00 mg/L、100.00 mg/L、250.00 mg/L、1 000.00 mg/L標準品混合溶液。

1.3.2 樣品的前處理

吸取酒精度＜10%vol的酒樣1 mL，過0.22 μm微濾膜后直接進樣；吸取1 mL酒精度＞10%vol的酒樣，用0.1%的磷酸水溶液（pH=2.05）稀釋至酒精度＜10%vol，定容后搖勻，計算稀釋倍數(shù)，過0.22 μm微濾膜后，進樣檢測。

1.3.3 酒樣中有機酸含量的分析檢測

采用HPLC法測定不同種類酒樣中有機酸含量，其色譜條件如下：安捷倫Polaris C18-A色譜柱；進樣量10 μL；流動相A為0.1%磷酸-水溶液，流動相B為甲醇；流速0.5 mL/min；梯度洗脫，0～10 min，100%A；10.0～10.5 min，100%A～90%A：0% B～10%B；10.5～16.0 min，90%A：10%B；16.0～16.5 min，90%A～50%A：10%B～50%B；16.5～45.0 min，50%A：50%B；45.0～45.5 min，50%A～100%A：50%B～0%B；45.5～60.0 min，100%A；柱溫30 ℃；檢測波長215 nm。

定性、定量分析：根據(jù)標準品出峰的保留時間對酒樣中各有機酸進行定性分析。采用外標法定量，以標準品的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，繪制有機酸標準曲線，得到有機酸的標準曲線回歸方程，通過標準曲線回歸方程計算樣品中各有機酸的質(zhì)量濃度。

1.3.4 檢測條件優(yōu)化

為了優(yōu)化HPLC檢測條件，分別考察流動相（0.02 mol/L的磷酸二氫鉀-水溶液、0.1%磷酸-水溶液）和色譜柱（安捷倫C18、安捷倫SB-aq、賽默飛Hypersil Gold aq、安捷倫Polaris C18-A）對有機酸分析的影響。

1.3.5 方法學考察

（1）精密度試驗

取混合標樣，反復進樣測定8次，對各有機酸的保留時間和峰面積進行相對標準偏差的計算，得出該方法各有機酸檢測的精密度。

（2）加標回收率試驗

取同一酒樣NXX-1，分別取低（8 mg/L）、中（100 mg/L）、高（200 mg/L）3個質(zhì)量濃度各有機酸標準品進行加標回收率試驗。

（3）檢測限和定量限

以信噪比3和10分別確定為有機酸的檢測限與定量限。

1.3.6 分離度

分離度R計算公式如下：

式中：tR（j）為色譜峰j保留時間，min；tR（i）為色譜峰i保留時間，min；Wi為色譜峰i在基線處的峰寬；Wj為色譜峰j在基線處的峰寬。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019進行數(shù)據(jù)處理，采用Origin 2021軟件繪制熱圖，采用SIMCA14.1繪制OPLS-DA分析圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC條件的優(yōu)化

2.1.1 流動相的選擇

本研究中流動相B為甲醇，流動相A分別為0.02 mol/L的磷酸二氫鉀-水溶液、0.1%磷酸-水溶液，以考察對分析效果的影響。與使用0.02 mol/L磷酸二氫鉀-水溶液相比，用0.1%磷酸-水溶液會使乳酸和乙酸的分離度更大，同時長期使用磷酸二氫鉀溶液時可能會造成的液相流路中溶劑結(jié)晶的情況，因此，最終選取流動相A為0.1%磷酸-水溶液。

2.1.2 色譜柱的選擇

由于色譜柱對于目標物質(zhì)的分離程度、出峰時間、峰型有重要影響，分別選取安捷倫C18、安捷倫SB-aq、賽默飛Hypersil Gold aq、安捷倫Polaris C18-A色譜柱進行分析，使用安捷倫C18色譜柱分析時，部分有機酸出現(xiàn)了峰型不對稱、拖尾以及部分有機酸有未分離情況，且該色譜柱不適合長期在高含水流動相下工作；使用安捷倫SB-aq和賽默飛Hypersil Gold aq色譜柱分析時，柱長較短能縮短各有機酸的出峰時間，但分離效果欠佳，在100%水相情況下部分有機酸仍未分離；安捷倫Polaris C18-A色譜柱耐水性好，13種有機酸的分離效果和峰型較好，綜合考慮最終選擇安捷倫Polaris C18-A色譜柱。

2.2 有機酸的定性

在最優(yōu)測定條件下，13種有機酸的混合標樣和典型樣品的高效液相色譜圖見圖1。

圖1 13種有機酸混合標樣和典型樣品的高效液相色譜分析圖Fig.1 Chromatograms of mixed standard samples of 13 organic acids and typical samples analyzed by HPLC

2.3 標準曲線回歸方程、線性范圍、檢測限、定量限及分離度

13種有機酸的標準曲線回歸方程、線性范圍、相關系數(shù)、檢測限、定量限及分離度見表2。由表2可知，除甲酸、乙酸外，各有機酸分離度均＞1.5，表明各有機酸之間實現(xiàn)良好分離[22]。該方法在有機酸質(zhì)量濃度1.00～512.48 mg/L范圍內(nèi)線性關系良好，相關系數(shù)R2均＞0.999 0，檢測限為0.10～3.67 mg/L，定量限為0.31～5.05 mg/L。

表2 有機酸的標準曲線回歸方程、線性范圍、相關系數(shù)、檢測限、定量限及分離度Table 2 Standard curves regression equation,linear range,correlation coefficient,limits of detection,limits of quantification and degree of separation of organic acids

2.4 方法的平均回收率試驗及精密度試驗結(jié)果

各有機酸保留時間檢測結(jié)果的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為0.03%～0.46%，峰面積檢測結(jié)果的RSD為0.13%～1.50%，表明該色譜條件對于13種有機酸的測定效果良好。平均加標回收率為87.39%～105.24%，說明該檢測方法精密度和準確度較高，能夠滿足酒樣中的有機酸含量檢測要求。

表3 有機酸含量測定的加標回收率試驗及精密度試驗結(jié)果Table 3 Results of adding standard recovery rate tests and precision tests of organic acid contents determination

2.5 不同種類酒樣有機酸含量的檢測結(jié)果

對不同種類酒樣中有機酸含量進行檢測，結(jié)果見表4。由表4可知，12種香型白酒均含乙酸和乳酸，其中，乳酸在老白干香型白酒LBGXX-1、芝麻香型白酒ZMXX-1、醬香型白酒JXX-1中的含量較高，分別為1 054.01 mg/L、892.83 mg/L、772.71 mg/L；乙酸在醬香型白酒JXX-1與董香型白酒YXX-1中的含量較高，分別為1 149.53 mg/L、1 032.40 mg/L。醬香型白酒中乳酸和乙酸的含量均較高，這與其獨特的“四高兩長”（即高溫制曲、高溫堆積、高溫發(fā)酵和高溫餾酒，生產(chǎn)周期長和貯存時間長）工藝相關[23]，導致了醬香型白酒中有機酸的含量高于其他香型白酒[24]。酒石酸在12種香型白酒均可被檢出，但其含量較低，含量范圍為0.37～1.06 mg/L。除米香型白酒MXX-1外，丁酸在其他11種香型白酒中均被檢出，在董香型白酒YXX-1和濃香型白酒NXX-2中的含量分別為236.82 mg/L、138.02 mg/L。己酸在NXX-1白酒中的質(zhì)量濃度為733.87 mg/L，但在清香型白酒QXX-1及豉香型白酒CXX-1中無檢出，其主要存在于濃香型及濃香型衍生香型白酒中，如在兼香型白酒JiXX-1、鳳香型白酒FXX-1、馥郁香型白酒FYXX-1中分別達到了455.88 mg/L、366.26 mg/L和463.90 mg/L，這主要是由于在濃香型白酒及其衍生香型白酒在釀造過程中，梭菌屬（Clostridium）細菌如梭狀芽孢桿菌（Clostridium bolteae），能夠利用脂肪酸合成酶通過反向β氧化途徑延長短鏈脂肪酸，以乙醇和乳酸為電子供體，通過代謝途徑生成己酸[25-27]。相較于乙酸、丁酸、己酸等雙碳原子數(shù)酸，甲酸、丙酸、戊酸則在白酒中的含量基本上低1個數(shù)量級，如甲酸僅在6種白酒中檢出，含量范圍為3.64～59.42 mg/L，由于董香型白酒獨特的釀酒工藝，丙酸和戊酸在董香型白酒YXX-1白酒中含量分別為161.16 mg/L、171.91 mg/L，而其他香型白酒中的丙酸和戊酸含量分別為5.19～34.54 mg/L、11.35～72.96 mg/L，上述結(jié)果與范文來等[5]的研究結(jié)果一致，其測定的結(jié)果中偶數(shù)碳有機酸的含量遠高于奇數(shù)碳有機酸。此外，葡萄糖酸在豉香型白酒CXX-1和芝麻香型白酒ZMXX-1中有檢出，含量分別為203.28 mg/L、0.37 mg/L，這可能與豉香型白酒的肥肉浸泡工藝有關[28]；草酸在9種白酒中有檢出，在豉香型白酒中含量最高，為13.52 mg/L，其他香型白酒中含量為0.26～0.75 mg/L；丁二酸在濃香型白酒NXX-1中有檢出，其在酒樣NXX-1中含量為3.34 mg/L；蘋果酸在所測試的白酒樣品中皆無檢出。

表4 不同種類酒樣中有機酸含量的檢測結(jié)果Table 4 Determination results of organic acids contents in different kinds of alcoholic beverage samples

露酒、配制酒和果酒中有機酸的種類及含量較為豐富，如配制型果酒系列的葡萄糖酸含量為3 012.05～4 633.49 mg/L，檸檬酸含量為547.02～2 176.51 mg/L，這可能與其配方和生產(chǎn)工藝有關。露酒LJ-5含有11種有機酸，蘋果酸在露酒及果酒中普遍存在且含量較高，含量范圍為16.09～449.71 mg/L。此外，丁二酸在濃香型白酒NXX-1和以濃香型白酒為基酒的露酒LJ-5與LJ-6中有檢出。相較于白酒、露酒、配制酒和果酒，黃酒的乳酸含量最高，為2034.49～4253.49mg/L；蘋果酸、檸檬酸、丁二酸在黃酒中普遍存在，含量分別為9.95～256.98 mg/L、4.39～33.16 mg/L、34.81～223.49 mg/L。

2.6 多元統(tǒng)計分析

2.6.1 不同種類酒樣有機酸的聚類分析

為更深入解析白酒、露酒、果酒及黃酒的有機酸含量的差異特征，分析不同種類酒與有機酸種類及含量之間存在的內(nèi)在聯(lián)系，對不同種類酒的有機酸含量取對數(shù)值后繪制熱圖并進行聚類分析，結(jié)果見圖2。

圖2 不同種類酒樣中有機酸的聚類分析結(jié)果Fig.2 Cluster analysis results of organic acids in different kinds of alcoholic beverage samples

由圖2可知，根據(jù)有機酸在不同種類酒樣中的含量差異，當30個酒樣被分為三大類時，聚類分析能明顯區(qū)分酒樣中的果酒、黃酒及其他酒類。4種配制型果酒GJ-1、GJ-2、GJ-3、GJ-4被歸為一類，其中菠蘿酒GJ-2及蜜桃酒GJ-3歸為一類，其原因可能是所采用的濃香型白酒基酒含量高于其他2種口味的果酒，造成有機酸含量的變化；3種黃酒樣品HJ-1、HJ-2、HJ-3被單獨歸為一類；白酒、露酒和配制酒被歸為一個大類；在白酒、露酒和配制酒更細致的劃分中，露酒樣品LJ-1、LJ-7等被歸為一類；濃香型白酒NXX-1、NXX-2、醬香酒白酒JXX-1等被歸為一類。當白酒被分為兩類時，醬香型白酒JXX-1及其衍生香型芝麻香白酒ZMXX-1被歸為一類，其余香型白酒被歸為一類。在其余香型白酒分類中，大曲清香型白酒QXX-1及麩曲清香型白酒QXX-2被歸為一類，米香型白酒MXX-1被歸為一類；濃香型白酒NXX-1和NXX-2以及濃香型衍生香型的兼香型白酒JiXX-1、鳳香型白酒FXX-1、馥郁香型白酒FYXX-1及特香型白酒TXX-1被歸為一個大類。這是由于兼香型白酒JXX-1、鳳香型白酒FXX-1、馥郁香型白酒FYXX-1及特香型白酒TXX-1含有較多的丁酸、戊酸、己酸，與濃香型白酒的有機酸組成較為相似。兩款露酒LJ-5和LJ-6被歸為一類，其原因是由于使用濃香型白酒作為酒基，具有明顯的濃香型白酒風格。由圖2亦可知，乳酸在黃酒中的含量遠高于其他酒類；己酸主要存在于濃香型白酒以及以濃香型白酒為基礎香型的衍生香型白酒中，如兼香型白酒、鳳香型白酒；葡萄糖酸和檸檬酸則主要存在于果酒以及部分露酒中。

2.6.2 不同種類酒樣有機酸的判別分析

針對不同類型酒樣有機酸種類及含量的差異，可建立OPLS-DA分析模型，對酒樣的分類進行模擬分析，結(jié)果見圖3。由圖3可知，通過OPLS-DA可以將各酒類樣品劃分為白酒、黃酒、露酒、果酒4種類別，由于配制酒PZJ-1和PZJ-2選用大量的白酒作為酒基，因此與白酒樣品重合度較高，而黃酒、果酒、露酒、白酒樣品散點距離較遠，能夠進行有效區(qū)分。利用OPLS-DA可以實現(xiàn)對酒樣類型的歸類，反映不同種類酒中有機酸種類及含量的差異。

圖3 不同種類酒樣有機酸的OPLS-DA散點圖Fig.3 OPLS-DA scatter plots of organic acids in different kinds of alcoholic beverage samples

2.6.3 不同種類酒樣有機酸的主成分分析

對酒樣有機酸定量結(jié)果進行主成分分析（PCA），可以將多個變量歸納為少數(shù)幾個綜合指標，更加有助于直觀的分析酒樣中的有機酸[29]。經(jīng)數(shù)據(jù)處理后表明主成分1（principal component，PC1）中己酸、丁酸、戊酸的載荷系數(shù)絕對值較高，說明這3種有機酸對于酒樣的有機酸分布影響較大；PC2中乳酸、葡萄糖酸、丁二酸的載荷系數(shù)較高，說明它們在PC2成分中有機酸代表性強。以PC1為橫坐標，PC2為縱坐標，得到各酒樣中有機酸主成分分析雙標圖，見圖4。

圖4 不同種類酒樣有機酸的主成分分析Fig.4 Principal component analysis of organic acids in different kinds of alcoholic beverage samples

由圖4可知，各酒樣在象限分布上差異明顯，這表明樣品在有機酸組成上的差異較大。黃酒樣品主要分布于第一象限，被檢測的3個酒樣相對聚集，與其他類型酒樣距離較遠，影響其分布的有機酸主要是乳酸和丁二酸；濃香型白酒NXX-1和NXX-2及以濃香型為基礎衍生香型酒樣分布于第二象限，影響其分布的有機酸為丁酸、己酸、戊酸；清香型和醬香型白酒主要分布于第三象限，影響其分布的特征有機酸為乙酸。露酒LJ-5和LJ-6分布于第二象限，它們使用的酒基為濃香型白酒，因此影響其分布的有機酸與濃香型白酒的相同；露酒LJ-1、LJ-2由于使用較多的濃香型白酒為酒基，因此其分布于第二象限，影響其分布有機酸主要為己酸、丁酸、戊酸、丁二酸；露酒LJ-1、LJ-2、LJ-3、LJ-4和LJ-7主要分布于第四象限，影響其分布的特征有機酸為甲酸。青梅酒GJ-1、石榴酒GJ-4等果酒分布于第四象限，影響其分布的有機酸為檸檬酸、葡萄糖酸、蘋果酸，基于主成分分析可以找到影響不同品類酒分布的特征有機酸，進一步說明在不同酒樣中有機酸組分的差異。

3 結(jié)論

本研究采用高效液相色譜對不同種類酒樣中的13種有機酸進行了測定，該方法檢測限低（0.10～3.67 mg/L）、加標回收率為87.39%～105.24%、有機酸保留時間結(jié)果相對標準偏差（RSD）為0.03%～0.46%、峰面積結(jié)果相對標準偏差（RSD）為0.13%～1.50%，表明該方法精密度及準確度良好。有機酸在不同種類酒樣中的組成及含量差異明顯，乳酸在黃酒中的含量遠高于其他酒類，己酸主要存在于濃香型白酒以及以濃香型白酒的衍生香型白酒中，而葡萄糖酸、檸檬酸則主要存在于果酒中。通過CA和OPLS-DA分析，可以對果酒、黃酒、白酒、露酒做出有效的分類，PCA解析了影響各酒樣分布的特征有機酸，其中影響黃酒分布的有機酸主要是乳酸和丁二酸，影響濃香型白酒及其衍生香型白酒樣品分布的有機酸為丁酸、己酸和戊酸，影響清香型和醬香型白酒分布的有機酸為乙酸，影響果酒分布的有機酸為檸檬酸、葡萄糖酸和蘋果酸。本研究可以為白酒及其他種類成品酒中的多種有機酸同時檢測提供方法借鑒，還能夠為根據(jù)有機酸組成及含量差異為酒類別鑒定和白酒香型鑒別提供一定意義上的理論指導。