超聲輔助一鍋法去除牛骨膠原蛋白肽粉異嗅味物質(zhì)研究

劉 浩 強 宇 張鴻儒 劉俊梅 韓 東 徐 楊 張春暉，*

（1寧夏大學食品與葡萄酒學院，寧夏 銀川 750000；2中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193；3內(nèi)蒙古蒙肽生物工程有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010）

牛是我國珍貴的畜種資源，牛骨中含有豐富的膠原蛋白。研究表明，補充膠原蛋白肽可以增加骨膠原纖維網(wǎng)架的規(guī)則性和牢固性，促進鈣鹽有序沉積，增加骨密度和骨強度［1-3］。牛骨膠原蛋白肽是以牛骨為原料，在酸、堿、熱處理或酶解的作用下得到的產(chǎn)物［4］，然而其高值化加工過程中易產(chǎn)生令人不悅的異嗅味，嚴重制約了該產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

食品異嗅味脫除的方法主要有物理法［5］、生物法［6］、化學法［7］。其中，物理方法是通過活性炭吸附、外源物質(zhì)遮蓋和微膠囊包埋達到部分異味的去除，操作相對復雜且耗時［8-9］；生物法是依據(jù)微生物的代謝使異味化合物轉(zhuǎn)變成無味的物質(zhì)，常被利用在發(fā)酵領(lǐng)域，酶法雖然安全、清潔，但催化效率相對較低［10-11］；化學法是通過美拉德反應、酸堿鹽處理和加入氧化劑來使得異嗅味消失［12］，從而改善食品的品質(zhì)，該方法可控、操作簡單，可以有效脫除異嗅味。

研究表明，可利用超聲波在液體介質(zhì)中的空化作用提高液體化學反應速度和產(chǎn)率［13］，但將超聲波法應用于牛骨膠原蛋白肽除臭的研究較少。本試驗利用氣相色譜-質(zhì)譜法（gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）結(jié)合相對香氣活性值檢測出異嗅味物質(zhì)（脂肪酸）后，借助超聲波輔助氫氧化鈣催化異嗅味物質(zhì)與乙醇發(fā)生酯化反應，使其生成易揮發(fā)的酯類物質(zhì)。此反應中氫氧化鈣既可做為酯化反應的催化劑，也可以用來調(diào)節(jié)肽粉溶液pH值，達到一鍋法除去肽粉異嗅味物質(zhì)并調(diào)節(jié)其pH值的目的，以期為牛骨膠原蛋白肽粉脫臭工藝和工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

異嗅味牛骨膠原蛋白肽粉，內(nèi)蒙古蒙肽生物工程有限公司；2-甲基-3-庚酮，北京潤澤康生物科技有限公司；C7-C40 正構(gòu)烷烴混標，北京佰凱生物科技有限公司；氫氧化鈣（分析純）、福林酚，上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇（分析純），北京市通廣精細化工公司；牛血清蛋白質(zhì)標準溶液，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

GCMS-QP2010Plus 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司；KQ-500B 超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州智博瑞儀器制造有限公司；FE20梅勒特-托利多pH 計，瑞士梅勒特-托利多儀器有限公司；T6 紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；電子眼，英國Verivide DigiEy 公司；H-Spray Mini 噴霧干燥儀，北京霍爾斯生物科技有限公司；MS-H340-S4LCD 數(shù)控加熱型四通道磁力攪拌器，大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）股份有限公司；50/30 μm 二烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）2 cm 固相微萃取頭，美國Supelco 公司；20 mL 頂空采樣瓶，北京廣達恒益科技有限公司；其他常規(guī)儀器設備由中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所提供。

1.3 試驗方法

1.3.1 頂空固相微萃?。╤eadspace solid phase microextraction，HS-SPME）條件 取2 g 牛骨膠原蛋白肽粉置于20 mL 頂空瓶，添加1.5 μL 1.68 μg·μL-1的2-甲基-3-庚酮作為內(nèi)標，密封頂空瓶，采用50/30 μm二烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（DVB/CAR/PDMS）2 cm固相微萃取頭，以萃取溫度37 ℃、平衡時間20 min、萃取時間40 min為條件進行萃取，使頂空瓶中的揮發(fā)性物質(zhì)達到平衡狀態(tài)，氣相色譜（gas chromatography，GC）自動進樣，解析溫度240 ℃，解析5 min。

1.3.2 GC-MS條件 GC條件：色譜柱為CD-WAX彈性石英毛細管（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣為氦氣（99.999%），流速為1.0 mL·min-1；進樣口溫度為240 ℃；不分流進樣。升溫程序：柱溫38 ℃，保持13 min，以3 ℃·min-1升溫至100 ℃，保持5 min，以4 ℃·min-1升溫至150 ℃，以10 ℃·min-1升溫至240 ℃。

質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）條件：離子源溫度200 ℃；電子能量70 eV；發(fā)射電流150 μA；倍增電壓1 037 V；接口溫度220 ℃；質(zhì)量掃描范圍35～450 m/z；電離方式為電子電離（electron ionization，EI）。

1.3.3 GC-MS 定性及定量分析 GC-MS 定性分析：將檢測到的揮發(fā)性物質(zhì)圖譜與NIST17 標準譜庫進行對比并初步鑒定，然后采用與樣品分析相同的色譜條件，以C7～C30 正構(gòu)烷烴作為標準，計算揮發(fā)性化合物的保留指數(shù)，最后結(jié)合保留指數(shù)確定化合物［14］。保留指數(shù)計算公式［15-17］如下：

式中，I：保留指數(shù)；n：碳數(shù)；t：待測揮發(fā)性成分的保留時間，min；tn：具有n個碳原子的正構(gòu)烷烴的保留時間，min；tn+1：具有n+1個碳原子的正構(gòu)烷烴的保留時間，min。

GC-MS 定量分析：采用內(nèi)標法定量［18］。內(nèi)標法定量計算公式如下：

式中，C：測得揮發(fā)性物質(zhì)濃度，μg·kg-1；p1：測得揮發(fā)性物質(zhì)峰面積；m2：加入的內(nèi)標化合物質(zhì)量，μg；p2：測得內(nèi)標化合物峰面積；m1：萃取時加入頂空瓶中肽粉質(zhì)量，kg。

1.3.4 ROAV 法鑒定異嗅味肽粉中特征氣味成分相對香氣活性值（relative aroma activity value，ROAV）計算公式如下：

式中，C：測得揮發(fā)性物質(zhì)濃度，μg·kg-1；OT：測得揮發(fā)性物質(zhì)在水中的氣味閾值，μg·kg-1。

ROAV 可以用來評測某揮發(fā)性物質(zhì)對整體風味的貢獻值，ROAV 越大，該揮發(fā)性物質(zhì)對整體風味貢獻值越大。當ROAV≥1時，認為其為關(guān)鍵風味化合物，對整體風味具有重要的貢獻作用；當0.1≤ROAV＜1 時，認為其對樣品整體風味也具有一定的貢獻作用［19-21］。

1.3.5 感官評價 以滋味、氣味為感官評價指標，其中滋味的權(quán)重為20%，氣味的權(quán)重為80%［12］。邀請12名嗅覺功能正常、不吸煙且品評期間無感冒、鼻塞等干擾嗅聞狀況的受試者組成感官評價小組，包括6名男性，6名女性，年齡分布在22歲至26歲之間，均來自中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，經(jīng)過感官評價訓練后對肽粉進行評價，滿分為100分，感官評分標準［22］見表1。

表1 肽粉感官評分標準Table 1 Sensory scoring standard of peptide powder

1.3.6 肽保留率 肽可與福林酚試劑反應，生成藍色復合物，顏色的深淺與肽含量成正比，采用福林-酚法測定肽含量［23］。按照公式計算肽保留率：

1.3.7 酯化反應脫臭單因素試驗 將肽粉與去離子水配制成濃度為0.2 g·mL-1的溶液，取200 mL 溶液于帶橡膠塞的300 mL 錐形瓶中，在超聲水浴鍋中加熱至80 ℃，用氫氧化鈣調(diào)節(jié)pH 值至10，加入2%乙醇反應30 min，通過噴霧干燥法使其干燥為粉末狀，最后以感官評分、肽保留率為響應指標，采用單因素輪換法［24-25］，以三因素五水平依次考察乙醇添加量（1%、2%、3%、4%、5%）、反應溫度（60、70、80、90、100 ℃）、反應時間（10、20、30、40、50 min）對骨膠原蛋白肽粉異嗅味的影響。反應初始條件為乙醇添加量2%、溫度80 ℃、時間30 min。因素水平見表2。

表2 化學反應脫臭法因素水平表Table 2 Factor level table of chemical reaction deodorization method

1.3.8 噴霧干燥條件 設置進風風量為90%，進風溫度為160 ℃，進料速率為10 mL·min-1，通針300 s，干燥結(jié)束后得到粉末狀脫臭后牛骨膠原蛋白肽粉［26-27］。

1.3.9 酯化反應脫臭響應面試驗 在單因素試驗的基礎上，利用Box-Behnken 試驗設計與分析［28-29］進行三因素三水平響應面優(yōu)化試驗，利用Design Expert 10 軟件對回歸方程進行逐步回歸，以感官評價得分作為響應值確定最佳脫臭工藝條件。

1.3.10 脫臭前后牛骨膠原蛋白肽粉品質(zhì)指標測定總氮的測定參考《GB 5009.5-2016食品安全國家標準 食品中蛋白質(zhì)的測定》［30］?；曳值臏y定參考《GB 5009.4-2016食品安全國家標準 食品中灰分的測定》［31］。水分的測定參考《GB 5009.3-2016食品安全國家標準 食品中水分的測定》［32］。脫臭前后牛骨膠原蛋白肽粉水溶性指數(shù)變化的測定方法如下：精確稱取脫臭前后牛骨膠原蛋白肽粉為m1，放入200 mL 燒杯中，分別加入100 mL蒸餾水，攪拌均勻，在60 ℃水浴鍋中靜置30 min，再于500 r·min-1下離心15 min，取上清液于干燥鋁盒中并用電熱恒溫鼓風干燥箱烘干至恒重，干燥后的殘留物重量記為m2。按照公式計算水溶性指數(shù)［33］：

脫臭前后牛骨膠原蛋白肽粉白度（W）測定：用電子眼測定脫臭前后的肽粉明度指數(shù)和色度指數(shù)，并按以下公式計算其白度［34］：

式中，L、a、b是樣品在Lab系統(tǒng)中的明度指數(shù)和色度指數(shù)，白度值越大，說明其顏色越白。

2 結(jié)果與分析

2.1 異嗅味肽粉揮發(fā)性成分分析

2.1.1 GC-MS 定性分析及定量分析 采用DB-WAX強極性色譜柱對異嗅味牛骨膠原蛋白肽粉中的揮發(fā)性成分進行分離，通過質(zhì)譜和似然比指數(shù)（likelihood ration index，LRI）值進行雙重判定，結(jié)果如表3所示，總離子流圖如圖1 所示。共檢測到32 種揮發(fā)性組分，包括3種烷烴類、6種醇類、1種酚類、6種醛酮類、12種酸類、3 種酯類。由表3 可知，異嗅味牛骨膠原蛋白肽粉揮發(fā)性物質(zhì)中酸類化合物居多。研究表明，酸類化合物的氣味使人不悅［35］，其中濃度最高的為異丁酸（6 488.184 μg·kg-1），其次是己酸、乙酸、丁酸、異戊酸、戊酸等，濃度分別為2 569.26、1 497.86、1 487.75、929.10、500.76 μg·kg-1。

圖1 異嗅味肽粉揮發(fā)性成分的HS-SPME-GC-MS總離子流圖Fig.1 HS-SPME-GC-MS total ion flow diagram of volatile components of isoolfactory peptide powder

表3 異嗅味肽粉的揮發(fā)性成分及相對含量Table 3 Volatile components and relative content of heteroolfactory peptide powder

2.1.2 香氣成分ROAV 值及評價 表4 列出了采用ROAV 法鑒定出的異嗅味肽粉中的6 種氣味活性物質(zhì)（ROAV＞1），這6 種氣味活性化合物都屬于脂肪酸（異丁酸、己酸、乙酸、丁酸、異戊酸、戊酸），其氣味分別描述為窖泥臭、汗臭、酸臭、哈喇味、汗臭、酸臭［36］。ROAV 值最高的為丁酸，為1.54，該物質(zhì)在臭豆腐、白酒［37-38］中的氣味貢獻較大，其次為乙酸、戊酸、異丁酸、己酸，相對香氣活性值分別為1.43、1.29、1.09、1.02，這些氣味描述與異嗅味肽粉所體現(xiàn)出的氣味一致，因此，異丁酸、己酸、乙酸、丁酸、異戊酸、戊酸可能是牛骨膠原蛋白肽粉異嗅味的主要呈味物質(zhì)。

表4 ROAV 法鑒定異嗅味肽粉的特征氣味成分Table 4 characteristic odor components of heteroolfactory peptide powder identified by ROAV method

2.2 酯化反應脫臭單因素試驗結(jié)果分析

2.2.1 乙醇添加量對脫臭效果的影響 由圖2 可知，乙醇添加量對肽保留率影響較?。≒＞0.05），而對感官品質(zhì)影響較大（P＜0.05）。當乙醇添加量為1%時，雖然肽保留率最高（87.22%），但感官評價得分較低（55.03）；當乙醇添加量為3%時，雖然肽保留率較低（82.78%），但感官評價得分最高（70.81），原因可能是3%的乙醇添加量使異嗅味物質(zhì)與乙醇所發(fā)生的乙酯化反應達到動力學平衡［39］。綜上所述，選擇最佳乙醇添加量為3%。

圖2 乙醇添加量對肽粉脫臭的影響Fig.2 Effect of ethanol addition on deodorization of peptide powder

2.2.2 反應溫度對脫臭效果的影響 由圖3 可知，反應溫度對肽保留率影響較大（P＜0.05），而對感官品質(zhì)影響較小（P＞0.05）。當反應溫度為100 ℃時，雖然肽保留率最高（86.70%），但感官評價得分最低（56.70）；當反應溫度為80 ℃時，雖然肽保留率較低（82.70%），但感官評價得分最高（71.14），綜合肽保留率和感官評價得分指標，選擇最佳反應溫度為80 ℃。

圖3 反應溫度對肽粉脫臭的影響Fig.3 Effect of reaction temperature on deodorization of peptide powder

2.2.3 反應時間對脫臭效果的影響 由圖4 可知，反應時間對肽保留率影響較?。≒＞0.05），而對感官品質(zhì)影響較大（P＜0.05）。當反應時間為10 min 時，雖然肽保留率最高（82.80%），但感官評價得分最低（54）；當反應時間為30 min 時，雖然肽保留率較低（72.80%），但感官評價得分最高（71.23），綜合肽保留率和感官評價得分指標，選擇最佳反應時間為30 min。

圖4 反應時間對肽粉脫臭的影響Fig.4 Effect of reaction time on deodorization of peptide powder

2.3 Box-Behnken試驗結(jié)果與分析

2.3.1 模型的建立及顯著性檢驗 在單因素試驗的基礎上，以感官評分（Y）為響應值，以乙醇添加量（X1）、反應溫度（X2）和反應時間（X3）為考察因素進行Box-Behnken試驗，試驗因素與水平見表5，試驗結(jié)果與分析見表6。

表5 肽粉脫臭條件優(yōu)化Box-Behnken試驗因素與水平Table 5 Optimization of deodorization conditions of peptide powder box Behnken test factors and levels

運用Design Expert 10 軟件對表6 中的感官評價得分進行擬合，得到如下回歸方程：Y＝72.71＋1.49X1＋1.90X2＋1.39X3－1.64X1X2－0.56X1X3＋2.61X2X3－3.03X12－4.14X22－4.22X32。

表6 肽粉脫臭條件優(yōu)化Box-Behnken試驗結(jié)果與分析Table 6 Optimization of deodorization conditions of peptide powder box Behnken test results and analysis

對上述回歸方程進行方差分析，結(jié)果見表7。所建立模型P＜0.05，該模型具有較高的可靠性。調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.824，表明牛骨膠原蛋白肽粉感官評分的82.45%來自乙醇添加量、反應溫度和反應時間的影響。方差分析影響牛骨膠原蛋白肽粉除臭的3 個因素的主次順序為X2＞X1＞X3，即反應溫度＞乙醇添加＞反應時間，其中主要因素X2、交互項X2X3以及X12對結(jié)果有顯著影響（P＜0.05），X22、X32對結(jié)果有極顯著影響（P＜0.01）。X1、X3、X1X2和X1X3對結(jié)果無顯著影響（P＞0.05）。

表7 響應面試驗結(jié)果方差分析Table 7 Variance analysis of response surface experiments results

2.3.2 酯化反應的除臭響應面測試結(jié)果分析 除臭響應面測試結(jié)果如圖5 所示。當反應時間固定時，隨著反應溫度和乙醇添加量的增加，牛骨膠原蛋白肽粉脫臭后的感官評價得分先升高后降低。等高線為閉合橢圓形，響應面為凸形，表明反應溫度和乙醇添加量之間的相互作用較大，且具有最大值。

圖5 各因素交互作用對脫臭后肽粉感官評分影響的響應面和等高線Fig.5 Response surface and contour of the interaction of various factors on the sensory score of deodorized peptide powder

在反應溫度一定的情況下，隨著反應時間和乙醇添加量的增加，牛骨膠原蛋白肽粉脫臭后的感官評價得分先升高后降低。輪廓線呈閉合橢圓形，響應面呈凸形，表明反應時間與乙醇添加量之間的相互作用較強，且存在最大值。

當乙醇添加量一定時，隨著反應時間和反應溫度的增加，牛骨膠原蛋白肽粉脫臭后的感官評價得分先升高后降低，且響應面呈凸形，表明反應時間和反應溫度之間的相互作用存在最大值。

由響應面測試分析計算的最佳工藝參數(shù)為反應時間28.43 min、乙醇添加量3.19%、反應溫度75.41 ℃。此時，牛骨膠原蛋白肽粉除臭后的感官評價預測得分為71.16 分。為了便于實際操作，將最佳工藝參數(shù)修改為反應時間28 min、乙醇添加量3%、反應溫度75 ℃。在此條件下，牛骨膠原蛋白肽粉脫臭后的感官評價得分為72.15分，與模型預測值（71.16分）較為一致，驗證了模型的可靠性。

2.3.3 脫臭前后牛骨膠原蛋白肽粉品質(zhì)變化 由表8 可知，異嗅味牛骨膠原蛋白肽粉在優(yōu)化后的總氮含量較優(yōu)化前有輕微下降，說明此脫臭方法對肽粉的總氮含量影響較?。粌?yōu)化后灰分含量增大，推測是因為酯化反應下加入的氫氧化鈣中的鈣離子與牛骨膠原蛋白肽粉發(fā)生螯合，形成的肽鈣螯合物有助于促成骨細胞分化［40-41］；水分含量下降是由于脫臭工藝中的噴霧干燥高溫使其中水分揮發(fā)更多［42］。優(yōu)化樣的溶解度為71.40%，較原樣溶解度（85.70%）有所下降，可能是由于脫臭工藝中噴霧干燥使脫臭前后粉體的比表面積不同，導致肽粉的分散性和溶解性不同［33］。優(yōu)化樣的白度為87.35，較原樣白度（71.60）有所增大，表明脫臭后肽粉顏色也發(fā)生了變化，使肽粉顏色更白，感官更優(yōu)。

表8 脫臭前后肽粉理化指標Table 8 Physical and chemical indexes of peptide powder before and after deodorization

2.3.4 脫臭前后牛骨膠原蛋白肽粉特征氣味物質(zhì)變化 脫臭前后肽粉中所檢測出的異嗅味特征氣味物質(zhì)及含量如表9 所示。脫臭后經(jīng)GC-MS 測定優(yōu)化樣中未檢測出肽粉原樣中呈異嗅味的特征氣味物質(zhì)，表明脫臭效果明顯。

表9 脫臭前后肽粉特征氣味物質(zhì)濃度變化Table 9 Changes of characteristic odorant concentration of peptide powder before and after deodorization

3 討論

在膠原蛋白肽類食品脫臭研究領(lǐng)域，叢瑤等［5］用4 種不同樹脂對魚皮膠原蛋白肽進行脫腥處理，最終確定D4006 樹脂與酶解液添加量為5 g∶100 mL 時，在3 h、25 ℃條件下的脫腥效果最為明顯。陳增鑫等［10］在對海參腸卵酶解液脫腥的研究中，用生姜掩蓋法、活性炭吸附法、大孔樹脂吸附法、酵母發(fā)酵法和乳酸菌發(fā)酵法進行脫腥處理，最終得出在乳酸菌添加量0.40%、反應溫度40 ℃、反應時間10 h 條件下的脫腥效果顯著。張健等［7］對柞蠶蛹免疫蛋白進行脫臭，發(fā)現(xiàn)在固液比1∶10、溫度70 ℃、雙氧水用量2%、時間20 min 條件下基本達到蛹蛋白脫臭效果。綜上，前人研究均采用物理法、生物法、化學法等進行脫臭工藝處理，未在脫腥、脫臭前對異嗅味物質(zhì)進行探究，本研究在對異嗅味牛骨膠原蛋白肽脫臭前通過GC-MS 結(jié)合ROAV 法對異嗅味物質(zhì)進行了鑒定，為后續(xù)有目的性地將這些呈臭味的脂肪酸去除奠定了基礎。

施祺儒等［43］以氫氧化鈉作為催化劑催化聚甘油與脂肪酸反應直接酯化來制備聚甘油脂肪酸酯，黃慧［44］選擇碳酸鈉為催化劑對山梨醇和聚油酸進行的催化反應研究，兩者研究結(jié)果均表明堿類物質(zhì)也可作為酯化反應的催化劑進行反應，本研究在此基礎上利用氫氧化鈣催化異嗅味物質(zhì)與乙醇發(fā)生酯化反應。此法中氫氧化鈣既可作為酯化反應的催化劑，又可用以調(diào)節(jié)肽粉溶液pH值，實現(xiàn)了材料的充分利用。借助單因素試驗、響應面優(yōu)化法對異嗅味牛骨膠原蛋白肽粉進行脫腥除臭工藝研究，效果與單獨使用正交試驗相比，在有多因子參與的情況下試驗結(jié)果更具科學性和說服力［12］。脫臭前后除在白度方面有明顯改善外，各理化指標變化不明顯，說明此方法對牛骨膠原蛋白肽品質(zhì)影響較小，且反應簡捷、高效，對工業(yè)化生產(chǎn)有積極作用。

4 結(jié)論

本研究通過對含異嗅味揮發(fā)性物質(zhì)的牛骨膠原蛋白肽粉進行分析發(fā)現(xiàn)，臭味物質(zhì)主要由異丁酸、己酸、乙酸、丁酸、戊酸、異戊酸組成。單因素和響應面試驗顯示，在反應時間28.43 min、乙醇添加量3.19%、反應溫度75.41 ℃條件下的感官評價得分最高，為71.16，除臭效果明顯。綜上，超聲輔助一鍋法對去除牛骨膠原蛋白肽粉異嗅味物質(zhì)，提高牛骨膠原蛋白肽粉質(zhì)量具有積極的意義。該法完善和發(fā)展了牛骨膠原蛋白肽粉的除臭工藝，對提高牛骨附加值具有重要作用。