連翹與銀杏的乙醇提取物復(fù)配后對番茄枯萎病菌抑制作用初探

楊翼航 羅曉慧 石郭歡 劉寧倩 鞏亞磊 何 瑞

（晉中信息學(xué)院食品與環(huán)境學(xué)院，山西晉中 030805）

番茄（Lycopersicon esculentum），即西紅柿，是管狀花目、茄科、番茄屬的一年生或多年生草本植物，番茄果實營養(yǎng)豐富，可食用，具特殊風(fēng)味，生食可以補(bǔ)充大量的維生素，熟食可補(bǔ)充抗氧化劑，也可以做成鮮美的調(diào)料，如番茄醬等。番茄也有一定的藥用價值，它有顯著止血、降壓、降低膽固醇作用，對治療血友病和癩皮病有特殊功效。番茄是一種重要的經(jīng)濟(jì)類作物，在生長過程中也會遭受各種病害的侵襲，番茄枯萎病是一種嚴(yán)重危害番茄品質(zhì)和產(chǎn)量的土傳性病害，主要由尖孢鐮刀菌（Fusarium.oxysporum）引起，尖孢鐮刀菌屬半知菌亞門、從梗孢目、瘤座孢科、鐮刀菌屬。番茄的幼苗期到成株期均可受到枯萎病菌的侵染。番茄枯萎病菌以菌絲體隨病殘體在土壤、糞肥或附著在種子上越冬，也會在土壤中腐生多年。病菌從幼根或傷口浸入，在植株維管束中擴(kuò)展蔓延，堵塞導(dǎo)管，并產(chǎn)生有毒的番茄凋萎素，隨輸導(dǎo)組織擴(kuò)展，致使維管束變褐、失去輸導(dǎo)功能，葉片萎黃枯死。該菌主要侵染植物導(dǎo)管組織，通過阻塞木質(zhì)部物質(zhì)和水分運輸引起植物萎蔫。同時在宿主體內(nèi)產(chǎn)生以有毒物質(zhì)為主的次級代謝物危害宿主，造成宿主的萎蔫、枯萎甚至腐爛，最終死亡。發(fā)病初期，植株中、下部葉片在中午前后萎蔫，早、晚尚可恢復(fù)，以后萎蔫癥狀逐漸加重，葉片自下而上逐漸變黃，不脫落，直至枯死。有時僅在植株一側(cè)發(fā)病，另一側(cè)莖葉生長正常。莖基部接近地面處呈水浸狀，高濕時產(chǎn)生粉紅色、白色或藍(lán)綠色霉?fàn)钗?，拔出病株，切開病莖基部，可見維管束變?yōu)楹稚Ｄ壳?，尖孢鐮刀菌的防治比較困難，因為其主要存在于土壤中，所以該病害具有較強(qiáng)隱蔽性。在連茬多年田塊中，枯萎病發(fā)病率為20%～40%，并逐年加重，采收前期和中期的減產(chǎn)率分別為發(fā)病率的70%～100%和30%～50%［1-2］。

據(jù)研究調(diào)查，常用化學(xué)農(nóng)藥和大田耕作措施無法達(dá)到防治番茄枯萎病的目的，而且化學(xué)農(nóng)藥還會對生態(tài)環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展造成一定影響。隨著人們對食品、環(huán)境安全的關(guān)注，農(nóng)業(yè)以及食品安全生產(chǎn)及農(nóng)產(chǎn)品的安全性成為了現(xiàn)在比較重要的問題。目前，番茄枯萎病的主要防治手段仍為化學(xué)防治，但化學(xué)農(nóng)藥高毒性、高殘留的特點制約了農(nóng)業(yè)甚至食品產(chǎn)業(yè)安全發(fā)展，植物保護(hù)領(lǐng)域缺少對環(huán)境友好的綠色安全農(nóng)藥。有大量研究表明，部分藥用植物的有機(jī)溶劑提取物具有抑菌活性，對許多病原微生物有抑制作用，李文英等［3］發(fā)現(xiàn)萬壽菊氯仿提取物對番茄葉霉病菌、茄子枯萎病菌和黃芪枯萎病菌的孢子萌發(fā)、菌絲生長速率與菌絲生長量均有不同程度的抑制作用。魏倩倩等［4］發(fā)現(xiàn)丁香、甘草、瑞香狼毒提取物對蘭花枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、甜瓜枯萎病菌等均有良好的抑制效果，其中丁香與瑞香狼毒對供試菌的抑制率達(dá)到了100%。喻林華等［5］發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物對儲藏期柑橘青霉病菌具有較強(qiáng)的抑菌作用。由此可見，藥用植物在制作綠色農(nóng)藥方面有很大的開發(fā)空間。

銀杏（Ginkgo biloba）又稱鴨掌樹，是銀杏科、銀杏屬植物。銀杏為中生代孑遺的稀有樹種，系中國特產(chǎn)資源。多項研究表明，黃酮類、萜類、氨基酸、生物堿、多糖、酚類等是銀杏葉中所含的主要化學(xué)物質(zhì)，具有抗氧化、抑菌、提高免疫、抗炎、抗病毒、降血糖、降血脂、抗腫瘤和抗癌等多項種生物活性，其中黃酮類化合物種類多達(dá)40種，是銀杏中活性較高的有效成分之一，廣泛應(yīng)用于食品、藥品、保健品、化妝品等領(lǐng)域。有關(guān)銀杏提取物提取工藝及其生物活性研究是當(dāng)前研究熱點，其中銀杏提取物（GBE）抑菌性研究近年來備受關(guān)注。銀杏葉中獨有的藥理活性物質(zhì)為黃酮類和萜類。黃酮類主要包括單黃酮類、雙黃酮類以及兒茶素類，其中單黃酮類中的山柰素、槲皮素和異鼠李素含量最高［6］。萜類化合物主要是二萜內(nèi)酯和倍半萜內(nèi)酯。銀杏葉中的重要有效成分為銀杏內(nèi)酯A、B、C、M、J［7］。除黃酮類和萜類2種有效成分外，還含有單糖類、多糖類、有機(jī)酸類、有機(jī)醇類、醛類、酮類、生物堿類、甾醇類、微量元素以及維生素等。多糖類化合物主要存在于銀杏葉中，是銀杏葉中重要的功能因子之一，有較強(qiáng)的抑菌活性、清除活性自由基功能。有研究表明，多糖類化合物抑菌作用的機(jī)理主要是對細(xì)胞膜通透性、核酸形成、抑制蛋白質(zhì)合成、干擾細(xì)胞壁形成以及作為抗代謝物對能量代謝系統(tǒng)產(chǎn)生作用等多個方面實現(xiàn)抑菌作用［8-9］。

連翹（Forsythia suspensa）為木樨科連翹屬落葉灌木，連翹的果實連翹果為雙黃連口服液等中藥制劑的主要原料，對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌等具有抑制作用［10］。王小敏等［11］對連翹果乙醇提取物進(jìn)行了氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）分析，分析結(jié)果鑒定出連翹果乙醇提取物中含有22種物質(zhì)，主要包括醇類、酚類、酮類、酯類等。目前學(xué)者們對連翹中的主要活性抑菌物質(zhì)有不同的認(rèn)識，胡庭俊等［12］認(rèn)為連翹中主要的抑菌活性成分為連翹苷、連翹脂素、熊果酸、蘆丁，而且對多種細(xì)菌、真菌具有抑制作用，但王浴生等［13］經(jīng)過試驗認(rèn)為連翹酚為連翹中的主要活性抑菌物質(zhì)。

連翹果與銀杏葉對植物致病菌抑制作用的相關(guān)研究較少，該試驗研究了銀杏葉與連翹果乙醇提取物及二者復(fù)配后對番茄枯萎病菌的抑菌活性，旨在為番茄枯萎病防治與植源性殺菌劑的開發(fā)方面奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試植物 供試植物為銀杏（葉）與連翹（果），均購自安徽毫州。

1.1.2 供試菌種 番茄枯萎病菌（尖孢鐮刀菌番茄?；虵usarium oxysporumf.sp.lycopersici），由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病理實驗室提供。

1.1.3 儀器和試劑 試劑：95%乙醇、葡萄糖、瓊脂粉、馬鈴薯、濾紙、紗布、12.5 cm雙圈定性濾紙。儀器：涂布棒、鑷子、電熱爐、打孔器、數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州鴻澤實驗科技有限公司）、BSA224S 電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）、DZTW 電子調(diào)溫電熱套（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）、RE-52AA真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、RO DI實驗室超純水機(jī)（上海和泰儀器有限公司）、SHZ-D（III）循環(huán)水式多用真空泵（河南省予華儀器有限公司）、SW-CJ-2F潔凈工作臺（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）、100～1 000 μL 移液槍（濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司）、YXQ-70A立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）、BGZ-146電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）、CX31-32C02光學(xué)顯微鏡（奧林巴斯）、BGZ-250光照培養(yǎng)箱（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 乙醇提取物的制備 摘取連翹果、銀杏葉，洗凈，自然晾干，磨粉待用。取直徑15 cm雙圈定性濾紙疊成濾紙包，取10 g連翹果粉裝入濾紙包內(nèi)，將濾紙包的開口折好并小心放入索氏提取器內(nèi)防止提取過程中連翹果粉灑落到索氏提取器內(nèi)堵塞虹吸管。取10粒左右人造沸石，放于燒瓶內(nèi)，將燒瓶與索氏提取器組裝好，并用鐵架臺固定，用蒸餾水與95%乙醇溶液配置成70%乙醇溶液，向索氏提取器內(nèi)倒入100 mL已配置好的乙醇溶液提前潤濕濾紙包以加快提取效率，待提取器內(nèi)乙醇溶液虹吸到燒瓶內(nèi)后，將冷凝管組裝到索氏提取器上部，并開啟電熱套加熱燒瓶，調(diào)整溫度至乙醇沸騰，提取4 h，得到初步提取物。然后將旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀的水浴鍋溫度調(diào)整至45 ℃，濃縮3 h。刮取經(jīng)濃縮后燒瓶內(nèi)壁的膏狀物質(zhì)于蒸發(fā)皿內(nèi)，用玻璃棒或金屬勺在皿內(nèi)涂抹均勻，將蒸發(fā)皿置于80 ℃的水浴鍋上，使膏狀物質(zhì)進(jìn)一步濃縮，待膏狀物完全在皿內(nèi)干燥后取下蒸發(fā)皿，刮蒸發(fā)皿壁，得粉狀物，將粉狀物裝入到滅菌過的離心管內(nèi)。銀杏提取物制備方法也按上述操作進(jìn)行。取滅菌后的2 mL 離心管7 個，分別稱取連翹提取物200 mg、銀杏提取物200 mg。再分別稱取5個200 mg銀杏、連翹復(fù)配比分別為1∶9、3∶7、5∶5、7∶3、9∶1的復(fù)配物。每個離心管內(nèi)加入1 mL無菌水，吹打混勻，放入超凈臺上備用。

1.2.2 PDA培養(yǎng)基的制備 取200 g馬鈴薯去皮，切成小塊，放入燒杯中加水1 000 mL，在電熱爐上加熱煮爛（馬鈴薯塊可被玻璃棒輕易戳破即可），用4層紗布過濾，取過濾后的溶液加20 g 葡萄糖與15 g 瓊脂，加熱融化后再補(bǔ)足水分1 000 mL，分裝至三角瓶內(nèi)封口后放入高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)121 ℃、0.1 MPa滅菌20 min［14］。

1.2.3 菌種的活化 試驗采用尖孢鐮刀菌番茄?；停‵usarium oxysporumf.sp.lycopersici），該病原菌在4 ℃冰箱中保存，在進(jìn)行抑菌效果的測定前需要在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上（PDA）進(jìn)行活化培養(yǎng)（26 ℃，無光照）。

1.2.4 抑菌活性測定 將滅過菌的培養(yǎng)基加熱融化，在超凈臺內(nèi)倒平板，待平板凝固后用移液槍吸取離心管內(nèi)不同配比的0.5 mL液體，轉(zhuǎn)移至凝固的培養(yǎng)基表面，用涂布棒將液體在培養(yǎng)基表面涂勻。使用直徑為5 mm 的打孔器在活化好菌種的菌落外緣打出1塊菌餅，將菌餅接于涂好的平板上（菌絲面朝平板）。每組設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，同時設(shè)置無菌水為對照組。所有平板在26 ℃無光照情況下培養(yǎng)，記錄菌株的生長情況。

1.2.5 抑菌率的測定 用制作加藥培養(yǎng)基的方式來測定菌餅直徑，并根據(jù)公式計算抑菌率。試驗采取與1.2.1同樣的方法制備足量的乙醇提取物，按1.2.1的配比方案裝入離心管并使用二倍稀釋法制成4 種不同濃度的乙醇提取物（表1）。倒平板時在裝有濃度為200 mg/mL 連翹提取物的離心管內(nèi)取0.5 mL乙醇提取物加入9.5mL培養(yǎng)基內(nèi)，用移液槍吹打混勻，制備成濃度為20 mg/mL 的加藥培養(yǎng)基，并在培養(yǎng)基上接種經(jīng)過活化的菌餅（菌餅直徑為5 mm）。其他不同濃度與不同復(fù)配比的乙醇提取物均按上述操作進(jìn)行，每種處理設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，同時設(shè)置無菌水為對照組。放入培養(yǎng)箱中26 ℃無光照培養(yǎng)，經(jīng)48 h培養(yǎng)后，在培養(yǎng)基上的菌落已具有一定的面積，而且此時的菌餅直徑便于測量，用游標(biāo)卡尺十字交叉法測菌絲直徑，并按照菌絲生長抑制率的公式計算出各處理組的抑菌率，菌絲生長抑制率計算公式如下：

表1 不同濃度的銀杏、連翹及其不同比例的復(fù)配物

菌絲生長抑制率（%）=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-0.5 cm）×100

2 結(jié)果與分析

2.1 不同復(fù)配比乙醇提取物對菌落生長的影響菌落在不同配比的乙醇提取物培養(yǎng)基上生長5 d 后，處理組與對照組出現(xiàn)不同形態(tài)，現(xiàn)選取對菌體抑制效果最明顯的處理組（銀杏葉與連翹果3∶7 復(fù)配物）與對照組進(jìn)行對比。如圖1 所示，經(jīng)過銀杏葉與連翹果3∶7 復(fù)配物處理后的菌落形態(tài)變化較大（如圖1-a）。

圖1-a 中復(fù)配物處理的培養(yǎng)基上生長的菌絲多短小干枯且分布不均勻。同時背面產(chǎn)生色素，使菌落呈現(xiàn)褐色（如圖1-c）。圖1-b 對照組中培養(yǎng)基上生長的菌絲飽滿且生長旺盛，并長滿了整個培養(yǎng)基平面，背面無色素產(chǎn)生（如圖1-d）。

圖1 培養(yǎng)5 d后處理組與對照組的菌落形態(tài)

2.2 乙醇提取物對菌絲生長的影響將銀杏葉與連翹果比例為3∶7的處理組與對照組培養(yǎng)5 d后的菌絲分別做成切片在顯微鏡下觀察（圖2），放大40 倍后觀察發(fā)現(xiàn)處理組的菌絲多為斷裂菌絲，而且附近有大量孢子（圖2-e），對照組的菌絲則生長正常，菌絲體分支較長、飽滿且附近無孢子出現(xiàn)（圖2-f）。

圖2 處理組與對照組的菌絲形態(tài)

2.3 不同濃度的銀杏、連翹及其不同比例復(fù)配物的菌落直徑用游標(biāo)卡尺使用十字交叉法對不同濃度和不同配比的復(fù)配物條件下的菌落直徑進(jìn)行測定，結(jié)果如表2所示：與對照組相比，處理組的菌落直徑均更小。濃度為20.0 mg/mL 的銀杏、連翹及其不同比例復(fù)配物的菌落平均直徑為15.63 cm，其他濃度處理的菌落平均直徑均大于濃度為20.0 mg/mL 的處理組，而且菌落直徑隨乙醇提取物濃度的減小而增加，同濃度下不同比例的復(fù)配物之間的菌落直徑相差不大。

表2 48 h后加入不同濃度的銀杏、連翹及其不同比例的復(fù)配物菌落直徑

2.4 不同濃度的銀杏、連翹及其不同比例復(fù)配物的抑菌率使用表2中不同濃度和不同配比的復(fù)配物條件下的菌落直徑數(shù)據(jù)，計算各處理組的抑菌率。如表3 所示，濃度為20.0 mg/mL 的銀杏、連翹及其不同比例復(fù)配物對菌絲生長有一定抑制作用，而且該濃度下對菌體的抑制效果最好，其中抑菌率最高為16.42%。同濃度下不同比例的復(fù)配物之間抑菌效果相差較大。由表2、3 可知，抑制效果隨提取物濃度降低而下降，并且提取物的濃度越大，抑菌率越高，抑菌效果越好。

表3 48 h后加入不同濃度的銀杏、連翹及其不同比例的復(fù)配物的抑菌率

3 討論

從植物中開發(fā)綠色環(huán)保的新型殺菌劑一直是植物保護(hù)領(lǐng)域研究的重點，當(dāng)確定植物中抑菌活性物質(zhì)后，可將其提純并分離出來，并進(jìn)一步探索其抑菌機(jī)理，后期也可進(jìn)行新型殺菌劑開發(fā)。連翹與銀杏為我國傳統(tǒng)中藥材，該試驗發(fā)現(xiàn)銀杏葉與連翹果乙醇提取物對番茄枯萎病菌有一定抑制作用，經(jīng)過以上試驗發(fā)現(xiàn)，較對照組，經(jīng)二者處理后的菌絲在外觀上顯得更加干枯短小，釋放了大量的次級代謝物，并導(dǎo)致培養(yǎng)基變成褐色。將2個培養(yǎng)皿內(nèi)的菌絲制成切片在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，處理后的菌絲多為斷裂菌絲，且有大量孢子出現(xiàn)，這說明銀杏葉與連翹果的乙醇提取物在與菌絲直接接觸的情況下有一定抑制作用。為進(jìn)一步比較復(fù)配物與單個提取物對菌體的抑制效果，進(jìn)行了后期試驗，但通過后期試驗對菌餅直徑測量發(fā)現(xiàn)，單一乙醇提取物與2種提取物復(fù)配后的抑菌效果并無較大差距，最好的抑菌率在16.42%，目前推測在抑菌活性物質(zhì)提取過程中，提取方法可能造成部分抑菌活性物質(zhì)揮發(fā)或者分解，索氏提取器提取法可能還存在一定局限性，連翹與銀杏體內(nèi)抑菌活性物質(zhì)的提取工藝仍有待改進(jìn)，若想進(jìn)一步提高提取效率，可試用超聲波萃取法［15］對連翹和銀杏體內(nèi)抑菌活性物質(zhì)進(jìn)行提取。番茄枯萎病菌屬于土傳性致病真菌，目前缺乏有效防治策略和措施，其監(jiān)測困難、侵染機(jī)制多變、土壤結(jié)果多樣與其微環(huán)境多樣導(dǎo)致對尖孢鐮刀菌的防治極其困難［16］。由藥用植物制成的植源性殺菌劑來源于自然，相對于化學(xué)殺菌劑更加綠色環(huán)保，利用藥用植物開發(fā)出天然綠色殺菌劑也是綠色農(nóng)業(yè)的發(fā)展方向，對植物中抑菌活性物質(zhì)的篩選與抑菌機(jī)理的研究將是今后植物保護(hù)領(lǐng)域的研究熱點之一。

4 結(jié)論

該試驗發(fā)現(xiàn)，連翹果與銀杏葉乙醇提取物對番茄枯萎病菌有一定抑制作用，主要體現(xiàn)為造成不利環(huán)境抑制菌體生長，使菌絲變短小干枯，其中濃度為20.0 mg/mL的乙醇提取物抑菌效果最好，在該濃度下復(fù)配比為3∶7的乙醇提取物對菌落與菌絲形態(tài)影響較大：菌絲多短小干枯且分布不均勻，同時背面產(chǎn)生色素，使菌落呈現(xiàn)褐色，在顯微鏡下觀察菌絲切片發(fā)現(xiàn)菌絲多為斷裂菌絲，而且菌絲附近有大量孢子產(chǎn)生。在不同濃度下不同比例復(fù)配物與單一乙醇提取物之間的抑菌效果并無較大差異。連翹果與銀杏葉乙醇提取物的抑菌機(jī)理還有待探尋，二者體內(nèi)抑菌活性物質(zhì)提取工藝還有待改進(jìn)，在發(fā)展綠色殺菌劑和防治番茄枯萎病這一領(lǐng)域還有待后續(xù)進(jìn)一步研究。