油茶胚性愈傷組織誘導(dǎo)研究

吳紹鑫 全旭林 黎衛(wèi)東 冉朝輝 付素靜，2 胡玉玲，2

（1銅仁學(xué)院農(nóng)林工程與規(guī)劃學(xué)院，貴州銅仁 554300；2貴州省梵凈山地區(qū)生物多樣性保護與利用重點實驗室，貴州銅仁 554300）

油茶（Camellia oleiferaAbel.）是世界四大木本油料之一，同時也是我國主要的木本油料，具有“東方橄欖油”的美稱，茶油中不飽和脂肪酸含量高達(dá)90%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于菜油、花生油和豆油，并且含有山茶甙等特定生理活性物質(zhì)［1］。

油茶在我國有一定的栽培歷史，但是同其他山茶屬植物一樣，其細(xì)胞不易誘導(dǎo)分化產(chǎn)生再生植株，造成油茶組織培養(yǎng)的難度較大。油茶幼胚再生體系還不完善，需要利用現(xiàn)代科技進一步研究和優(yōu)化油茶幼胚再生的培育方法，以提高油茶的栽培成功率，增加油茶的產(chǎn)量和油茶的經(jīng)濟效益［2］。因此，油茶幼胚再生體系優(yōu)化是重中之重的問題，可以更好地提高油茶產(chǎn)量，增加油茶產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展能力。我國油茶組培再生體系的研究始于20世紀(jì)80年代，顏慕勤等［3］認(rèn)為油茶的愈傷組織起源于單細(xì)胞或者多細(xì)胞團。隨后隆振雄［4］和盧天玲［5］先后利用油茶未成熟幼胚子葉作為外植體進行再生體系構(gòu)建，均成功獲得再生植株。在此之后，油茶的再生體系研究進入停滯時期。進入21世紀(jì)，油茶組培相關(guān)研究和文獻(xiàn)才開始逐漸增多。張智俊等［6］用湘林4號油茶的腋芽和子葉為外植體，成功誘導(dǎo)出愈傷組織并分化成完整植株。畢方誠等［7］用莖段、幼胚及子葉為外植體進行離體培養(yǎng)，獲得了再生植株。

本研究針對油茶幼胚再生體系不完善的問題，期望從中找出適合于愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基種類，以提高油茶幼胚再生效率，獲取更多的易再生油茶基因型。

1 材料與方法

1.1 試驗材料采集及處理

1.1.1 外植體的采集和儲存 采集點位于銅仁市松桃縣正大鄉(xiāng)，采取7—8月快速生長期［8］的不同油茶樹的果實為試驗材料。對不同品種的油茶果實進行編號，分別于7月15日和8月5日進行采樣，選擇健康、外觀大小一致的茶果，且在晴天的上午采摘，降低污染率。將采回的油茶果實放入4 ℃冰箱保存，適合的低溫有利于促進細(xì)胞的分裂。

1.1.2 無菌體系的建立 把試驗用的油茶果用解剖刀剝開油茶外果皮，小心取出里面的種子，按編號放入瓶中流水沖洗30 min以上，轉(zhuǎn)入超凈工作臺用75%的酒精消毒30 s，無菌水清洗4～5次，再用2%的次氯酸鈉溶液浸泡5 min，再用無菌水清洗4～5次，在消毒與清洗的過程中，不停搖晃，使外植體表面和消毒液、無菌水充分接觸，以提高消毒效率，盡量降低消毒液對材料的毒害作用。在無菌操作臺上使用鑷子和解剖刀小心地去除種皮，把油茶幼胚等分切成2～4份，接種到無菌培養(yǎng)基中。每瓶培養(yǎng)基接種一個外植體，每處理接種15瓶，每處理重復(fù)3次，觀察記錄外植體存活情況以及愈傷組織誘導(dǎo)狀況。

1.1.3 愈傷組織誘導(dǎo) 把經(jīng)過滅菌后的外植體接種到添加了不同濃度的NAA、6-BA、KT、TDZ的MS、WPM培養(yǎng)基中，并添加0.5 g/L的活性炭降低外植體組培褐化率，培養(yǎng)基pH為5.8，使用不同水平的正交試驗設(shè)計，見表1。

表1 L16（81+28）正交

續(xù)表1 L16（81+28）正交

1.2 培養(yǎng)環(huán)境在培養(yǎng)室進行油茶幼胚組培苗無菌體系建立，接種后將其放置于培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光照強度為1 500 lx的日光燈下，光照時間為12 h/d。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析計算外植體的存活率和愈傷組織誘導(dǎo)率，公式如下：

存活率（%）=（接種外植體總數(shù)－外植體褐化個數(shù)）/接種外植體總數(shù)×100；

誘導(dǎo)率（%）=誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體個數(shù)/接種外植體總數(shù)×100；

胚性愈傷組織誘導(dǎo)率（%）=胚性愈傷組織塊數(shù)/接種外植體數(shù)×100

使用Microsoft Excel 2016 軟件進行數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計和做圖等，用SPSS 25.0 統(tǒng)計分析軟件進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 各因素對愈傷組織誘導(dǎo)的影響從表2可以看出，各因素中對愈傷組織的誘導(dǎo)影響最顯著的為品種>培養(yǎng)基>NAA>TDZ，其他的因子對愈傷組織的誘導(dǎo)沒有顯著性影響。不同品種對愈傷組織的誘導(dǎo)率為小型茶果>大果品種1>晚熟品種1>大果品種3>大果品種2>早熟品種2>早熟品種1>晚熟品種2。不同基本培養(yǎng)基對愈傷組織誘導(dǎo)率為MS>WPM。添加了1.0 mg/L的NAA培養(yǎng)基對愈傷組織的誘導(dǎo)率有顯著影響。從愈傷組織的誘導(dǎo)率來看，油茶幼胚最適的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為2號和15號培養(yǎng)基，其配方分別為：MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+1.0 mg/L TDZ和MS+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L KT+1.0 mg/L TDZ，愈傷組織誘導(dǎo)率均達(dá)到100%，其中2號培養(yǎng)基中愈傷組織有膨大凸起，鑒定為胚性愈傷組織，且體積增大效果最好。

表2 不同培養(yǎng)基和植物激素對油茶幼胚愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.2 不同因素間互作效益對愈傷組織誘導(dǎo)的影響由表3可以看出，NAA與KT和6-BA與TDZ之間的互作效益對愈傷組織的誘導(dǎo)具有顯著性的效果（P<0.05），而其他因子之間的互作效益對愈傷組織的誘導(dǎo)不具有顯著性的效果（P>0.05）。

表3 不同因素間互作效益

2.3 多因素間互作效益對愈傷組織誘導(dǎo)的影響由表4可以看出，不同多因素組合的互作效益對愈傷組織的影響效果不同，6-BA與KT與TDZ之間的多因素互作效益對愈傷組織的誘導(dǎo)具有極顯著性的效果（P<0.01），但是其他多因素之間的互作效益對愈傷組織的誘導(dǎo)不具有顯著性的效果（P>0.05）。而6-BA與KT與TDZ之間的多因素互作效益不止能極顯著的誘導(dǎo)萌發(fā)成愈傷組織，還能明顯增加愈傷組織的發(fā)育速度。如圖1、2所示，2號培養(yǎng)基的胚性愈傷組織體積明顯高于其他處理的愈傷組織體積。

表4 多因素間互作效益

圖1 2號培養(yǎng)基中的胚性愈傷組織

圖2 1號培養(yǎng)基中的愈傷組織

3 小結(jié)與討論

本研究以銅仁市松桃縣正大鄉(xiāng)7—8月快速生長期普通油茶幼胚為外植體，研究了不同品種、不同發(fā)育時期、不同培養(yǎng)基、不同激素種類及濃度、不同培養(yǎng)條件等6個因素的不同水平組合對于胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響，對油茶幼胚再生體系進行優(yōu)化探索。

油茶是喜酸性土壤的植物，但是對于組培來說，培養(yǎng)基酸性的程度并不影響油茶幼胚在不同pH的培養(yǎng)基中對愈傷組織誘導(dǎo)情況，有研究認(rèn)為隨著pH上升，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率略有增加，但影響不顯著，對愈傷組織類型也不影響［9］。因此，本研究培養(yǎng)基的pH為5.8。

單因素中愈傷組織的誘導(dǎo)影響為品種＞培養(yǎng)基＞NAA＞TDZ，其他的因子對愈傷組織的誘導(dǎo)沒有顯著性影響，但是不同激素種類對愈傷組織的誘導(dǎo)具有顯著性差異，其中最佳的為6-BA+KT+TDZ，因此油茶胚性愈傷組織誘導(dǎo)配方為：MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+1.0 mg/L TDZ，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到100%，體積增大效果最好。

對于本試驗來說，基本培養(yǎng)基為MS時，愈傷組織誘導(dǎo)率為89.13%，基本培養(yǎng)基為WPM時，愈傷組織誘導(dǎo)率僅為57.13%，說明MS基本培養(yǎng)基更適于油茶愈傷組織的誘導(dǎo)。但在油茶幼胚的誘導(dǎo)中，胡玉玲等［9］認(rèn)為MS更為適合，賈效成等［10］認(rèn)為WPM作為基本培養(yǎng)基最適合，可以看出油茶幼胚誘導(dǎo)成愈傷組織的最適培養(yǎng)基還未明確，也可能與不同的激素種類及濃度的互作效益有關(guān)，因此還需要進一步探索。