赤芍總苷對(duì)腦出血大鼠神經(jīng)功能損傷的改善及對(duì)腦組織中Treg/Th17比例的影響

賈傳宇，王舒陽(yáng)，管海博

腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是一種非創(chuàng)傷性血管破裂，導(dǎo)致血液在腦實(shí)質(zhì)內(nèi)聚集的高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率的常見難治性腦血管疾病之一[1]。腦出血后能激活小膠質(zhì)細(xì)胞分泌大量毒性物質(zhì)，進(jìn)而引起腦水腫、神經(jīng)元損傷和神經(jīng)功能損傷[2]。研究表明，炎癥在腦出血誘發(fā)的繼發(fā)性損傷中起著重要作用，并且活化的小膠質(zhì)細(xì)胞釋放的炎性因子加劇了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)損傷[3]。輔助性T細(xì)胞17(Th17)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)是兩類重要的CD4+T細(xì)胞免疫細(xì)胞亞群[4]。Th17細(xì)胞能夠促進(jìn)炎癥反應(yīng)，主要分泌白細(xì)胞介素(IL)-17等炎性因子，而Treg細(xì)胞能夠抑制炎癥反應(yīng)，主要分泌IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)等炎性因子，機(jī)體穩(wěn)定時(shí)，Treg/Th17相對(duì)平衡，平衡被打破則會(huì)引起多種疾病[5]。近年來，臨床治療腦出血困難，但一些中藥對(duì)治療腦出血表現(xiàn)出良好的效果，赤芍就是治療腦出血的藥物之一。赤芍具有抗凝、抗栓和改善血液循環(huán)的功效，其有效成分為芍藥苷、芍藥新苷、芍藥花苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷、氧化芍藥苷等單萜苷類化合物，統(tǒng)稱赤芍總苷(total paeony glycoside，TPG)[6]。本研究通過探索赤芍總苷對(duì)腦出血大鼠神經(jīng)功能損傷的改善及對(duì)腦組織中Treg/Th17比例的影響，為赤芍總苷治療腦出血提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 50只無特定病原體(SPF)級(jí)成年Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠，體質(zhì)量260～300 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司提供，許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006。所有大鼠均飼養(yǎng)于溫度、濕度適宜的清潔無菌環(huán)境，自由飲水和攝取食物。所有實(shí)驗(yàn)均獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)同意。

1.2 儀器與試劑 腦立體定位儀購(gòu)于美國(guó)Stoelting公司；水合氯醛、乙醇、甲醛均購(gòu)自北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司；IL-17、IL-10和TGF-β 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)試劑盒均購(gòu)自賽默飛世爾科技公司；大鼠抗CD3 APC、CD4 FITC、CD8 PerCP、CD25 APC、FoxP3 PE、IL17A PE均購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組與造模 選取50只SPF級(jí)成年SD雄性大鼠，隨機(jī)分為5組：空白組、腦出血組、赤芍總苷高劑量組、赤芍總苷中劑量組和赤芍總苷低劑量組，每組10只。腦出血大鼠造模參照自體血局部注入法進(jìn)行[7]?？瞻捉M：正常飼養(yǎng)大鼠；腦出血組：使用10%的水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，俯臥固定于腦立體定位儀上，剪毛消毒后，在頭皮正中線上縱向切開10 mm露出前囟，然后在前囟的前0.2 mm、右3.0 mm處使用三棱針鉆開顱骨，進(jìn)針深度為5.5 mm，直徑為0.5 mm。在尾尖0.5 cm處斬?cái)嗍笪?，?00 μL血，以10 μL/min的速度緩慢注入，留針15～20 min后緩慢退出，用骨蠟封閉顱骨，縫合皮膚并消毒。赤芍總苷高劑量組：同腦出血組方法制造腦出血模型，于造模1 h后腹腔注射200 mg/kg赤芍總苷，每日1次，連續(xù)7 d；赤芍總苷中劑量組：同腦出血組方法制造腦出血模型，于造模1 h后腹腔注射100 mg/kg赤芍總苷，每日1次，連續(xù)7 d；赤芍總苷低劑量組：同腦出血組方法制造腦出血模型，于造模1 h后腹腔注射50 mg/kg赤芍總苷，每日1次，連續(xù)7 d。

1.3.2 神經(jīng)功能損傷評(píng)估 參照Bederson評(píng)分[8]方法，于造模后6 h、1 d、2 d、3 d、7 d進(jìn)行神經(jīng)功能損傷評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下，0級(jí)：無神經(jīng)功能損傷，計(jì)0分；1級(jí)：大鼠前肢出現(xiàn)彎曲，計(jì)1分；2級(jí)：前肢抵抗對(duì)側(cè)推力減弱，計(jì)2分；3級(jí)：前肢抵抗對(duì)側(cè)推力減弱，有旋轉(zhuǎn)現(xiàn)象，計(jì)3分。

1.3.3 腦組織蘇木精-伊紅(HE)染色 將大鼠麻醉后取出大腦，放入福爾馬林溶液中固定，經(jīng)過脫水和包埋后，制作石蠟切片(厚度為5 μm)，然后進(jìn)行HE染色，再使用梯度乙醇脫水，二甲苯透明，最后使用中性樹膠封片，并在光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織。

1.3.4 ELISA法檢測(cè)腦組織中IL-17、IL-10和TGF-β的含量 將大鼠麻醉后取出大腦，立即置于液氮研磨，提取蛋白，使用ELISA法按照試劑盒說明書檢測(cè)腦組織中IL-17、IL-10和TGF-β的含量。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腦組織中Treg/Th17的變化 將大鼠麻醉后取出大腦，使用生理鹽水沖洗腦組織，剪碎放入磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中，加入1 mL 0.25%的胰酶，在37 ℃放置10 min；加入血清終止后，使用30目尼龍網(wǎng)過濾并離心，使用PBS稀釋成單細(xì)胞懸液，并調(diào)整細(xì)胞濃度至5×109/L。取單細(xì)胞懸液，離心后用4%的多聚甲醛固定30 min，然后使用0.1%的Triton X-100處理15 min，再使用10%牛血清白蛋白(BSA)-PBS重懸。使用CD3+、CD8-、IL-17A+標(biāo)記Th17細(xì)胞，CD4+、CD25+、FoxP3+標(biāo)記Treg細(xì)胞，然后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th細(xì)胞亞群比例。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分 與空白組相比，腦出血組各個(gè)時(shí)間段大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在造模后6 h、1 d和2 d，赤芍總苷高劑量組和赤芍總苷中劑量組大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分與腦出血組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在造模后3 d和7 d，與腦出血組相比，赤芍總苷高劑量組和赤芍總苷中劑量組大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分明顯降低，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；赤芍總苷低劑量組各時(shí)間段大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分與腦出血組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分(±s) 單位：分

2.2 各組大鼠腦組織一般病理形態(tài)學(xué)光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果 空白組大鼠腦組織細(xì)胞排列整齊有序，染色均勻，未見間質(zhì)水腫和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；腦出血組大鼠腦組織疏松，排列不整齊，細(xì)胞呈氣球樣變，壞死，且神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死，有明顯間質(zhì)水腫和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象；赤芍總苷高劑量組和赤芍總苷中劑量組大腦組織病變明顯改善，神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死數(shù)量減少，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕；赤芍總苷低劑量組腦組織疏松有所改善，但排列仍不整齊，神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死數(shù)量未見明顯減少，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)也未明顯減少。

2.3 ELISA法檢測(cè)腦組織中IL-17、IL-10和TGF-β的含量 與空白組相比，腦出血組腦組織中IL-17含量明顯升高，IL-10和TGF-β含量明顯降低，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與腦出血組比較，赤芍總苷高劑量組和赤芍總苷中劑量組腦組織中IL-17含量明顯降低，IL-10和TGF-β含量明顯升高，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；赤芍總苷低劑量組大鼠腦組織中IL-17、IL-10和TGF-β含量與腦出血組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠腦組織中IL-17、IL-10和TGF-β含量比較(±s) 單位：ng/mL

2.4 流式細(xì)胞術(shù)分析腦組織Th17和Treg的比例 與空白組相比，腦出血組單個(gè)腦組織細(xì)胞液中Th17比例和Th17/Treg比值明顯升高，Treg比例明顯降低，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與腦出血組相比，赤芍總苷高劑量組和赤芍總苷中劑量組單個(gè)腦組織細(xì)胞液中，Th17比例和Th17/Treg比值明顯降低，Treg比例明顯升高，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；赤芍總苷低劑量組在單個(gè)腦組織細(xì)胞液中Th17比例、Treg比例及Th17/Treg比值與腦出血組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠單個(gè)腦組織細(xì)胞液中Th17比例、Treg比例及Th17/Treg比值比較(±s)

3 討 論

腦出血是腦血管疾病腦卒中的第二大類型，具有高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率的特點(diǎn)，腦出血后易出現(xiàn)炎性反應(yīng)，其中，炎性介質(zhì)可通過損傷腦組織破壞腦屏障或加重腦水腫導(dǎo)致腦損傷[9]。Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞能夠分泌多種炎性因子，且Th17/Treg平衡在炎癥反應(yīng)中也起著重要的作用[10]。赤芍總苷具有調(diào)節(jié)免疫力、消炎和鎮(zhèn)痛等作用[11]。本研究探索赤芍總苷對(duì)腦出血大鼠神經(jīng)功能損傷的改善及對(duì)腦組織中Treg/Th17比例的影響，從而為治療腦出血藥物的赤芍總苷提供一定的理論依據(jù)。

由大鼠腦組織病理切片圖和神經(jīng)功能評(píng)分可知，赤芍總苷對(duì)腦出血大鼠神經(jīng)功能損傷具有改善作用，赤芍總苷具有神經(jīng)保護(hù)作用，可抑制腦出血后水腫的發(fā)生。其機(jī)制尚未明確，具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究，但赤芍總苷的芍藥苷能調(diào)節(jié)G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)、腺苷酸活化蛋白激酶(MAPK)/核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、Janus激酶2(JAK2)/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子(STAT3)等信號(hào)通路[12]。

有研究表明，缺血性腦卒中病人的外周血中有Th17/Treg功能失衡的表現(xiàn)[13]。本研究中，腦出血大鼠腦組織中Th17細(xì)胞和其分泌的炎性因子IL-17增加；而Treg細(xì)胞和其分泌的炎性因子IL-10、TGF-β減少，Th17/Treg細(xì)胞比值明顯升高，為Th17/Treg平衡參與腦出血的生理病理過程提供了新依據(jù)。本研究還表明，赤芍總苷可顯著降低Th17細(xì)胞和其分泌的炎性因子IL-17水平；而Treg細(xì)胞和其分泌的炎性因子IL-10、TGF-β水平明顯升高，說明赤芍總苷將炎癥環(huán)境變?yōu)榭寡谞顟B(tài)，從而改善腦出血癥狀。有研究表明，結(jié)腸炎也與Th17和Treg細(xì)胞之間的平衡有關(guān)，而赤芍總苷可以通過調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞的分化和細(xì)胞因子的分泌而改善結(jié)腸炎[14]。

有關(guān)赤芍總苷改善腦出血的研究極少，本研究為赤芍總苷改善腦出血癥狀提供了一定的依據(jù)，但本研究有一定不足之處：只研究了赤芍總苷調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡，其具體機(jī)制尚未清晰，還需要進(jìn)一步研究。