不同金銀花枝葉發(fā)酵產物的抑菌及抗氧化活性研究

王乾芬 李 鵬 徐 萍 徐小博

（新鄉(xiāng)學院生命科學與基礎醫(yī)學學院，河南新鄉(xiāng) 453003）

金銀花（Lonicera japonicaThunb.）是忍冬科忍冬屬植物忍冬的干燥花蕾或初開的花，性甘、寒，味淡、微苦，具有清熱解毒、消炎退腫的功效，是一種傳統(tǒng)的中藥材［1-3］。研究分析發(fā)現(xiàn)，金銀花中的活性物質主要有木犀草苷、肌醇、咖啡酸、綠原酸以及黃酮類等，藥理實驗證明其具有抗菌及抗氧化的作用［4-5］。

金銀花的枝葉產量遠大于花，藥用資源豐富，成本更為低廉。有研究表明，金銀花枝葉中活性成分及作用與花相似，具有較好的抑菌和抗氧化效果［6-9］。但是，金銀花枝葉常常被廢棄，并未發(fā)揮出其有效的藥用價值。發(fā)酵提取法對藥用植物中多種活性成分有較高的提取率，發(fā)酵后金銀花浸提液抗氧化性及抑菌性有所提高［10-12］。微生物發(fā)酵研究主要集中于金銀花，綜合比較不同微生物發(fā)酵金銀花枝葉的研究未見報道。因此，本文分別利用酵母菌、乳酸菌、雙歧桿菌及枯草芽孢桿菌對金銀花枝葉進行發(fā)酵，對比了發(fā)酵產物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及枯草芽孢桿菌的抑菌效果，并通過測定發(fā)酵產物清除ABTS+自由基、DPPH自由基的能力及對FRAP亞鐵離子的還原能力來評估發(fā)酵產物的抗氧化能力，為提高金銀花枝葉的利用價值以及合理利用金銀花枝葉提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料金銀花枝葉由新鄉(xiāng)市博凱生物技術有限公司提供，脫水烘干后進行粉碎，濾篩棄去濾渣保存?zhèn)溆?。雙歧桿菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌、乳酸菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌由新鄉(xiāng)學院生命科學與基礎醫(yī)學學院實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵產物制備 分別將1 g乳酸菌、酵母菌、雙歧桿菌、枯草芽孢桿菌加水溶解，并定容至10 mL。菌種按照要求接種于含6 mL MRS及1 g金銀花枝葉粉的三角瓶中進行培養(yǎng)。乳酸菌接種量為7%，38 ℃培養(yǎng)15 h；雙歧桿菌接種量為5%，44 ℃培養(yǎng)6 h；酵母菌接種量為6%，37 ℃培養(yǎng)5 h；枯草芽孢桿菌接種量為7%，38 ℃培養(yǎng)4 h。利用70%的乙醇進行超聲提取（250 W、35 kHz、30 min），重復3次。提取液繼續(xù)進行離心（4 000 r/min、5 min）濃縮。

1.2.2 抑菌能力測定 分別將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌100 μL、106個/mL的菌懸液均勻涂布于培養(yǎng)基上，使用打孔器均勻打孔，取50 μL發(fā)酵產物至孔中，37 ℃培養(yǎng)24 h。以無菌水為陰性對照，青霉素溶液（0.05 g青霉素溶于2 mL蒸餾水中，稀釋10-2）為陽性對照。

配制濃度為225、200、175、150、125 mg/mL的樣品液。取0.10 mL菌懸液加4.90 mL培養(yǎng)基為對照組；取4.80 mL培養(yǎng)基和0.10 mL菌懸液，加入0.10 mL待測樣品為樣品組?；靹蚝蠛銣嘏囵B(yǎng)24 h，于600 nm處測OD值，試驗重復3次，以青霉素溶液作為陽性對照。按照公式（1）計算抑菌率，并計算出抑菌率為50%時所用物質的濃度值即為半抑制濃度（IC50值）。

1.2.3 抗氧化能力測定

1.2.3.1 發(fā)酵產物配制 配制發(fā)酵產物濃度梯度為0.01、0.02、0.05、0.10、0.15、0.20及0.23 mg/mL的樣品液。

1.2.3.2 DPPH自由基清除能力測定 DPPH自由基清除能力的測定參考文獻［6、13、14］。取發(fā)酵產物和DPPH溶液各1.0 mL，以1.0 mL10% DMSO水溶液和1.0 mL 95%乙醇混合液為參比，于517 nm處測定吸光度，為樣品組；取1.0 mL 10%DMSO加入1.0 mL DPPH溶液為對照組；取1.0 mL供試溶液加入1.0 mL 95%乙醇為空白對照。以未發(fā)酵的金銀花枝葉為對照，以BHT為陽性對照，按公式（2）計算清除率。

并計算出清除率為50%時所用物質的濃度值即為IC50值。

1.2.3.3 ABTS+自由基清除能力的測定 ABTS+自由基清除能力的測定參照文獻［6、13］。100 μL發(fā)酵產物加入900 μL ABTS+·溶液為樣品組，100 μL 10% DMSO水溶液和900 μL ABTS+·溶液為對照組，100 μL供試溶液和900 μL乙醇為空白組。室溫放置10 min，于734 nm測定吸光度，以未發(fā)酵的提取物為對照，以BHT為陽性對照，按公式（2）計算清除率，并計算出清除率為50%時所用物質的濃度值即為IC50值。

1.2.3.4 FRAP亞鐵離子還原能力的測定 FRAP亞鐵離子還原能力的測定參照文獻［15-16］。以10 μL發(fā)酵產物加200 μL FRAP工作液為樣品組，10 μL 10% DMSO水溶液和200 μL FRAP工作液為對照組，10 μL供試溶液加200 μL乙醇為空白組。混合均勻，37 ℃溫育適宜時間，于593 nm測定吸光度，以未發(fā)酵的提取物為對照，以BHT、BHA及PG為陽性對照，按照公式（2）計算清除率，并計算出清除率為50%時所用物質的濃度值即為IC50值。測定0.1～1.6 mmol/L的標準FeSO4溶液的OD值，并繪制標準曲線。用0.5 mmol/L FeSO4為對比標準，當樣品抗氧化活性與其達到同一吸光度值時得到一個FRAP值。

2 結果與分析

2.1 不同發(fā)酵產物對3種致病菌的抑菌能力發(fā)酵產物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及枯草芽孢桿菌均產生了抑菌圈，這表明發(fā)酵產物對3種致病菌有一定的抑菌效果，圖1列出了4種發(fā)酵產物對金黃色葡萄球菌的抑菌圖片。

圖1 發(fā)酵產物對金黃色葡萄球菌的抑菌情況

發(fā)酵產物對細菌的IC50對比結果見圖2，發(fā)酵產物抑菌率與提取物濃度呈負相關。由圖2可知，乳酸菌發(fā)酵產物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑制能力最強，酵母菌發(fā)酵產物對枯草芽孢桿菌抑制能力最強?？莶菅挎邨U菌發(fā)酵產物對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌抑制能力最弱，酵母菌發(fā)酵產物對金黃色葡萄球菌抑制能力最弱。

圖2 發(fā)酵產物對細菌的半抑制濃度對比

2.2 不同發(fā)酵產物的抗氧化能力

2.2.1 不同發(fā)酵產物對DPPH自由基的清除能力 圖3為不同樣品IC50值的對比，IC50值越小，發(fā)酵產物清除相同數(shù)量的DPPH自由基所需樣品液就越少。由圖3可知，4種發(fā)酵產物中，乳酸菌發(fā)酵產物清除DPPH能力最強（0.07 mg/mL），枯草芽孢桿菌發(fā)酵產物清除DPPH能力最弱（0.09 mg/mL），且4種發(fā)酵產物比未發(fā)酵提取物的清除DPPH能力更強（未發(fā)酵提取物的IC50值為0.16 mg/mL）。

圖3 樣品對DPPH自由基的清除能力對比

2.2.2 不同發(fā)酵產物對ABTS+自由基的清除能力 圖4為不同樣品IC50值的對比，IC50值越小，發(fā)酵產物清除相同數(shù)量的ABTS+自由基所需樣品液就越少。由圖4可知，4種發(fā)酵產物中，酵母菌發(fā)酵產物清除ABTS+能力最強（IC50為0.06 mg/mL），雙歧桿菌發(fā)酵產物清除ABTS+能力最弱（IC50為0.10 mg/mL），但4種發(fā)酵產物均比未發(fā)酵提取物的清除ABTS+能力強（IC50為0.14 mg/mL）。

圖4 樣品對ABTS+自由基的清除能力對比

2.2.3 不同發(fā)酵產物還原亞鐵離子的能力 不同濃度FeSO4溶液在593 nm處與其吸光值呈良好的線性關系，線性方程為y=1.462 7x+0.258 0（R2=0.998 9），x為FeSO4溶液濃度，y為吸光值。

根據(jù)回歸方程，計算可得不同發(fā)酵產物和抗氧化劑BHT、BHA、PG以及未發(fā)酵提取物的IC50值，結果對比見圖5。發(fā)酵產物亞鐵離子還原能力與提取物濃度呈負相關。由圖5可知，4種發(fā)酵產物中，酵母菌發(fā)酵產物的亞鐵離子還原能力最強（IC500.44 mg/mL），乳酸菌發(fā)酵產物的亞鐵離子還原能力最弱（IC500.49 mg/mL），且發(fā)酵產物比未發(fā)酵產物（IC500.50 mg/mL）對于亞鐵離子的還原能力更強。

圖5 樣品對亞鐵離子的還原能力對比

當FRAP值為0.5 mmol/L時，酵母菌發(fā)酵產物、乳酸菌發(fā)酵產物、枯草芽孢桿菌發(fā)酵產物、雙歧桿菌發(fā)酵產物、BHT、BHA、PG及未發(fā)酵提取物的濃度分別為0.258、0.366、0.487、0.599、0.669、0.064、0.059及0.844 mg/mL。當達到同一FRAP值時，物質的濃度與其抗氧化活性成反比，因此，酵母菌發(fā)酵產物還原亞鐵離子能力最強，雙歧桿菌發(fā)酵產物還原亞鐵離子能力最弱，且4種發(fā)酵產物均比未發(fā)酵提取物還原亞鐵離子能力強。

單一的抗氧化試驗不能完全地反映發(fā)酵產物的抗氧化能力，本文將DPPH自由基和ABTS+自由基的清除能力與亞鐵離子還原能力相結合來反映發(fā)酵產物的抗氧化能力。綜合以上數(shù)據(jù)，4種發(fā)酵產物的DPPH自由基和ABTS+自由基及亞鐵離子IC50值均比未發(fā)酵產物的IC50值更低，這表明金銀花枝葉發(fā)酵產物的抗氧化能力比未發(fā)酵產物有較大的提高，即發(fā)酵過程可以有效提高金銀花枝葉的抗氧化能力，這與徐文流等的研究結果一致［10-11，17-18］。

3 結論與討論

利用酵母菌、乳酸菌、雙歧桿菌及枯草芽孢桿菌分別發(fā)酵金銀花枝葉，并進行抑菌實驗，結果表明，4種發(fā)酵產物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及枯草芽孢桿菌均表現(xiàn)出一定的抑制作用，乳酸菌發(fā)酵產物對金黃色葡萄球菌及大腸桿菌抑制能力均為最強，酵母菌發(fā)酵產物對枯草芽孢桿菌的抑制能力最強。在4種發(fā)酵產物中，乳酸菌發(fā)酵產物清除DPPH自由基能力最強，酵母菌發(fā)酵產物清除ABTS+自由基能力及還原亞鐵離子能力最強，且發(fā)酵產物比未發(fā)酵提取物的抗氧化能力更強。

紅曲霉發(fā)酵金銀花后酚酸和黃酮化合物含量都有不同程度地提高，發(fā)酵后的紅曲金銀花ABTS+和DPPH自由基清除能力均高于未發(fā)酵金銀花［11］。植物乳桿菌和釀酒酵母混合發(fā)酵金銀花后黃酮的含量提升了10%，多酚的含量提升了24%，DPPH自由基清除率由55%提升到71%，ABTS+自由基清除率由59%提升到64%［10］。藥理學研究表明，酚類及黃酮類物質具有抗氧化和抑菌作用，在微生物發(fā)酵過程中代謝分泌的水解酶類能促進酚類物質的釋放，可以有效地提高金銀花的總酚和總黃酮含量。因此，金銀花枝葉發(fā)酵產物呈現(xiàn)出抑菌效果，且比未發(fā)酵提取液的抗氧化能力更強。根據(jù)研究結果，金銀花在采摘過程中產生的枝葉可以經過發(fā)酵來提高浸提液的品質，同時為提高金銀花枝葉的利用價值以及合理利用金銀花枝葉提供理論依據(jù)。