正交設(shè)計(jì)優(yōu)化茅蒼術(shù)組培苗生根及增殖的研究

王晨瑤 劉夢(mèng)蝶 崔鑫奇 李萌華 管志昊 信龍飛 劉紅云

（信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院農(nóng)學(xué)院，河南信陽(yáng) 464000）

蒼術(shù)為多年生草本植物，其干燥根莖是著名的傳統(tǒng)藥材。2015年出版的《中國(guó)藥典》中記載，茅蒼術(shù)味微甘、辛、苦，北蒼術(shù)味辛、苦。茅蒼術(shù)主要用于治療脘腹脹滿、水腫、腳氣痿蹙、風(fēng)濕痹痛、風(fēng)寒感冒、雀目夜盲等［1］。由于自身特性及人為因素，蒼術(shù)的分布區(qū)域和種群數(shù)量均有明顯的衰退［2］。在所有常用大宗中藥資源品種中，蒼術(shù)為11種瀕危稀缺藥材物種之一，被列為省二級(jí)珍稀保護(hù)植物［3］。近年來(lái)，隨著對(duì)蒼術(shù)的綜合開發(fā)，蒼術(shù)的用途擴(kuò)大，除藥用外還可用作各種飲料的添加劑和加工工藝品香包等用途［4］。

隨著蒼術(shù)野生品不斷遭到破壞，以提高蒼術(shù)根莖的質(zhì)量為標(biāo)準(zhǔn)，在原有的技術(shù)上培育出有價(jià)值的茅蒼術(shù)資源迫在眉睫。但人工繁殖的茅蒼術(shù)成本高且成活率較低，因此茅蒼術(shù)組織快繁體系的建立非常有必要。藥用植物的組織培養(yǎng)主要著重于以下4個(gè)方面：植株培養(yǎng)、成分比較、植物生理研究及工業(yè)化生產(chǎn)的探究［5］。根據(jù)馬輝［6］等在研究藥用植物白術(shù)中的方法，確定正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)可以大大簡(jiǎn)化試驗(yàn)結(jié)果，節(jié)約試驗(yàn)經(jīng)費(fèi)和時(shí)間，具有工作量小、信息量大、數(shù)據(jù)分析簡(jiǎn)單并可分析交互作用等優(yōu)點(diǎn)。2009年，邱璐等在菊花培育中也通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化了菊花的組織培養(yǎng)條件［7］。采用正交設(shè)計(jì)法可以用最少的處理組合數(shù)研究較多的試驗(yàn)因素，以達(dá)到精簡(jiǎn)試驗(yàn)次數(shù)結(jié)果。通過(guò)分析試驗(yàn)結(jié)果選擇最佳的培養(yǎng)條件，以揭示各因素對(duì)培養(yǎng)效果作用的相對(duì)大小［8］。筆者基于前人的研究培育出優(yōu)質(zhì)的茅蒼術(shù)種苗，可減少人工成本，得到高效優(yōu)質(zhì)并適合大面積種植的蒼術(shù)苗，為茅蒼術(shù)產(chǎn)業(yè)的優(yōu)質(zhì)化、標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)?；a(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料及原材料處理選用河南省信陽(yáng)市平橋區(qū)顧崗水庫(kù)一帶的茅蒼術(shù)成熟種子。參考劉海萍等［9］的方法，將茅蒼術(shù)種子置于1 000 mL燒杯中，流水下沖洗30 min，再于純凈水中靜置5 min。將漂浮于水面的干癟種子除去，經(jīng)過(guò)濾保留底層飽滿充實(shí)種子，用網(wǎng)布包好，在1%的次氯酸鈉溶液中浸泡15 min左右，清水洗凈后放入超凈工作臺(tái)內(nèi)。接種前用75%乙醇消毒30 s后用0.1%氯化汞消毒15 min，無(wú)菌水沖洗4～5次，每次不少于3 min。然后將種子接種于MS培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)過(guò)程中統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)率及污染率。

1.2 方法

1.2.1 生根培養(yǎng) 將2 cm左右的外植體接種在生根培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)條件同繼代增值培養(yǎng)，3～5 d開始長(zhǎng)根，8～10 d基本產(chǎn)生1～3 cm的根，45 d后生根率達(dá)100%，隨機(jī)選取14瓶進(jìn)行分析。

1.2.2 增殖培養(yǎng) 用初代培養(yǎng)的根莖作為外植體，每瓶接種1個(gè)外植體，外植體約2 cm，每組培養(yǎng)基接種28瓶。培養(yǎng)45 d后隨機(jī)取14瓶進(jìn)行分析。將原材料轉(zhuǎn)接于不同含量的生根或繼代培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)基用7 g/L的瓊脂固化，蔗糖為30 g/L，pH值5.8～6.0。培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度1 000～1 500 lx，置于（22±2）℃溫度下培養(yǎng)，光周期（16 L∶8 D）。

1.3 單因素試驗(yàn)在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別改變NAA、6-BA、糖、活性炭4個(gè)因素，并設(shè)計(jì)4個(gè)水平（表1），隨機(jī)組合成20個(gè)不同的處理，考察茅蒼術(shù)組培苗的生長(zhǎng)水平，以得出不同濃度的培養(yǎng)基組合對(duì)茅蒼術(shù)生長(zhǎng)的影響。

表1 茅蒼術(shù)快速繁殖因素及水平

1.4 正交優(yōu)化設(shè)計(jì)

1.4.1 正交優(yōu)化茅蒼術(shù)生根 依據(jù)劉英翠等［10］在提取沙棘葉總黃酮中的試驗(yàn)方法，根據(jù)上述單因素試驗(yàn)的結(jié)果，全面考察不同培養(yǎng)基的類型和3種不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)茅蒼術(shù)生根誘導(dǎo)的影響，以生根率確定最適宜的培養(yǎng)基配比，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)（表2）。

表2 茅蒼術(shù)生根誘導(dǎo)正交試驗(yàn)因素水平

將培養(yǎng)的壯苗轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基內(nèi)，誘導(dǎo)生根。參考左靜靜等［11］的結(jié)果處理，45 d后統(tǒng)計(jì)生根數(shù)、生根率及生長(zhǎng)情況，如圖1所示。

圖1 不同因素對(duì)茅蒼術(shù)生根的效果

生根誘導(dǎo)率（%）=生根的組培苗數(shù)/接種的總組培苗數(shù)×100

1.4.2 正交優(yōu)化茅蒼術(shù)增殖 選用常用的生長(zhǎng)素NAA和細(xì)胞分裂素6-BA作為培養(yǎng)基中的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，設(shè)計(jì)了L9（34）正交試驗(yàn)，考察NAA和6-BA 2種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、基本培養(yǎng)基成分對(duì)增殖誘導(dǎo)的影響［12］，如圖2所示。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表3。

圖2 不同因素對(duì)茅蒼術(shù)生根的效果

表3 茅蒼術(shù)增殖誘導(dǎo)正交試驗(yàn)因素水平

增殖誘導(dǎo)率（%）=增殖的不定芽數(shù)/接種的總組培苗數(shù)×100

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素結(jié)果分析將培育的壯苗轉(zhuǎn)接于以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，設(shè)計(jì)NAA濃度為0.1、0.2、0.5、0.3 mg/L的培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行生根誘導(dǎo)。45 d后，以根長(zhǎng)、根粗和根的生長(zhǎng)狀況為考察對(duì)象進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析［13］。結(jié)果顯示，NAA的濃度不同，根系生長(zhǎng)有一定的差異。由表4可知，NAA濃度為0.5 mg/L時(shí)，根較粗長(zhǎng)且分根數(shù)較多，根生長(zhǎng)的最好。當(dāng)NAA濃度為0.1 mg/L時(shí)，根細(xì)且短，生長(zhǎng)較差。故適宜茅蒼術(shù)生長(zhǎng)的NAA濃度培養(yǎng)基應(yīng)為MS+NAA 0.5 mg/L。

表4 不同濃度NAA對(duì)茅蒼術(shù)生根誘導(dǎo)的影響

與生根方法相同，將茅蒼術(shù)壯苗轉(zhuǎn)接于以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)基內(nèi)，設(shè)計(jì)6-BA濃度為1.0、1.5、2.0、0.5 mg/L的培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行增殖誘導(dǎo)。觀察45 d后取樣，以平均葉數(shù)、平均株高和分枝數(shù)作為考察目標(biāo)進(jìn)行分析。通過(guò)SPSS軟件進(jìn)行分析可知組間F=6.98，其P=0.013<0.05，表明組間株高差異顯著。如表5所示，6-BA濃度為1.5 mg/L時(shí)，植株健壯且分枝較多。因此，6-BA濃度為1.5 mg/L時(shí)，對(duì)茅蒼術(shù)增殖效果較好。

表5 不同濃度6-BA對(duì)茅蒼術(shù)增殖誘導(dǎo)的影響

在單因素分析的基礎(chǔ)上，確定在后續(xù)的正交設(shè)計(jì)中NAA的濃度為0.1、0.2、0.5 mg/L、3個(gè)水平進(jìn)行誘導(dǎo)茅蒼術(shù)生根的優(yōu)化，6-BA選擇1.0、1.5、2.0 mg/L 3個(gè)水平對(duì)茅蒼術(shù)進(jìn)行增殖優(yōu)化。

2.2 正交優(yōu)化茅蒼術(shù)生根的結(jié)果分析采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以培養(yǎng)基、NAA、糖、6-BA為考察因素，每個(gè)因素設(shè)計(jì)3個(gè)不同的水平，進(jìn)行不同的組合。基礎(chǔ)培養(yǎng)基分別為MS、1/2MS、1/4MS，6-BA 1.0、1.5、2.0 mg/L，NAA分別為0.1、0.2、0.5 mg/L，糖分別為15、30、45 g/L，取茅蒼術(shù)單芽接種到各培養(yǎng)基中，每瓶一芽，一組14瓶，45 d后統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。使用Excel、SPSS正交分析數(shù)據(jù)，篩選出最適宜茅蒼術(shù)叢生芽生根及增殖的培養(yǎng)基組合，分析不同培養(yǎng)基對(duì)茅蒼術(shù)叢生芽的影響。

將生長(zhǎng)健壯的叢生芽接種至9組不同的培養(yǎng)基組合內(nèi)，進(jìn)行生根培養(yǎng)。7 d后第4、5、6組開始萌動(dòng)生根，14 d后各組均長(zhǎng)出根。第4組中長(zhǎng)出的根粗且長(zhǎng)，第9組在接種10 d后才開始萌動(dòng)生根，且細(xì)、短［11］。由表6可知，由于各組水平不同，各組生根情況存在明顯的差異，第2組生根較多，且根粗、長(zhǎng)，生根率為32.1%。由此可知，茅蒼術(shù)的最適生根培養(yǎng)基為MS+0.2 mg/L NAA+30 g/L糖+1%活性炭。

表6 正交優(yōu)化對(duì)茅蒼術(shù)生根的影響

2.3 正交優(yōu)化茅蒼術(shù)增殖的結(jié)果分析接種后，對(duì)叢生芽的增殖情況進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示，在接種10 d后，第6組幼芽開始萌動(dòng)，12 d后，各組均開始萌動(dòng)。45 d后統(tǒng)計(jì)叢生芽增殖率。由表7可知，不同的外源激素配比對(duì)叢生芽誘導(dǎo)的效果不同，并存在明顯差異。第1、2、5、7、8組，叢生芽長(zhǎng)勢(shì)一般，在長(zhǎng)勢(shì)一般的5組試驗(yàn)中，第1組叢生芽的增殖率最小，第3、4、6、9組叢生芽長(zhǎng)勢(shì)良好。在長(zhǎng)勢(shì)良好的4組試驗(yàn)中，第4組叢生芽的增殖率最大。因此，最適宜茅蒼術(shù)增殖的培養(yǎng)基為1/2MS+0.1 mg/L NAA+30 g/L糖+1.0 mg/L 6-BA。

表7 正交優(yōu)化對(duì)茅蒼術(shù)增殖的影響

續(xù)表7 正交優(yōu)化對(duì)茅蒼術(shù)增殖的影響

3 討論

該試驗(yàn)中，單因素分析為茅蒼術(shù)正交優(yōu)化設(shè)計(jì)提供了一組數(shù)據(jù)，為茅蒼術(shù)的無(wú)性繁殖提供了一種方法，有助于短期內(nèi)提供大量的試管苗，通過(guò)人工栽培擴(kuò)大資源，確保茅蒼術(shù)資源的保護(hù)和可持續(xù)利用。該試驗(yàn)結(jié)果表明，在茅蒼術(shù)的組織培養(yǎng)中，應(yīng)用正交設(shè)計(jì)法可以通過(guò)減少試驗(yàn)次數(shù)，有效地篩選出最佳方案。

本試驗(yàn)表明，茅蒼術(shù)最適生根培養(yǎng)基為MS+0.1 mg/L NAA+30 g/L糖+1%活性炭，生根數(shù)最多且根較粗，生根率可達(dá)32.1%，試驗(yàn)結(jié)果與李文等［13］的研究結(jié)果不一致，原因可能是與前人試驗(yàn)中添加激素種類與濃度不同。不同的培養(yǎng)基組合均可誘導(dǎo)茅蒼術(shù)生根。在該試驗(yàn)中，生根誘導(dǎo)不局限于NAA的作用，也受6-BA、糖等的促進(jìn)，同時(shí)培養(yǎng)基內(nèi)添加的活性炭也對(duì)茅蒼術(shù)生根有一定的影響。

茅蒼術(shù)的最適增殖培養(yǎng)基為1/2MS+0.1 mg/L NAA+30 g/L糖+1.0 mg/L 6-BA，增殖率可達(dá)28.6%。過(guò)高或過(guò)低濃度的6-BA及NAA對(duì)茅蒼術(shù)叢生芽的增殖率均有一定的影響。這與李西騰等［1］的研究相比，在培養(yǎng)過(guò)程中添加激素的種類和濃度對(duì)叢生芽的增殖效果產(chǎn)生了不同的影響。

在茅蒼術(shù)的快速繁殖過(guò)程中，以根莖作為外植體進(jìn)行培養(yǎng)已經(jīng)建立比較完整的無(wú)性繁殖體系，然而近年來(lái)高品質(zhì)的茅蒼術(shù)品種不易培育［14］。因此，在今后的進(jìn)一步的研究中，要將茅蒼術(shù)生長(zhǎng)發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng)、新陳代謝規(guī)律、適宜的生態(tài)環(huán)境等結(jié)合起來(lái)，通過(guò)生物技術(shù)進(jìn)行茅蒼術(shù)優(yōu)良品質(zhì)的選育和提純復(fù)壯，保護(hù)種質(zhì)資源，實(shí)現(xiàn)茅蒼術(shù)優(yōu)良植株或種子的規(guī)模化生產(chǎn)［15］。