解磷菌Novosphingobium sp.WW01 的解磷活性及其發(fā)酵條件研究

顧會戰(zhàn) 史洪濤 何佶弦 母明新 尹振華 孫會忠 王小東

（1四川省煙草公司廣元市公司，四川廣元 628100；2河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南洛陽 471003）

磷元素是植物生長過程中的“肥料三要素”之一，但土壤中絕大部分的磷以難溶性磷酸鹽礦物態(tài)存在，植物并不能吸收利用［1-2］，故而農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中必須大量追施磷肥才能獲得增產(chǎn)、高產(chǎn)，但周而復(fù)始會導(dǎo)致耕作層土壤理化性質(zhì)失衡、出現(xiàn)板結(jié)等不良現(xiàn)象［3-4］。隨著可持續(xù)性、綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展理念重視和普及，改良和開發(fā)有機(jī)磷肥也成為普遍關(guān)注的課題，其中微生物菌肥技術(shù)發(fā)展尤為迅猛，取得了一定的成效［5-6］。微生物菌肥的核心是要具有優(yōu)良的配伍功能菌株，但微生物在長期的協(xié)同進(jìn)化過程中，往往形成一定的特異性［7］，這也正是菌肥配方不同效果存在差異的本質(zhì)原因，因此解磷菌遺傳資源便成為菌肥開發(fā)的核心問題之一［8-9］。但自然界中分離篩選出優(yōu)良的野生菌株并非易事。在此背景下，作者開展了煙草根際土壤中解磷菌的分離篩選工作，旨在為開發(fā)提高和改善煙草品質(zhì)的專用菌肥或制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料土樣：煙草根際土壤。采用夢金娜有機(jī)磷鑒別培養(yǎng)基進(jìn)行解磷菌分離培養(yǎng)和發(fā)酵特性測定；采用LB培養(yǎng)基進(jìn)行菌種活化和保種［5，9］。

1.2 方法

1.2.1 解磷菌的分離 稱10 g土樣加入三角瓶，再加入90 mL無菌水，200 r/min振蕩20 min，上清液濃度視為10-1，再10倍梯度稀釋制得10-4、10-5和10-6梯度稀釋液，分別取0.1 mL涂布鑒別培養(yǎng)基平板，32 ℃培養(yǎng)4 d。挑取溶磷圈最大菌落進(jìn)行劃線純化，獲得解磷菌活性菌株，保種備用。

1.2.2 目標(biāo)菌株解磷能力的確定 采用鉬藍(lán)比色法測定發(fā)酵上清液有效磷含量［6］。分離菌株LB培養(yǎng)基活化后，取發(fā)酵液按2%接種量接種于解磷菌液體培養(yǎng)基，以接種無菌水作對照，32 ℃、180 r/min連續(xù)培養(yǎng)7 d。設(shè)3次重復(fù)，取平均值，下同。

1.2.3 菌株的鑒定 采用普通光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡對菌株的一般和超微形態(tài)特征進(jìn)行觀察［10］。生理生化指標(biāo)的測定方法與步驟按參考文獻(xiàn)［11-12］進(jìn)行。目標(biāo)菌株的分子鑒定采用通用引物（27F：5′-AGAGTTT?GATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-TAGGGTTACCTTGT?TACGACTT-3′），操作方法按照文獻(xiàn)［13］進(jìn)行，測序公司是北京奧科鼎盛生物科技有限公司［13］。目標(biāo)菌株系統(tǒng)歸屬判斷參考文獻(xiàn)［14］進(jìn)行。

1.3 菌株的發(fā)酵條件測定碳源同化試驗(yàn)：在剔除碳源的鑒別液體培養(yǎng)基中分別加入直鏈淀粉、支鏈淀粉、乳糖、海藻糖、蔗糖和葡萄糖作為碳源；氮源同化試驗(yàn)：在剔除氮源的鑒別液體培養(yǎng)基中分別加入尿素、酰胺、氯化銨、硝酸鈉、硝酸鉀和硫酸銨考察氮源同化情況；溫度影響試驗(yàn)：將活化菌株接種鑒別液體培養(yǎng)基中，考察4、20、30、40、50 ℃對菌株生長的影響；pH影響試驗(yàn)：將活化菌株接種鑒別液體培養(yǎng)基中，考察3、5、7、9酸堿度對菌株生長的影響。所有測定均在32 ℃條件下恒溫培養(yǎng)48 h，用分光光度計(jì)測定菌體OD600值。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離結(jié)果通過平板分離培養(yǎng)，獲得1株溶磷圈明顯菌株，將初步定性為具解磷活性菌株，編號為WW01（圖1）。

圖1 解磷菌形成的透明圈

2.2 解磷菌WW01的解磷能力圖2表明，與對照相比，WW01菌株在整個發(fā)酵培養(yǎng)期上清液中的磷含量呈現(xiàn)出前期由低到高，后期保持穩(wěn)定的特征，說明菌株通過代謝把有機(jī)磷中的磷轉(zhuǎn)換成了游離態(tài)速效磷，培養(yǎng)液中游離態(tài)磷含量發(fā)酵48 h達(dá)到最大值1.35 mg/L，故菌株WW01可以確定為具有解磷活性功能菌。

圖2 解磷菌株的解磷活性

2.3 菌株WW01的多相分類特征

2.3.1 形態(tài)特征 菌株WW01在LB培養(yǎng)基上生長48 h后，菌落呈土色，圓形，略隆起，邊緣整齊，表面濕潤，不透明（圖3-A）。菌株呈桿型，菌體長1.3～2.0 μm、寬0.6～0.9 μm；單生，無鞭毛，不能運(yùn)動；掃描電鏡下的超微結(jié)構(gòu)觀察可見菌體兩端漸尖，具小顆粒狀凸起（圖3-B，C）。

圖3 菌株WW01的個體形態(tài)

2.3.2 生化特征 菌株WW01的生化測定結(jié)果顯示，呈陽性結(jié)果的有硫化氫試驗(yàn)、葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)、堿性磷酸酯酶試驗(yàn)、吐溫-80反應(yīng)試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)；呈陰性結(jié)果的有革蘭氏染色試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、脲酶試驗(yàn)、苯丙氨酸脫羧酶試驗(yàn)、色氨酸脫氨酶、精氨酸雙水解酶試驗(yàn)。測定結(jié)果與文獻(xiàn)［14］中對鞘鞍醇桿菌的描述基本一致。

2.3.3 菌株WW01的16S rDNA測序分析 對WW01菌株的16S rDNA克隆測序獲得1 445 bp序列。序列在Gen?Bank數(shù)據(jù)庫同源比對，并下載同源性較高序列構(gòu)建WW01菌株的N-J系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），結(jié)果菌株與No?vosphingobium subterraneum（NR040827.1）和N.subterrane?um（NR040827.1）等聚在同一分支上，但相似性僅84%。綜合菌株形態(tài)、生化指標(biāo)測定和16S rDNA聚類分析結(jié)果，將WW01鑒定為鞘鞍醇桿菌屬菌株，暫命名為Novosphin?gobiumsp.WW01。

圖4 菌株WW01的N-J系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 解磷菌WW01的發(fā)酵特性WW01對菌株不同碳源的同化利用能力不同，在6種碳源中，葡萄糖利用能力最強(qiáng)，其次是直鏈淀粉和蔗糖，但方差分析（P<0.05，下同）三者之間的差異未達(dá)顯著水平；同化利用較差的是海藻糖和支鏈淀粉，二者差異達(dá)顯著水平，但與其他幾類碳源差異顯著。WW01對6種碳源的同化能力由強(qiáng)到弱的順序是葡萄糖>直鏈淀粉>蔗糖>乳酸>支鏈淀粉>海藻糖（圖5）。

圖5 菌株WW01對不同碳源的同化能力

WW01菌株對6種氮源同化利用情況：對硝酸鈉同化利用能力最強(qiáng)，與其他氮源差異顯著；對尿素、酰胺、氯化銨和硝酸鉀的利用水平基本相當(dāng)，三者之間差異不顯著；對硫酸銨的同化能力最弱，與其他氮源之間差異顯著。WW01對6種氮源的同化能力由強(qiáng)到弱的順序是硝酸鈉>尿素>酰胺>氯化銨>硝酸鉀>硫酸銨（圖6）。

圖6 菌株WW01對不同氮源的同化能力

20 ℃以下和40 ℃以上時，OD值下降明顯；30 ℃時OD值最大。整體而言，30～40 ℃間有利于菌株WW01的生長（圖7）。

圖7 溫度對菌株YYF-3生長的影響

由圖8可知，pH低于5和大于9時，OD值均處于低值，pH為7時OD值最大，pH在6～8OD值較高，說明該范圍是菌株生長適宜酸堿度。整體而言，菌株WW01喜好中性偏酸環(huán)境。

圖8 pH對菌株YYF-3生長的影響

3 結(jié)論

解磷菌分布非常廣泛，要獲得豐富的解磷菌土著微生物資源，選擇不同生境進(jìn)行分離篩選成為必然選擇，該研究進(jìn)一步證實(shí)這一點(diǎn)。從煙草根際土壤分離出的菌株WW01通過平板鑒別培養(yǎng)和化學(xué)測定，確定具有解磷活性，經(jīng)48 h發(fā)酵培養(yǎng)，上清液中有效磷含量達(dá)到了1.33 mg/L，說明菌株WW01菌株通過代謝活動將有機(jī)磷存在狀態(tài)的無效磷分解轉(zhuǎn)化成了游離態(tài)有效磷，可以給植物生長提供磷素，為下游開發(fā)提供了理論參考。該研究將YYF-3鑒定為鞘鞍醇桿菌屬菌株，而該屬菌株普遍具有較強(qiáng)的代謝能力，開發(fā)應(yīng)用潛力較大。