當(dāng)歸大球蓋菇雙向液體發(fā)酵液抗氧化性能測定

杜展顏 錢麗娟 高 捷 孫玉軍

（安徽科技學(xué)院生命與健康科學(xué)學(xué)院，安徽鳳陽 233100）

大球蓋菇（Stropharia rugosoannulata），又名酒紅色球蓋菇、赤松茸，是聯(lián)合國糧農(nóng)組織向發(fā)展中國家推薦的主栽食用菌品種之一［1］，具有預(yù)防冠心病、助消化、疏解人體精神疲勞之功效,大球蓋菇中蛋白質(zhì)含量很高，為其干重的13%～46%，涵蓋8種必需氨基酸等18種氨基酸，具有低糖低脂肪、多種氨基酸并存的特點［2］。大球蓋菇含有多糖、留醇、黃酮、酚類物質(zhì)、凝集素等生物活性成分，具有抗氧化、抑菌、抑制腫瘤、降血糖等藥理作用［3］。

當(dāng)歸［Angelica sinensis（Oliv.）Diels］幼苗忌日曬；成株耐強光，忌連作。從古至今當(dāng)歸一直貢獻于婦科，具有良好的美容功效。據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》記載，“婦人漏下絕子，諸惡瘡瘍金瘡。煮飲之?！薄侗静菥V目》記載，“治頭痛，心腹諸痛，潤腸胃筋骨、皮膚、治癰疽、排膿止痛、和血補血?！敝兴幉漠?dāng)歸中的多糖是其高活性成分，有抗氧化、抗衰、抗炎功效，亦有預(yù)防心肌梗塞和動脈硬化的功效［4］，據(jù)此以當(dāng)歸作為護膚品的功效成分［5］。當(dāng)歸主要成分中的有機酸阿魏酸，對酪氨酸酶具有抑制作用，有美白功能，但關(guān)于當(dāng)歸在護膚品中的氧化性研究鮮有報道。

雙向發(fā)酵能夠聚集中藥與菌菇的活性成分，大幅提高其研究性能，如抗氧化性。藥用真菌以添加了中草藥的藥性基質(zhì)為培養(yǎng)基，吸收中草藥中的活性成分，經(jīng)過藥用真菌豐富的酶系以及代謝的作用，會產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物［6］，原有的性能有所提升，發(fā)揮新的功效，提高利用率。發(fā)酵過程中的微生物可分泌多種酶，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、木聚糖酶、糖化酶、果膠酶、纖維素酶等。雙向發(fā)酵是當(dāng)代研究員關(guān)注的焦點，也是生物學(xué)邁上新臺階的必由之路［7］。

當(dāng)今人們對于化妝品層次與功效的追求激增，更天然和效果更好的化妝品深受消費者的青睞。中藥和菌落雙向發(fā)酵組合中卻鮮有當(dāng)歸與大球蓋菇組合的研究。本研究擬從大球蓋菇菌株出發(fā)，采用當(dāng)歸與大球蓋菇雙向發(fā)酵獲得發(fā)酵液，并對發(fā)酵液的多糖、蛋白、多酚等活性成分進行測定，同時探討其抗氧化與抗紫外吸收能力，為當(dāng)歸資源的開發(fā)及當(dāng)歸與大球蓋菇雙向發(fā)酵液在護膚方面的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種、試劑與儀器

1.1.1 試驗菌種 大球蓋菇，由安徽科技學(xué)院食用菌研究所提供。

1.1.2 試劑 鉬酸銨，德國Merk公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 試驗儀器 冷凍干燥機（FD-1A-50，北京），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀器（R-1001VN，鄭州），離心機（L550，湖南），紫外可見分光光度計（U-T6PC，上海），高速分散器（XHFDY，寧波）。

1.2 試驗方法

1.2.1 大球蓋菇菌種的活化與種子液的制備 馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂按照50∶2∶5制備PDA固體培養(yǎng)基后將大球蓋菇菌株接入，將接好的菌種放入培養(yǎng)箱28 ℃培養(yǎng)5 d。制備大球蓋菇菌種種子液［8-9］：配制PDA液體培養(yǎng)基100 mL于250 mL容量瓶中。經(jīng)滅菌鍋滅菌，在超凈工作臺中將固體培養(yǎng)的大球蓋菇接入液體培養(yǎng)基，并放在搖床上（180 min，28 ℃）培養(yǎng)5 d。

1.2.2 當(dāng)歸的處理 稱取5 g當(dāng)歸，放入錐形瓶中，加水煮30 min至50 mL左右離心（5 000 r/min，15 min），離心后取上清液并用量筒計量，后放入滅菌鍋中滅菌。

1.2.3 當(dāng)歸大球蓋菇雙發(fā)酵培養(yǎng) 準(zhǔn)備PDA液體培養(yǎng)基，待高速分散器將制備的種子液破碎至均勻液體后將10 mL種子液與100 mL PDA液體培養(yǎng)基一同加入處理好的當(dāng)歸煎熬液中，放入搖床（180 min，28 ℃）培養(yǎng)5 d。

1.2.4 當(dāng)歸大球蓋菇發(fā)酵液多糖含量的測定 使用硫酸-蒽酮法測定總多糖，分別當(dāng)日配制2 mg/mL的蒽酮-硫酸試劑（稱取200 mg蒽酮溶于100 mL濃硫酸中）和0.1 mg/mL葡萄糖溶液。制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：取6個試管，分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.02、0.04、0.06、0.08、1.00 mL，為控制僅單因素變量，各個試管中需加蒸餾水1.00、0.08、0.06、0.04、0.02、0，6個試管分別測定A620，重復(fù)3次。記錄數(shù)據(jù)，橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)分別為葡萄糖濃度與吸光度。取4.00 mL蒽酮-硫酸試劑至1.00 mL發(fā)酵液上清液10倍稀釋液中搖勻，煮沸10 min，涼水冷卻10 min，測定A620，重復(fù)3次。

1.2.5 當(dāng)歸大球蓋菇發(fā)酵液蛋白含量的測定 考馬斯亮藍G-250與含蛋白的物質(zhì)反應(yīng)快且穩(wěn)定，能快速達到平衡。故用考馬斯亮藍G-250試劑與不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（1 mg/mL）反應(yīng)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。取當(dāng)歸大球蓋菇雙向發(fā)酵液1 mL，加入考馬斯亮藍G-250試劑5 mL，測定蛋白含量。

1.2.6 當(dāng)歸大球蓋菇發(fā)酵液多酚含量的測定 福林酚具有強氧化性，在堿性條件下，酚類物質(zhì)可與鎢鉬酸發(fā)生反應(yīng)，生成藍色化合物，故采用福林酚比色法測量發(fā)酵液中多酚含量。發(fā)酵液中加入適量乙醇，75 ℃水浴，回流提取50 min，再用乙醇定容，分別吸取1.00 mL稀釋20倍的多酚提取液和阿魏酸對照品溶液于試管中，并利用紫外可見分光光度計測定A745與標(biāo)準(zhǔn)曲線對照，可得發(fā)酵液中的多酚含量。

1.2.7 當(dāng)歸大球蓋菇發(fā)酵液抗紫外線測定 通過測量樣品在230、260、290、320和350 nm處的紫外UV-A區(qū)透過率，計算出紫外吸收率，以50%乙醇作為空白對照［8］，通過測定發(fā)酵液的透過率，評價發(fā)酵液的抗紫外性能。

1.2.8 當(dāng)歸大球蓋菇發(fā)酵液抗氧化性能的測定 總抗氧化能力（Total antioxidant capacity，TAC）測定［9］，將發(fā)酵液5 000 r離心10 min獲得上清液，稱取10.65 g磷酸鈉和4.95 g四水鉬酸銨，量取33.35 mL濃硫酸，使三者全部溶于蒸餾水中，制得總體積為1 000 mL鉬酸銨反應(yīng)體系。取稀釋10倍后的當(dāng)歸大球蓋菇發(fā)酵液1.5 mL與3 mL的鉬酸銨溶液，充分混合，于95 ℃水浴鍋中水浴加熱90 min。以0.025 mg/mL VC作為對照，水浴反應(yīng)生成藍色結(jié)合物。加熱完畢后需放冷至室溫，測定其A695處光吸收值。

DPPH自由基清除率的測定［10］。取3 mL 0.04 mg/mL乙醇DPPH溶液與3 mL當(dāng)歸大球蓋菇菌發(fā)酵液混勻，避光30 min后測定A517值，3組平行試驗，取其平均值。以VC作為陽性對照，根據(jù)以下公式計算當(dāng)歸大球蓋菇菌發(fā)酵液的DPPH自由基清除率，以此評價當(dāng)歸大球蓋菇菌發(fā)酵液抗氧化性能大小的另一指標(biāo)。

其中，A1為樣品組，A2為對照組，A3為空白對照組，反應(yīng)無水乙醇與當(dāng)歸大球蓋菇發(fā)酵液各3 mL得的吸光值A(chǔ)2，反應(yīng)無水乙醇與DPPH各3 mL得吸光值A(chǔ)3。

2 結(jié)果與分析

2.1 當(dāng)歸大球蓋菇發(fā)酵液多糖含量的測定測定A620處吸光值，得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。其回歸方程：

在測定范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，故可測定發(fā)酵液葡萄糖含量。

當(dāng)歸大球蓋菇發(fā)酵液冷卻后，經(jīng)硫酸-蒽酮法測定A620處吸光度值，3次平行試驗結(jié)果分別為0.741、0.735和0.738，取其平均值0.738，代入回歸方程，得多糖含量為0.086 8 mg/mL。多糖是測定抗氧化性的重要指標(biāo)，護膚品中的多糖具有抗衰老、修復(fù)皮膚組織、美白保濕等功效。此發(fā)酵液的多糖含量較高，在護膚品的中可發(fā)揮著一定作用。

2.2 發(fā)酵液蛋白含量的測定測量A595處吸光值，得蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。其回歸方程：

在測定范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，故可測定發(fā)酵液蛋白含量。

發(fā)酵液蛋白含量=查表所得蛋白含量×稀釋倍數(shù)=0.474 6 mg/mL。

測定結(jié)果表明，發(fā)酵液中蛋白含量較高。膠原蛋白能清除皮膚氧化過程中的有害物質(zhì)，去除黑色素的沉淀，淡化皮膚斑點。植物和微生物中不含有膠原蛋白，故發(fā)酵液中的蛋白是否具有美白功能，有待進一步的考證。但發(fā)酵液蛋白質(zhì)中的氨基酸具有親水基團，易吸附水分子，能夠起到保水的作用，具有護膚功能。

2.3 發(fā)酵液多酚含量的測定測量A745處吸光值，得阿魏酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。其回歸方程：

在測定范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，故可測定發(fā)酵液多酚濃度。將試驗測定的A745值代入曲線方程得x=0.074 mg/mL。發(fā)酵液總多酚含量=0.074 mg/mL×稀釋倍數(shù)（20）=1.48 mg/mL。

多酚一直被稱為一種天然的抗氧化劑，張鳳杰等［11］的報道發(fā)酵植物作物中，阿魏酸濃度在發(fā)酵后的植物中最高［（420.6±1.8）μg/g］，較阿魏酸濃度在未發(fā)酵的植物提高了1421.2%［（26.3±0.3）μg/g］。中藥當(dāng)歸中所含酚大多在細胞壁中以非游離態(tài)的形式存在［12］，在大球蓋菇菌株的發(fā)酵作用下，能產(chǎn)生一些分解細胞壁的酶，從而導(dǎo)致當(dāng)歸細胞壁疏松，使多酚易于釋放。發(fā)酵液中多酚中的酚羥基具有還原性，因此具有抗氧化功能，可以清除皮膚因太陽紫外線照射產(chǎn)生的自由基，減少色斑的生成，起到護膚的作用。

2.4 當(dāng)歸大球蓋菇發(fā)酵液的紫外吸收測定由表1可知，當(dāng)歸大球蓋菇發(fā)酵液在260 nm的波長附近有強吸收，這可能是由酪氨酸的苯環(huán)共軛雙鍵或核酸吸收所致。在290～320 nm波長附近的光吸收，可能為發(fā)酵液中揮發(fā)油所致。故當(dāng)歸大球蓋菇發(fā)酵液良好的紫外吸收能力，可以防止太陽光中紫外線的傷害，具有護膚功能。

表1 當(dāng)歸大球蓋菇發(fā)酵液不同波長處的透光率

2.5 當(dāng)歸大球蓋菇發(fā)酵液的抗氧化測定采用鉬酸銨試劑測定得到當(dāng)歸大球蓋菇發(fā)酵液總抗氧化能力A695的數(shù)值 為0.926，是0.025 mg/mL VC 的1.777 倍。發(fā) 酵 液 對DPPH自由基的清除率為74.66%，雖比陽性對照組VC的清除率要低，但發(fā)酵原液清除率達到74.66%，表明當(dāng)歸大球蓋菇雙向發(fā)酵液也具有較好的抗氧化能力。這可能是由于發(fā)酵液中阿魏酸、揮發(fā)油等物質(zhì)提供了游離的氫，消除了自由基反應(yīng)。當(dāng)歸大球蓋發(fā)酵液的較高的抗氧化活性，可應(yīng)用于護膚領(lǐng)域，具有護膚功能。

3 結(jié)論與討論

該研究用植物和真菌通過雙向發(fā)酵能夠提高總抗氧化能力，植物細胞在真菌菌絲的穿透作用和水解酶、氧化酶等的酶解作用下，其中的抗氧化活性物質(zhì)可以更好地釋放出來［13-14］。當(dāng)歸大球蓋菇的雙向發(fā)酵過程中，發(fā)酵56 h時，其總抗氧化能力達到最大，此時可能是發(fā)酵產(chǎn)生了較多的多酚，如阿魏酸等。因此，該試驗選擇發(fā)酵56 h時的發(fā)酵液，作為研究對象，測定其多糖、蛋白、多酚含量，同時也測定其抗氧化活性和抗紫外線性能，為其在護膚品領(lǐng)域中的應(yīng)用提供參考。

發(fā)酵液護膚品［15］與其他美容產(chǎn)品相比，前者是純天然產(chǎn)品，無任何化學(xué)類添加劑，安全可靠，符合現(xiàn)代人們的消費理念和愛美人士的追捧，具有廣闊的市場。

當(dāng)歸大球蓋菇的雙向發(fā)酵56 h獲得的發(fā)酵液有很多活性物質(zhì)，其多糖含量達0.868 mg/mL，蛋白質(zhì)含量達0.475 mg/mL，多酚含量高達1.480 mg/mL；DPPH自由基清除率為74.66%，其總抗氧化能力（TAC）為0.025 mg/mL Vc的1.777倍。因此，當(dāng)歸與大球蓋菇菌種雙向發(fā)酵的發(fā)酵液具有良好的抗氧化性能，在護膚品行業(yè)具有一定的應(yīng)用開發(fā)前景。