苦蕎蛋白源肽AFYRW對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響

肖 怡，左 婕，鄧 艷，張禮林，王筑婷，莫曉川，許慶忠，李紅梅*

（貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，貴州 貴陽 550025）

心腦血管疾病是全球性疾病死亡的主要原因之一，其發(fā)病率在中國呈逐年上升趨勢(shì)[1]。動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是導(dǎo)致心腦血管疾病的主要原因。血管炎癥在AS的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。血管內(nèi)皮的炎癥反應(yīng)可上調(diào)多種細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，包括血管細(xì)胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）、細(xì)胞內(nèi)黏附分子-1（intracellular adhesion molecule-1，ICAM-1）和E-選擇素，同時(shí)會(huì)導(dǎo)致多種促炎細(xì)胞因子的大量釋放，如白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6、IL-8和單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）。黏附分子和促炎細(xì)胞因子的增多會(huì)促進(jìn)白細(xì)胞黏附，增加血管通透性[2]。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）作為革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外壁的組成成分，能夠誘導(dǎo)全身性炎癥和敗血癥，被廣泛用于誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）損傷，是誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的經(jīng)典模型[3]。LPS誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞炎性損傷的相關(guān)機(jī)制較多，其中通過激活核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）下游信號(hào)通路，放大炎癥反應(yīng)，被認(rèn)為是最經(jīng)典的機(jī)制之一[4]。因此，研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞炎性損傷的作用機(jī)制，改善內(nèi)皮細(xì)胞的功能，是防止心血管疾病發(fā)展的有效措施。

目前，從各種食源性動(dòng)植物中尋找具有抑菌、抗氧化等多種重要生理功能的活性肽已成為研究的一個(gè)熱點(diǎn)。生物活性肽一般是由2～20 個(gè)氨基酸構(gòu)成的短肽，分子質(zhì)量大多在3 kDa以下，對(duì)生物機(jī)體的生命代謝活動(dòng)有益或具有一定生物活性。生物活性肽常常隱藏于蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)序列中的一些特定區(qū)域內(nèi)，必須釋放它們才能發(fā)揮作用[5]。已報(bào)道的生物活性肽具有多種生理功能，包括抗氧化、抗高血壓、抗病毒、抗腫瘤和抗菌等[6]。

苦蕎學(xué)名韃靼蕎麥，別名萬年蕎、野蘭蕎、蕎葉七，隸屬于蓼科（Polygonaceae）蕎麥屬（Fagopyrum），與何首烏、大黃等同屬蓼科，是我國藥食同源文化的典型體現(xiàn)。據(jù)《本草綱目》記載，苦蕎麥有益氣力、利耳目、降氣、寬腸、健胃等功效，能治療痢疾，咳嗽、水腫、喘息、燒傷等疾病。苦蕎營養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、維生素、膳食纖維、黃酮類化合物和多種微量礦物質(zhì)元素等營養(yǎng)物質(zhì)[7]。貴州威寧地區(qū)廣泛種植苦蕎，課題組前期采用堿性蛋白酶酶解苦蕎清蛋白，經(jīng)多種色譜分離及質(zhì)譜鑒定，得到一種新的具有抗氧化作用的活性五肽AFYRW（Ala-Phe-Tyr-Arg-Trp），分子質(zhì)量為741.85 Da，其對(duì)羥自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH）自由基的半數(shù)清除濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）分別為0.65 mmol/L和0.64 mmol/L。此外，AFYRW還具有較強(qiáng)的還原力和抑制脂質(zhì)過氧化的作用[8]。本研究以HUVECs為研究對(duì)象，建立LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，觀察AFYRW對(duì)LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎性損傷的保護(hù)作用，為苦蕎的深加工及苦蕎活性肽的開發(fā)提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肽AFYRW（純度≥98%）由上海淘普生物科技有限公司合成。HUVECs、內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基（endothelial cell medium，ECM） 美國Sciencell研究實(shí)驗(yàn)室；BCA蛋白定量試劑盒、LPS、蛋白磷酸酶抑制劑、牛血清白蛋白、2’,7’-二-(2-羧乙基)-5(6)-羧基熒光素乙酰甲酯（2’,7’-bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester，BCECF-AM） 北京索萊寶科技有限公司；細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒 大連美侖生物技術(shù)有限公司；p65、p-p65 抗體 美國Cell Signaling Technology公司；內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitricoxide synthase，iNOS）、ICAM-1、VCAM-1、IL-6、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）抗體 武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；NO試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

iMark多功能酶標(biāo)儀 伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；TS100熒光倒置顯微鏡 日本Nikon公司；BB150二氧化碳培養(yǎng)箱 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；H1650R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國Hermle公司；TGL-16B臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；SLIK-O3000-S數(shù)顯圓周搖床 美國賽洛捷克公司：DYY-6C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、Western blot制膠器及電轉(zhuǎn)移裝置 北京六一儀器廠；Tanon-4600SF凝膠成像系統(tǒng)上海天能公司。

1.3 方法

1.3.1 AFYRW的高效液相色譜和質(zhì)譜鑒定

AFYRW經(jīng)上海淘普生物科技有限公司合成，并采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）和電噴霧離子化質(zhì)譜（electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS）進(jìn)行純度和成分分析。檢測(cè)條件為：色譜柱為kromasil C18-5（4.6 mm×150 mm），流動(dòng)相A：乙腈（含0.1%的三氟乙酸），流動(dòng)相B：水（含0.1%的三氟乙酸），采用梯度洗脫，上樣質(zhì)量濃度為1 mg/mL，上樣體積為20 μL，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長214 nm。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞復(fù)蘇：HUVECs用ECM培養(yǎng)基培養(yǎng)（含5%胎牛血清、1%內(nèi)皮生長因子、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素）。將液氮罐中的凍存細(xì)胞取出，快速將其放入37 ℃水中反復(fù)搖晃約1 min，再將細(xì)胞從凍存管吸出轉(zhuǎn)移到裝有預(yù)熱培養(yǎng)基的新的培養(yǎng)瓶中，不用離心，搖晃均勻于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日換液及傳代培養(yǎng)。

細(xì)胞傳代：當(dāng)細(xì)胞生長密度達(dá)80%～90%時(shí)，吸棄培養(yǎng)基，加入緩沖液清洗2 次，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化1 min。倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞成塊脫落時(shí)，立即加入培養(yǎng)基終止消化。輕輕吹打培養(yǎng)瓶收集細(xì)胞，細(xì)胞懸液1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入1 mL培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，根據(jù)需求加入不同的培養(yǎng)瓶。

細(xì)胞計(jì)數(shù)：細(xì)胞重懸后吸取10 μL從蓋玻片邊緣加入，使細(xì)胞懸液全部充滿計(jì)數(shù)室。首先計(jì)算周邊4 個(gè)中方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)，再取平均數(shù)，根據(jù)實(shí)際需要對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行二次稀釋。

細(xì)胞分組和藥物干預(yù)：細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)即可分組，分為4 組：1）對(duì)照組；2）模型組：質(zhì)量濃度0.125 μg/mL LPS；3）低劑量組（AFY5組）：質(zhì)量濃度0.125 μg/mL LPS＋質(zhì)量濃度5 μg/mL AFYRW；4）高劑量組（AFY50組）：質(zhì)量濃度0.125 μg/mL LPS＋質(zhì)量濃度50 μg/mL AFYRW。AFYRW干預(yù)保護(hù)24 h后，再用LPS作用1.5 h建立炎癥模型。

1.3.3 CCK8檢測(cè)細(xì)胞生存活力

以每孔4×103個(gè)的數(shù)量接種于96 孔板中，混勻后每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，每組設(shè)置4 個(gè)平行復(fù)孔。等待細(xì)胞貼壁生長至融合狀態(tài)，分組給藥干預(yù)24 h后加入LPS作用1.5 h。造模結(jié)束后每孔加入10%的CCK8溶液，加液過程勿產(chǎn)生氣泡，混勻后放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)0.5 h，450 nm波長處測(cè)定各孔吸光度?？瞻卓字缓珻CK8溶液，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。細(xì)胞存活率按式（1）計(jì)算。

1.3.4 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)

冰上裂解提取細(xì)胞總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。根據(jù)蛋白分子質(zhì)量制備合適濃度的膠。10 μg總蛋白上樣、電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)電泳至膠邊緣時(shí)終止。制作轉(zhuǎn)膜體系，轉(zhuǎn)膜時(shí)間2 h。用5%牛血清封閉2 h。按一定比例稀釋抗體，一抗過夜孵育，TBST洗膜3 次，每次10 min。二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜3 次，每次10 min。化學(xué)發(fā)光試劑顯色后凝膠成像系統(tǒng)拍照。收集圖像后用Image J軟件分析各條帶灰度值。

1.3.5 NO含量的檢測(cè)

調(diào)整HUVEC細(xì)胞密度為4×105個(gè)/mL，接種于6 孔培養(yǎng)板，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，分別加入終質(zhì)量濃度為5、50 μg/mL的AFYRW孵育24 h后，加入終質(zhì)量濃度為0.125 μg/mL的LPS繼續(xù)孵育1.5 h，棄去LPS刺激的培養(yǎng)液后，用緩沖液清洗2 次，胰酶消化后收集細(xì)胞1 000 r/min離心5 min，超聲破碎制備細(xì)胞懸液，BCA定量蛋白濃度，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定，空白孔為雙蒸水和顯色液，標(biāo)準(zhǔn)品為20 μmol/L亞硝酸鈉，取上清液于酶標(biāo)儀550 nm波長處測(cè)定各孔OD值，根據(jù)公式（2）計(jì)算NO含量。

式中：A標(biāo)準(zhǔn)為標(biāo)準(zhǔn)孔吸光度；c標(biāo)準(zhǔn)為標(biāo)準(zhǔn)品濃度；ρpr為細(xì)胞勻漿蛋白質(zhì)量濃度/（g/L）。

1.3.6 單核細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞接種于24 孔板中等待貼壁，分為4 組：1）對(duì)照組；2）模型組：3）低劑量組（AFY10組）：質(zhì)量濃度0.125 μg/mL LPS＋質(zhì)量濃度10 μg/mL AFYRW；4）高劑量組（AFY50組）：質(zhì)量濃度0.125 μg/mL LPS＋質(zhì)量濃度50 μg/mL AFYRW。干預(yù)結(jié)束后將THP-1細(xì)胞1 000 r/min離心3 min，1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，使用BCECF-AM（5 μmol/L）標(biāo)記重懸的THP-1細(xì)胞，混勻后培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，培養(yǎng)結(jié)束后用0.01 mol/L pH 7.2～7.4磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），清洗3 遍，洗掉多余的BCECF-AM。加入到HUVECs中共同培養(yǎng)1 h，注意避光，PBS沖洗未黏附的細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡下拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用方差齊性檢驗(yàn)和單因素方差分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFYRW的HPLC和質(zhì)譜鑒定結(jié)果

經(jīng)HPLC測(cè)定，AFRYW的純度為95%（圖1A）。經(jīng)ESI-MS測(cè)定其分子質(zhì)量為741.85 Da（圖1B）。

圖1 合成AFYRW的HPLC（A）和質(zhì)譜（B）圖Fig.1 High performance liquid chromatogram (A) and mass spectrum (B) of synthetic AFYRW

2.2 AFYRW對(duì)LPS誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞活力的影響

如圖2所示，與對(duì)照組相比，質(zhì)量濃度0.125 μg/mL LPS 作用內(nèi)皮細(xì)胞1.5 h 后，細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.05）；與模型組相較，不同質(zhì)量濃度的AFYRW預(yù)處理24 h，再加入LPS刺激1.5 h，細(xì)胞活力均顯著提高（P＜0.05），AFY50組尤為顯著。以上結(jié)果說明AFYRW能降低LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。

圖2 AFYRW對(duì)LPS誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞活力的變化影響Fig.2 Effect of AFYRW on cell viability of HUVECs induced by LPS

2.3 AFYRW對(duì)LPS誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞中NO含量的影響

由于NO在內(nèi)皮功能障礙中起著重要作用，因此檢測(cè)了AFYRW對(duì)LPS誘導(dǎo)的HUVECs中NO水平的影響，結(jié)果如圖3所示。與對(duì)照組相比，LPS刺激后，NO含量顯著增多（P＜0.05）；與模型組相比，低質(zhì)量濃度AFYRW預(yù)處理24 h后NO含量明顯降低，高質(zhì)量濃度AFYRW可顯著抑制NO的生成（P＜0.05）。由于iNOS和eNOS對(duì)NO生成的調(diào)節(jié)的影響，因此檢測(cè)了LPS及AFYRW＋LPS作用下HUVECs中iNOS和eNOS的相對(duì)表達(dá)量。如圖4所示，與對(duì)照組相比，LPS刺激下，HUVECs的iNOS相對(duì)表達(dá)量顯著增加（P＜0.05）、eNOS相對(duì)表達(dá)量無顯著變化（P＞0.05），從而導(dǎo)致NO生成過量。結(jié)果表明AFYRW可通過降低NO的生成進(jìn)而減輕細(xì)胞損傷。

圖3 AFYRW對(duì)LPS刺激下HUVECs的NO含量的影響Fig.3 Effect of AFYRW on the content of NO in HUVECs under LPS stimulation

圖4 AFYRW對(duì)LPS刺激下HUVECs的iNOS、eNOS蛋白相對(duì)表達(dá)量的變化影響Fig.4 Effect of AFYRW on iNOS and eNOS protein expression under LPS stimulation

2.4 AFYRW對(duì)LPS刺激下單核細(xì)胞黏附的影響

單核細(xì)胞黏附、聚集在內(nèi)皮上是動(dòng)脈硬化發(fā)生早期的表現(xiàn)。單核-內(nèi)皮黏附實(shí)驗(yàn)被用來觀察ARYRW是否能抑制LPS刺激下單核細(xì)胞的黏附。如圖5、6所示，與對(duì)照組相比，LPS刺激能明顯誘導(dǎo)單核細(xì)胞THP-1黏附到HUVECs；加入AFYRW的實(shí)驗(yàn)組中熒光標(biāo)記的THP-1細(xì)胞明顯低于LPS組，并且AFYRW質(zhì)量濃度越高，標(biāo)記的THP-1細(xì)胞數(shù)量越少。結(jié)果表明AFYRW能夠抑制LPS誘導(dǎo)單核細(xì)胞THP-1對(duì)HUVECs細(xì)胞的黏附。

圖5 單核細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附性檢測(cè)結(jié)果（10×）Fig.5 Determination of monocyte adhesion to endothelial cells (10×)

圖6 單核細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附性檢測(cè)結(jié)果Fig.6 Determination of monocyte adhesion to endothelial cells

2.5 AFYRW對(duì)LPS刺激下HUVECS黏附分子和炎癥因子表達(dá)的影響

血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷后，可分泌多種黏附分子和促炎細(xì)胞因子，趨化單核細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮。與對(duì)照組比較，LPS刺激后，細(xì)胞中的VCAM-1、ICAM-1、IL-6、TNF-α蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著增加（P＜0.05），說明LPS誘導(dǎo)了HUVECs的炎性損傷；與模型組比較，低、高質(zhì)量濃度的AFYRW均可降低VCAM-1、ICAM-1、IL-6、TNF-α蛋白的相對(duì)表達(dá)量，高劑量組效果尤其極顯著或顯著（P＜0.01、P＜0.05），炎癥有所緩解（圖7）。說明AFYRW可減輕LPS誘導(dǎo)HUVECs的炎性損傷。NF-κB信號(hào)通路在LPS誘導(dǎo)的HUVECs的黏附分子及炎癥因子表達(dá)中起著關(guān)鍵作用。與對(duì)照組比較，LPS的刺激使p-p65蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著增加（P＜0.05）；與模型組相比，低劑量AFYRW可顯著降低該蛋白表達(dá)（P＜0.05），高劑量AFYRW可極顯著降低p-p65的表達(dá)（P＜0.01）（圖8），說明AFYRW可通過抑制NF-κB信號(hào)減輕黏附分子及炎癥因子的表達(dá)，從而減緩LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

圖7 AFYRW對(duì)LPS刺激下ICAM-1、VCAM-1、IL-6和TNF-α表達(dá)的影響Fig.7 Effect of AFYRW on the protein expression of ICAM-1,VCAM-1,IL-6 and TNF-α in HUVECs under LPS stimulation

圖8 AFYRW對(duì)LPS刺激下p-p65表達(dá)的影響Fig.8 Effect of AFYRW on the protein expression of p-p65 under LPS stimulation

3 討論

飲食因素在維持正常免疫系統(tǒng)功能方面發(fā)揮著至關(guān)重要的基礎(chǔ)和核心作用[9]。生物活性肽作為蛋白質(zhì)分解的產(chǎn)物，不僅能像蛋白質(zhì)一樣改善機(jī)體的營養(yǎng)狀況，還具有更強(qiáng)的抗氧化和調(diào)節(jié)免疫的作用[10]。研究認(rèn)為生物活性肽的免疫效應(yīng)與肽序列中的氨基酸的物理化學(xué)特性有關(guān)，如帶有正電荷的精氨酸的生物活性肽可結(jié)合并激活免疫細(xì)胞的趨化因子受體，色氨酸可被免疫細(xì)胞表面的阿片受體識(shí)別[11]。來源于苦蕎蛋白的抗氧化肽AFYRW序列中含有精氨酸和色氨酸，同時(shí)考慮氧化應(yīng)激與炎癥之間的關(guān)系，因此，本實(shí)驗(yàn)主要研究AFYRW對(duì)LPS誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)的改善作用。

慢性血管炎癥和隨后單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附是AS發(fā)生和發(fā)展的基本環(huán)節(jié)[12]。因此，抑制炎癥反應(yīng)和單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附可能是預(yù)防AS的有效策略[13]。血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷后，可分泌VCAM-1和ICAM-1等多種黏附分子，這些物質(zhì)可趨化單核細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮。動(dòng)脈硬化早期，白細(xì)胞黏附、聚集是一個(gè)重要環(huán)節(jié)，正常的血管內(nèi)皮不與白細(xì)胞發(fā)生黏附，但在血管硬化部位白細(xì)胞黏附于內(nèi)膜表面，并穿透內(nèi)皮細(xì)胞間連接進(jìn)入到內(nèi)膜，內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)的VCAM-1和ICAM-1可促進(jìn)白細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附，加速白細(xì)胞向血管內(nèi)皮游走，并促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖[14-17]。在促炎細(xì)胞因子中，IL-6是AS發(fā)展過程中的關(guān)鍵炎癥分子[18]，IL-6激活內(nèi)皮細(xì)胞參與白細(xì)胞募集并誘導(dǎo)IL-8、MCP-1和黏附分子的釋放，因此，抑制IL-6可以預(yù)防炎癥的發(fā)展[19-22]。在本研究中，用AFYRW干預(yù)后，可顯著抑制LPS誘導(dǎo)HUVECs上的黏附分子VCAM-1和ICAM-1、炎癥因子IL-6和TNF-α的表達(dá)，并減少LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞與HUVECs的黏附。以上結(jié)果表明AFYRW對(duì)血管炎癥具有有益的作用。

NO是血管穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，NOS催化L-精氨酸產(chǎn)生NO。NO促進(jìn)動(dòng)脈血管擴(kuò)張，抑制血小板聚集、單核細(xì)胞黏附至血管內(nèi)皮上，并抑制平滑肌細(xì)胞的增殖。大量研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞中NO生成的增加可抑制NF-κB活性并減輕AS[23]。在內(nèi)皮細(xì)胞中，NO通過eNOS催化生成，因此，促進(jìn)eNOS活化可能是控制AS的有效途徑。然而，研究報(bào)道iNOS催化產(chǎn)生的過量NO會(huì)對(duì)血管功能產(chǎn)生有害的影響[24]。iNOS是炎癥標(biāo)志物，在炎癥和免疫刺激下，iNOS被活化，催化NO過多產(chǎn)生，使機(jī)體發(fā)生氧脅迫，引起細(xì)胞損傷[25]，如過多的NO會(huì)引起血管擴(kuò)張，使血流減慢[26]。在炎癥早期NO可推動(dòng)炎癥細(xì)胞遷移，推動(dòng)炎癥進(jìn)程。因此，NO可間接反映血管內(nèi)皮細(xì)胞的受損程度[27]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)用LPS處理HUVECs后，NO含量明顯升高；AFYRW干預(yù)后，NO含量顯著降低，并呈劑量依賴性。通過Western blot檢測(cè)eNOS和iNOS的蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)eNOS在各組中的表達(dá)量沒有明顯變化，而在LPS處理后，iNOS表達(dá)明顯增高，經(jīng)過AFYRW干預(yù)后，與模型組相比，iNOS相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)，說明AFYRW可逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的iNOS表達(dá)，減少NO的生成，從而減輕細(xì)胞損傷。

NF-κB幾乎存在于所有炎癥介質(zhì)蛋白質(zhì)基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子部位上，NF-κB信號(hào)激活可通過調(diào)節(jié)包括細(xì)胞因子、趨化因子和黏附分子在內(nèi)的各種炎癥介質(zhì)的表達(dá)，在機(jī)體免疫中尤為重要[28]。通常情況下，NF-κB以二聚體的形式存在，與抑制蛋白-κB（inhibitors of κB，IκB）結(jié)合，存在于胞質(zhì)中。在刺激因子作用下（如LPS），IκB復(fù)合物先發(fā)生磷酸化，隨后泛素化降解，NF-κB p65的核定位序列暴露，活化的NF-κB p65可以進(jìn)入細(xì)胞核并與特定的DNA區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)靶基因的序列表達(dá)，如VCAM-1，從而參與細(xì)胞各病理生理過程[26]，并誘導(dǎo)相關(guān)因子的表達(dá)，其中包括iNOS，從而增強(qiáng)炎癥反應(yīng)[29-30]。因此，若能有效地抑制NF-κB的活性，可能有助于阻斷AS的發(fā)生發(fā)展[31-32]。本研究發(fā)現(xiàn)LPS作用內(nèi)皮細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)NF-κB p65磷酸化水平明顯升高，表明LPS可能促進(jìn)p65磷酸化，激活NF-κB轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，AFYRW干預(yù)后，p65磷酸化水平明顯下調(diào)，減輕炎癥反應(yīng)。

綜上所述，苦蕎活性肽AFYRW 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的HUVECs的炎性損傷具有早期預(yù)防作用，其作用機(jī)制可能與抑制NF-κB的活性有關(guān)。