分子動(dòng)力學(xué)模擬解析脈沖電場(chǎng)對(duì)類(lèi)PSE雞肉肌球蛋白凝膠特性作用規(guī)律

郭雨晨，董銘，曾憲明，田惠鑫，尹家琪，侯鈺柯，白云，唐長(zhǎng)波，韓敏義，2?，徐幸蓮

1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院/江蘇省肉類(lèi)生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心/農(nóng)業(yè)部肉品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095；2溫氏食品集團(tuán)股份有限公司，廣東云浮 527400

0 引言

【研究意義】過(guò)去幾十年來(lái)，全球禽肉生產(chǎn)和加工行業(yè)進(jìn)入了快速發(fā)展的時(shí)代，尤其是雞肉占家禽市場(chǎng)需求的 90%以上[1]，因其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、價(jià)格相對(duì)低廉、無(wú)宗教文化限制等優(yōu)點(diǎn)而深受現(xiàn)代消費(fèi)者的喜愛(ài)[2]。雞肉生產(chǎn)與消費(fèi)的主要國(guó)家和地區(qū)包括美國(guó)、中國(guó)、歐盟等，2021年，中國(guó)以1 989.1萬(wàn)t的產(chǎn)量位居世界第二[3]。為了滿(mǎn)足雞肉日益增長(zhǎng)的消費(fèi)需求，禽肉生產(chǎn)者通過(guò)基因品種選育和飼養(yǎng)促進(jìn)雞肉的生長(zhǎng)速率，但也導(dǎo)致了一系列雞肉品質(zhì)下降的問(wèn)題。其中，類(lèi)PSE（pale, soft and exudative）雞肉是目前發(fā)生率最高的異質(zhì)肉，由于宰前熱應(yīng)激和宰后環(huán)境高溫導(dǎo)致宰后糖酵解速率過(guò)高，肌原纖維蛋白變性，嚴(yán)重影響蛋白凝膠功能特性以及雞肉制品的保水性[4]。據(jù)調(diào)查，巴西和斯里蘭卡肉雞的類(lèi)PSE發(fā)生率分別為41.7%和70%，美國(guó)每年由于類(lèi)PSE肉高發(fā)生率造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)2億美元[5-7]。提高類(lèi)PSE肉的品質(zhì)能夠有效降低生產(chǎn)中的經(jīng)濟(jì)損失，目前研究人員積極開(kāi)發(fā)多種加工方式和技術(shù)手段以改善類(lèi)PSE肉的品質(zhì)，如添加磷酸鹽、膠原蛋白、大豆分離蛋白等非肉成分[2]、酸堿處理[1]、非酶糖基化[8]和超聲波處理[9]等，但是添加非肉成分并不是天然肉制品發(fā)展趨勢(shì)，且超聲波處理存在處理均一性較差的問(wèn)題，在工業(yè)化應(yīng)用存在一定的限制；并且目前對(duì)類(lèi)PSE雞肉肌原纖維蛋白改善作用蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程尚不明確。因此，尋找一種可靠的新型高效、均一的處理技術(shù)用于改善類(lèi)PSE雞肉蛋白質(zhì)功能特性，并在分子水平上揭示作用過(guò)程中肌球蛋白（肌原纖維蛋白主要成分）的動(dòng)態(tài)變化非常必要?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】脈沖電場(chǎng)（pulsed electric field，PEF）是指在處理室中放置食品物料，處理室兩端連有電極，通過(guò)較高的電場(chǎng)強(qiáng)度（1—80 kV·cm-1）和脈沖頻率（0—1 000 Hz）產(chǎn)生持續(xù)的電壓脈沖作用于電極，使食品物料在電場(chǎng)作用下發(fā)生變化，從而對(duì)食品品質(zhì)進(jìn)行改善與提高的一種新型非熱加工技術(shù)[10-11]。與傳統(tǒng)熱加工相比，PEF表現(xiàn)出處理溫度低、處理時(shí)間短等許多優(yōu)點(diǎn)，可以在對(duì)食品樣品處理的同時(shí)有效保留其原有的營(yíng)養(yǎng)和感官特性[12]。在PEF對(duì)蛋白質(zhì)影響的研究中，XIANG等[13]發(fā)現(xiàn)電場(chǎng)強(qiáng)度是決定大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)部分修飾的關(guān)鍵因素。金聲瑯等[14]研究發(fā)現(xiàn)35 kV·cm-1的PEF處理能夠明顯改善豬肉蛋白質(zhì)凝膠的硬度和彈性；當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度繼續(xù)增大時(shí)，豬肉蛋白質(zhì)凝膠的硬度和彈性又降低。涂宗財(cái)?shù)萚15]研究表明25 kV·cm-1的PEF處理顯著影響β-乳球蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)時(shí)間暴露在PEF中能降低β-乳球蛋白抗原性。這些研究證明了PEF改善肉類(lèi)蛋白凝膠功能特性的可能性，且在后續(xù)對(duì)類(lèi)PSE雞肉蛋白質(zhì)特性的研究中，DONG等[16]研究了0—28 kV·cm-1電場(chǎng)強(qiáng)度的脈沖電場(chǎng)對(duì)類(lèi)PSE雞肉肌原纖維蛋白質(zhì)功能特性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增加，蛋白質(zhì)的溶解性、表面疏水性和巰基含量均顯著提高，在到達(dá) 18 kV·cm-1后下降，并影響其二級(jí)結(jié)構(gòu)，但蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)并未受到影響。后續(xù)研究證實(shí)0—18 kV·cm-1的PEF處理提高了類(lèi)PSE雞肉肌原纖維蛋白凝膠的強(qiáng)度以及固定化水的比例，同樣在電場(chǎng)強(qiáng)度高于18 kV·cm-1時(shí)降低[17]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前對(duì)PEF處理改善凝膠功能特性過(guò)程中類(lèi)PSE雞肉蛋白體系的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)變化觀察的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。分子動(dòng)力學(xué)模擬（molecular dynamics simulation，MDS）是利用計(jì)算機(jī)建模模擬分子在設(shè)定力場(chǎng)中分子或原子的物理學(xué)運(yùn)動(dòng)軌跡，提供關(guān)于蛋白質(zhì)構(gòu)象變化詳細(xì)信息的一種工具[18]，通過(guò)收集模擬過(guò)程中的構(gòu)象變化、柔性變化等蛋白質(zhì)分子信息并進(jìn)行對(duì)比分析，從計(jì)算機(jī)動(dòng)態(tài)模擬數(shù)據(jù)和理論試驗(yàn)結(jié)果兩個(gè)角度驗(yàn)證PEF處理改善類(lèi)PSE雞肉蛋白的分子作用機(jī)制?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】探討不同脈沖電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)類(lèi) PSE雞肉蛋白顆粒分布及凝膠性的影響，并對(duì)其進(jìn)行PEF處理?xiàng)l件下的蛋白體系分子動(dòng)力學(xué)模擬，以探索蛋白構(gòu)象變化的作用機(jī)理，為改善異質(zhì)禽肉的蛋白功能特性以及拓展PEF技術(shù)在食品行業(yè)中的應(yīng)用范圍提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于 2021年在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

每次取50只雞的類(lèi)PSE雞胸肉（無(wú)骨、去皮胸大?。?，取自江蘇益客食品有限公司。原料為平均日齡（44±1.5）d，平均活重（2.02±0.43）kg的白羽肉雞（標(biāo)準(zhǔn)化籠養(yǎng)AA肉雞，經(jīng)過(guò)靜養(yǎng)、擊暈、刺殺放血、凈膛、預(yù)冷、分割、分揀得到樣品）?；谠缀? h的亮度值（L*）＞53和pH＜5.7進(jìn)行初步篩選[9,19]，測(cè)量位置應(yīng)避開(kāi)筋膜和脂肪。將樣品放置在含冰泡沫箱中，2 h內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室冷藏保存（0—4℃）。宰后24 h再次測(cè)定L*和pH，參考LI[9]的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)（L*＞53，pH＜5.7），確定類(lèi) PSE雞肉樣品。為消除樣品個(gè)體差異性，將可見(jiàn)的結(jié)締組織和脂肪剔除后分割成2 cm×2 cm×2 cm立方體，充分混合。最后，所有肉塊裝入聚乙烯袋中，為了保證原料的均一性，置于冰箱中冷凍貯藏（-20℃），并于兩周內(nèi)使用完，試驗(yàn)重復(fù)3次50只類(lèi)PSE雞胸肉肌原纖維蛋白的提?。╪=3）。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 主要試劑 氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀，南京化學(xué)試劑設(shè)備有限公司；Triton X-100，北京索萊寶科技有限公司；牛血清白蛋白，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；乙二醇雙（2-氨基乙醚）四乙酸，阿拉丁試劑有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2.2 主要儀器設(shè)備 CR-400色差儀，日本柯尼卡美能達(dá)公司；便攜式pH計(jì)，美國(guó)Orion 3-star公司；GM 200絞肉機(jī)，德國(guó)萊馳公司；Ultra Turrax T25高速勻漿機(jī)，德國(guó)萊卡公司；Avanti J-E高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司；DMC-200高壓脈沖電源，大連鼎通科技發(fā)展有限公司；M2e多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)MD公司；穩(wěn)定性分析儀，Turbiscan Tower，法國(guó)Formulaction公司；TA-XT plus質(zhì)構(gòu)儀，英國(guó)Stable Micro Systems公司；Physica MCR 301流變儀，奧地利安東帕公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 肌原纖維蛋白的提取 參考HAN等[20]的方法并稍加改進(jìn)，環(huán)境溫度為4℃。稱(chēng)取解凍12 h的類(lèi)PSE雞胸肉200 g，用預(yù)冷的絞肉機(jī)攪碎5次（4 s/次），加入 4倍體積的標(biāo)準(zhǔn)鹽溶液（0.1 mol·L-1KCl、20 mmol·L-1K2HPO4/KH2PO4、2 mmol·L-1MgCl2、1 mmol·L-1EGTA，pH 7.0），7 000 r/min冰浴勻漿 30 s，雙層紗布過(guò)濾，2 000×g離心10 min，重復(fù)洗脫3次，且第3次勻漿前加入0.5% Triton X-100溶液。所得沉淀加入4倍體積的0.1 mol·L-1KCl溶液，7 000 r/min冰浴勻漿30 s，雙層紗布過(guò)濾，2 500×g離心10 min重復(fù)洗脫兩次。所得沉淀即為類(lèi)PSE雞胸肉肌原纖維蛋白。將肌原纖維蛋白溶解于磷酸鹽緩沖溶液（0.6 mmol·L-1KCl、20 mmol·L-1K2HPO4/KH2PO4，pH 7.0），使用雙縮脲法，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，測(cè)定蛋白濃度。

1.3.2 PEF處理 PEF裝置是由DMC-200高壓脈沖電源、控制面板和電極板間距2.5 cm的平行式處理室等組成。該設(shè)備產(chǎn)生的脈沖波形為方波，電場(chǎng)強(qiáng)度是影響處理工藝有效性的主要因素。目前關(guān)于PEF處理對(duì)類(lèi)PSE雞肉蛋白凝膠功能特性影響相關(guān)研究較少，并且受限于儀器最大電場(chǎng)強(qiáng)度為 28 kV·cm-1和處理室容量。為保證本研究的代表性，需要選擇較大的電場(chǎng)強(qiáng)度范圍，再結(jié)合前期DONG等[16]考察電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)類(lèi)PSE雞胸肉蛋白凝膠特性和構(gòu)象變化影響的研究基礎(chǔ)，處理?xiàng)l件如下：電場(chǎng)強(qiáng)度為8、18和 28 kV·cm-1、頻率為 800 Hz、占空比為 47%。PEF處理在 4℃條件下操作，用冰浴的去離子水清洗處理室內(nèi)壁，將100 mL在1.3.1中提取的類(lèi)PSE雞胸肉肌原纖維蛋白小心倒入處理室。處理結(jié)束后測(cè)量樣品溶液的溫度，控制溫升。處理后的蛋白溶液在 4℃的冷藏條件下保存。每個(gè)處理組均進(jìn)行 3次重復(fù)處理。

1.4 不穩(wěn)定動(dòng)力學(xué)指數(shù)（turbiscan stability index，TSI）的測(cè)定

為了便于高濃度蛋白體系的顆粒粒徑及動(dòng)態(tài)分散穩(wěn)定性進(jìn)行比較，使用穩(wěn)定性分析儀Turbiscan Tower測(cè)量。將18 mL未經(jīng)處理和經(jīng)不同條件PEF處理的類(lèi)PSE雞肉肌原纖維蛋白分別移取至圓柱形掃描玻璃管中，通過(guò)波長(zhǎng)為880 nm脈沖式近紅外光源自上而下每隔110 s掃描一次樣品，測(cè)定溫度為4℃，測(cè)定時(shí)間為180 min，利用兩個(gè)同步光學(xué)檢測(cè)器分別監(jiān)測(cè)并采集以0°角度來(lái)自光源透過(guò)樣品的透射光和135°角背散射光強(qiáng)度的數(shù)據(jù)。所得曲線描繪了后向散射現(xiàn)象的強(qiáng)度隨時(shí)間的變化，基于曲線斜率評(píng)估TSI，TSI值越大，斜率越大，表明樣品顆粒聚集程度越高，分散體系越不穩(wěn)定[21]。測(cè)定均重復(fù)3次。

1.5 蛋白熱誘導(dǎo)凝膠的制備

將未經(jīng)處理和PEF處理后的類(lèi)PSE雞胸肉肌原纖維蛋白樣品分別加至10 mL離心管，4℃下200×g離心1 min以去除樣品內(nèi)部氣泡。然后置于水浴鍋中，以1℃·min-1的升溫速度從20℃水浴加熱到80℃，并在80℃保溫20 min，取出冷卻至室溫。最后將其置于4℃冰箱中冷藏24 h以完全形成凝膠，然后測(cè)量凝膠保水性。

1.6 凝膠保水性（water holding capacity，WHC）的測(cè)定

參照BIAN等[8]的方法并稍加改進(jìn)，分別稱(chēng)取3 g制備的不同處理蛋白凝膠于10 mL離心管中，4℃下10 000×g離心10 min，用吸水紙將離心后蛋白凝膠表面的多余水分擦去，記錄離心后凝膠質(zhì)量。根據(jù)如下公式計(jì)算凝膠保水性，每組肌原纖維蛋白質(zhì)樣品重復(fù)稱(chēng)取并測(cè)定3次。

式中，m0：離心管質(zhì)量（g）；m1：離心前凝膠和離心管的質(zhì)量（g）；m2：離心除水后凝膠和離心管的質(zhì)量（g）。

1.7 流變學(xué)特性的測(cè)定

參考DONG等[16]的方法并適當(dāng)修改，使用Physica MCR 301動(dòng)態(tài)流變儀測(cè)定未經(jīng)處理和不同PEF處理后類(lèi)PSE雞肉肌原纖維蛋白樣品的流變學(xué)特性。將45 mg·mL-1經(jīng)不同電場(chǎng)強(qiáng)度PEF處理和未經(jīng)處理的蛋白樣品均勻涂抹在直徑為50 mm的底部平板上，設(shè)定上下探測(cè)平行板的間距為 1 mm。在測(cè)量之前，擦去兩平板間的多余樣液，并在邊緣滴加液體石蠟封鎖，以防止加熱過(guò)程中的水分蒸發(fā)。為了誘導(dǎo)凝膠形成，蛋白樣品在20℃平衡3 min，然后以2℃·min-1的掃描速率升溫至80℃，恒應(yīng)變和頻率分別為1%和0.1 Hz。在整個(gè)升溫過(guò)程中，記錄儲(chǔ)能模量（G′）和損耗模量（G″），并對(duì)樣品的流變學(xué)行為進(jìn)行評(píng)估。測(cè)定均重復(fù)3次。

1.8 分子動(dòng)力學(xué)模擬

1.8.1 同源建模 為了保證分子動(dòng)力學(xué)模擬的科學(xué)性和準(zhǔn)確性，對(duì)肌球蛋白的重鏈亞基（MHC）、堿性輕鏈亞基（MLC）和調(diào)節(jié)輕鏈亞基（RLC）分別進(jìn)行了同源建模。通過(guò)比對(duì)結(jié)構(gòu)覆蓋率（query covery）以及序列相似程度（sequence identity），在數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇與目標(biāo)蛋白序列同源性較高的蛋白三維結(jié)構(gòu)作為模板，即心肌肌球蛋白（5TBY）：相似程度 80.95%、結(jié)構(gòu)覆蓋率99%和蛛肌肌球蛋白（3JBH）：相似程度81.01%、結(jié)構(gòu)覆蓋率99%，對(duì)目標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行多模板同源模建，從而優(yōu)化目標(biāo)蛋白的三維結(jié)構(gòu)。

1.8.2 分子動(dòng)力學(xué)模擬過(guò)程 以 Gromacs v2018軟件對(duì)肌球蛋白三維結(jié)構(gòu)模型在水環(huán)境體系中進(jìn)行 30 ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬。使用Gromos 53a6力場(chǎng)，水模型為SPC。為了再現(xiàn)PEF處理的環(huán)境條件，模擬體系的溫度耦合采用“Berendsen thermostat”法，溫度保持在4℃，壓力耦合采用“Berendsen”方法，參照壓力為1.0×105Pa。模擬體系采用標(biāo)準(zhǔn)立方盒包裹模型及其他分子，復(fù)合物置于盒子中心。在對(duì)模型進(jìn)行完全自由的動(dòng)力學(xué)模擬之前，先用最陡下降法對(duì)該復(fù)合物體系優(yōu)化2 000步，以消除可能的原子碰撞。隨后，對(duì)溶劑進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，時(shí)間為100 ps；然后分別限制蛋白主鏈、CA原子和配體，進(jìn)行100 ps的模擬；最后，取消限制并優(yōu)化100 ps，即完成了常規(guī)動(dòng)力學(xué)的前處理。體系在y軸方向上增加電場(chǎng)強(qiáng)度為18 kV·cm-1的 PEF誘導(dǎo)條件，同時(shí)增加空白模擬組。在所有方向上采用周期性邊界條件，模擬步長(zhǎng)為2 fs，每1 ps輸出一個(gè)構(gòu)象。

1.8.3 軌跡分析 計(jì)算蛋白質(zhì)總體構(gòu)象變化及分子柔韌性等參數(shù)變化，并使用Gromacs工具進(jìn)行軌跡分析，從而評(píng)估優(yōu)化的PEF誘導(dǎo)條件對(duì)目標(biāo)蛋白的分子作用。

1.9 數(shù)據(jù)處理

利用SAS 8.2數(shù)據(jù)分析軟件（美國(guó)賽仕軟件公司）對(duì)各指標(biāo)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），多重比較采用Duncan’s multiple range test法，差異顯著性為P＜0.05，并用Origin 8.0（美國(guó)Origin Lab公司）軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 蛋白體系分散穩(wěn)定性

TSI是指通常用于表征蛋白體系分散穩(wěn)定性的重要參數(shù)，基于儀器實(shí)時(shí)檢測(cè)的背散射光和透射光信號(hào)，可以快速有效地評(píng)估不同PEF處理樣品之間的穩(wěn)定性差異[22]。圖1為類(lèi)PSE雞胸肉蛋白在0、8、18和28 kV·cm-1PEF場(chǎng)強(qiáng)下TSI隨時(shí)間變化的趨勢(shì)圖。對(duì)照組和PEF處理組蛋白溶液的TSI不穩(wěn)定指數(shù)隨掃描時(shí)間的延長(zhǎng)均呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，但其斜率差異較大。但 TSI曲線在34 min時(shí)出現(xiàn)了一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)，隨后對(duì)照組樣品表現(xiàn)出比PEF處理組更高的TSI值，代表了對(duì)照組的蛋白溶液具有最不穩(wěn)定的分散體系。具體地來(lái)說(shuō)，不同PEF處理組蛋白的TSI曲線均表現(xiàn)出較好的分散穩(wěn)定性能，其值均小于0.18。然而，隨著PEF電場(chǎng)強(qiáng)度的進(jìn)一步增加，相對(duì)于 8 kV·cm-1處理后的樣品，18和28 kV·cm-1條件下蛋白體系的TSI曲線又呈現(xiàn)輕微的升高趨勢(shì)，穩(wěn)定性略微降低。

圖1 不同PEF處理下類(lèi)PSE雞胸肉蛋白溶液的TSI值隨時(shí)間變化曲線Fig.1 Variation of TSI values as a function of time in PSE-like chicken protein solutions at the different PEF treatments

2.2 凝膠保水性

對(duì)照組肌原纖維蛋白凝膠保水性最弱，為76.15%。PEF處理對(duì)蛋白凝膠保水性隨電場(chǎng)強(qiáng)度增加呈現(xiàn)出不同程度的改善，且所有PEF處理組之間蛋白凝膠保水性無(wú)顯著性差異。8 kV·cm-1的PEF處理時(shí)凝膠保水性為77.82%，并且隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增加，蛋白凝膠保水性提高，并在18 kV·cm-1時(shí)達(dá)到最大值81.42%，此時(shí)凝膠保水性顯著高于非PEF處理組。然而當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度進(jìn)一步增加至28 kV·cm-1時(shí)，蛋白凝膠保水性下降到79%（圖2）。

圖2 PEF電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)類(lèi)PSE雞胸肉蛋白凝膠保水性的影響Fig.2 Effects of PEF intensity on the water holding capacity(WHC) of protein gels extracted from PSE-like chicken meat

2.3 流變特性

動(dòng)態(tài)流變學(xué)測(cè)定有助于揭示PEF作用類(lèi)PSE雞胸肉蛋白的熱誘導(dǎo)凝膠形成過(guò)程[23]，其中儲(chǔ)能模量（G′）表示蛋白流體黏彈行為中的彈性部分，可以衡量樣品的凝膠強(qiáng)度，而損耗模量（G″）表示流體黏性大小[4]。由圖 3可知，所有的蛋白樣品都呈現(xiàn)出典型的流變學(xué)加熱曲線，表明其從黏性蛋白流體到彈性凝膠網(wǎng)絡(luò)的熱轉(zhuǎn)變趨勢(shì)。在加熱初期，未經(jīng)PEF處理和 PEF處理的類(lèi) PSE肉樣品的 G′變化不大，或略有下降。進(jìn)一步加熱時(shí)，G′出現(xiàn)不同程度的急劇增加，并在50℃左右達(dá)到峰值，表明此階段開(kāi)始形成彈性較弱的蛋白凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，這通常被認(rèn)為是由肌球蛋白頭部相互作用形成聚集所導(dǎo)致的結(jié)果[24]。然后，當(dāng)溫度從50℃升高至58℃時(shí)，肌球蛋白尾部變性以及流動(dòng)性增加使初步形成的弱凝膠網(wǎng)絡(luò)斷裂[23]，導(dǎo)致G′出現(xiàn)劇烈下降。隨后繼續(xù)加熱至80℃，由于非共價(jià)鍵的交互作用增加了蛋白聚集的緊密程度，使G′出現(xiàn)大幅度的上升趨勢(shì)，這意味著蛋白從黏性溶膠狀態(tài)向彈性凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變。類(lèi)似的黏彈性變化趨勢(shì)也出現(xiàn)在高壓靜電場(chǎng)作用于牛肉肌原纖維蛋白體系中[24]。此外，未經(jīng)處理和PEF處理的類(lèi)PSE肉樣品的G″變化趨勢(shì)與G′基本一致，而且G″始終低于G′。

通過(guò)動(dòng)態(tài)流變學(xué)觀察，未經(jīng)處理和PEF處理的類(lèi)PSE肉樣品在加熱過(guò)程中的黏彈性變化趨勢(shì)基本相似，且 G′越大，彈性凝膠形成程度越大。如圖 3所示，對(duì)照組樣品的G′最低，說(shuō)明經(jīng)熱誘導(dǎo)的類(lèi)PSE雞胸肉蛋白凝膠彈性較差。相比于電場(chǎng)強(qiáng)度為8和28 kV·cm-1條件下，18 kV·cm-1的 PEF 處理使類(lèi) PSE雞肉肌原纖維蛋白 G′明顯上升，推測(cè) 18 kV·cm-1的PEF處理有助于類(lèi)PSE雞胸肉蛋白形成更具彈性的凝膠網(wǎng)絡(luò)。

圖3 PEF電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)類(lèi)PSE雞胸肉蛋白動(dòng)態(tài)流變特性（G′）和（G″）的影響Fig.3 Effects of PEF intensity on the dynamic rheological properties (G′, G″) of proteins extracted from PSE-like chicken meat

2.4 分子動(dòng)力學(xué)模擬

2.4.1 模型質(zhì)量評(píng)估 采用 PROCHECK 對(duì)建好的模型結(jié)構(gòu)進(jìn)行評(píng)估，分析其多聚體結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性和立體化學(xué)規(guī)則，其結(jié)果可通過(guò)Ramachandran plot進(jìn)行顯示。Ramachandran plot可以闡述蛋白質(zhì)或肽立體結(jié)構(gòu)中肽鍵內(nèi)α碳原子和羰基碳原子間鍵的旋轉(zhuǎn)度對(duì)α碳原子和氮原子間鍵的旋轉(zhuǎn)度，并指明蛋白質(zhì)或肽類(lèi)中氨基酸殘基的允許和不允許的構(gòu)象。

由于 MHC蛋白結(jié)構(gòu)尺寸較大，無(wú)法一次完成PROCHECK分析；因此，MHC鏈段分成兩段結(jié)構(gòu)（1—500殘基鏈段及501—974殘基鏈段）可以很好地模擬出MHC的分子變化，并對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)。如圖4所示，模型MHC A鏈1—500殘基鏈段中85.6%的氨基酸位于核心區(qū)域，12.2%的氨基酸殘基位于允許區(qū)域，0.9%的氨基酸殘基位于最大允許區(qū)域，只有1.3%的氨基酸殘基位于扭轉(zhuǎn)角的禁止區(qū)域；501—974殘基鏈段中 90.3%的氨基酸位于核心區(qū)域，8.6%的氨基酸殘基位于允許區(qū)域，0.7%的氨基酸殘基位于最大允許區(qū)域，只有0.5%的氨基酸殘基位于扭轉(zhuǎn)角的禁止區(qū)域。模型MHC B鏈1—500殘基鏈段中85.1%的氨基酸位于核心區(qū)域，13.5%的氨基酸殘基位于允許區(qū)域，0.4%的氨基酸殘基位于最大允許區(qū)域，只有 0.9%的氨基酸殘基位于扭轉(zhuǎn)角的禁止區(qū)域；501—974殘基鏈段中88.7%的氨基酸位于核心區(qū)域，7.4%的氨基酸殘基位于允許區(qū)域，2.1%的氨基酸殘基位于最大允許區(qū)域，只有1.9%的氨基酸殘基位于扭轉(zhuǎn)角的禁止區(qū)域。

圖4 MHC A鏈模型1—500殘基（A）、501—974殘基（B）、B鏈模型1—500殘基（C）、501—974殘基（D）的Ramachandran plotFig.4 Ramachandran plot for the MHC chain A 1-500 residue (A), 501-974 residue (B), the MHC chain B 1-500 residue (C) and 501-974 residue (D)

由此得出蛋白整體符合立體化學(xué)能量規(guī)則，所構(gòu)建的蛋白模型準(zhǔn)確性較好，質(zhì)量較高，可進(jìn)行后續(xù)模擬試驗(yàn)。

2.4.2 蛋白總體構(gòu)象變化 為了深入探究多聚體蛋白體系在30 ns分子動(dòng)力學(xué)模擬過(guò)程中的構(gòu)象相對(duì)變化，以初始蛋白結(jié)構(gòu)為參考構(gòu)象，計(jì)算均方根偏差（root mean square deviation，RMSD），以評(píng)估不同PEF作用對(duì)多聚體蛋白構(gòu)象運(yùn)動(dòng)狀況和平衡時(shí)刻的影響。RMSD是指蛋白體系中每個(gè)原子運(yùn)動(dòng)偏移的均值，反映蛋白整體相對(duì)于參考結(jié)構(gòu)的構(gòu)象偏差，是監(jiān)測(cè)模擬體系的平衡過(guò)程并判斷構(gòu)象是否穩(wěn)定的一個(gè)重要標(biāo)準(zhǔn)[25]，可用以下公式計(jì)算[26]：

式中，rfinal(i)：第i個(gè)構(gòu)象的均方根偏差，rinitial(i)：第i個(gè)參照構(gòu)象的均方根偏差，N：構(gòu)象數(shù)。

由圖5-A發(fā)現(xiàn)，18 kV·cm-1電場(chǎng)模擬體系中多聚體蛋白復(fù)合物的 RMSD值波動(dòng)相比于對(duì)照模擬體系更為劇烈。在7 ns之前的模擬起始階段，蛋白體系初期的 RMSD值波動(dòng)顯著且均呈現(xiàn)快速直線上升的變化趨勢(shì)，對(duì)照體系波動(dòng)不太穩(wěn)定是由于在初始平衡階段蛋白體系對(duì)溶劑作用進(jìn)行的調(diào)整和適應(yīng)所導(dǎo)致的正?，F(xiàn)象。隨后，對(duì)照體系的RMSD曲線呈曲折上升，變化幅度較為緩慢，15 ns后處于較小波動(dòng)范圍，趨于穩(wěn)定；而18 kV·cm-1電場(chǎng)模擬體系的RMSD曲線在7—20 ns保持上升，結(jié)構(gòu)偏移程度較大，在15 ns時(shí)稍有下降趨勢(shì)，但整體來(lái)看仍在增長(zhǎng)，至最后10 ns變化相對(duì)平緩，體系RMSD值維持在0.85左右，便于后續(xù)分析。上述結(jié)果表明，18 kV·cm-1電場(chǎng)作用使模擬體系中蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生較大波動(dòng)，隨著模擬時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白結(jié)構(gòu)逐漸達(dá)到平衡狀態(tài)，最終蛋白體系結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性稍有下降。

為更加直觀地觀察模擬過(guò)程中電場(chǎng)作用下多聚體蛋白總體構(gòu)象分布狀態(tài)的變化情況，每10 ns提取一個(gè)分子模型的動(dòng)力學(xué)軌跡進(jìn)行作圖分析。30 ns內(nèi)電場(chǎng)模擬體系的蛋白三維結(jié)構(gòu)如圖5-B所示，觀察到多聚體蛋白經(jīng)分子模擬后有明顯結(jié)構(gòu)松散的趨勢(shì)，即多聚體蛋白的豆芽狀結(jié)構(gòu)開(kāi)始遭受破壞，豆芽稈開(kāi)始松散和彎折，頭部結(jié)構(gòu)域螺旋鏈發(fā)生明顯的解折疊（圖中黑色圓圈部分）。同時(shí)，由于豆芽狀頭部結(jié)構(gòu)域中大部分螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，分子柔性相對(duì)于對(duì)照體系變大。其中，多聚體蛋白的MHC鏈結(jié)構(gòu)在長(zhǎng)螺旋鏈區(qū)發(fā)生了明顯的解螺旋，MHC B鏈尤為明顯，部分螺旋鏈幾乎全解螺旋成為無(wú)規(guī)則卷曲狀態(tài)；MLC C鏈端小螺旋在電場(chǎng)的作用下，大部分發(fā)生了解螺旋，Coil發(fā)生向內(nèi)的分子鏈運(yùn)動(dòng)取向；兩條RLC鏈也存在相同的現(xiàn)象，電場(chǎng)作用使RLC分子坍塌，Coil向蛋白結(jié)構(gòu)域方向取向，解螺旋現(xiàn)象更為明顯。因此，30 ns的動(dòng)力學(xué)模擬后，在18 kV·cm-1的電場(chǎng)模擬環(huán)境中，蛋白分子發(fā)生較大漲幅，蛋白空間結(jié)構(gòu)逐漸遭到破壞，變得松散，最終導(dǎo)致蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

圖5 0 kV·cm-1和18 kV·cm-1電場(chǎng)體系中蛋白骨架原子均方根偏差的變化（A）及18 kV·cm-1電場(chǎng)體系中蛋白三維結(jié)構(gòu)隨模擬時(shí)間的變化（B）Fig.5 RMSD of the protein backbone atoms in 0 kV·cm-1 and 18 kV·cm-1 electric field systems (A) and three-dimensional structures of proteins versus simulation times in the 18 kV·cm-1 pulsed electric fields (B)

2.4.3 蛋白分子柔性變化 均方根波動(dòng)（root mean square fluctuation，RMSF）是指模擬體系最終原子位置同平均位置的比值，通過(guò)計(jì)算多聚體蛋白各個(gè)氨基酸殘基相對(duì)于平均結(jié)構(gòu)的位置偏差來(lái)表征蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化程度[27]。在動(dòng)力學(xué)模擬平衡后，對(duì)多聚體蛋白復(fù)合物中MHC、MLC及RLC每一條單鏈的RMSF值進(jìn)一步分析，結(jié)果如圖6所示。進(jìn)一步對(duì)比有無(wú)電場(chǎng)模擬體系下RMSF變化發(fā)現(xiàn)，18 kV·cm-1電場(chǎng)模擬體系中蛋白 RMSF值的波動(dòng)相比于對(duì)照體系更為顯著，表明18 kV·cm-1電場(chǎng)作用下的多聚體蛋白分子比對(duì)照組蛋白表現(xiàn)出更高的柔韌性。

圖6 有無(wú)電場(chǎng)體系中肌球蛋白多聚體均方根波動(dòng)的變化Fig.6 RMSF of myosin multimer with and without electric field systems

MHC兩條重鏈在電場(chǎng)作用下其RMSF存在一些差別：MHC A鏈在電場(chǎng)的作用下比在不加電場(chǎng)的作用下略小，但部分結(jié)構(gòu)RMSF非常大；如殘基935—973片段，其最大RMSF高達(dá)1.5 nm。這可能是由于其他亞基的空間限制和電場(chǎng)作用，導(dǎo)致其漲幅較??；而豆芽狀的長(zhǎng)螺旋鏈發(fā)生了解螺旋和彎折，其部分片段波動(dòng)則較為明顯。B鏈在電場(chǎng)的作用下，由于亞基的空間限制相對(duì)較小，其在電場(chǎng)的作用下波動(dòng)比沒(méi)有電場(chǎng)的條件下波動(dòng)更大。兩條相同的蛋白鏈段表現(xiàn)出的結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)行為差異的原因可能是由于A鏈同時(shí)受到MHC B、MLC C、RLC E鏈的空間限制所致。相比于對(duì)照模擬體系，MLC的C鏈在電場(chǎng)作用下發(fā)生了較大程度上的波動(dòng)，且D鏈整體殘基波動(dòng)在有電場(chǎng)作用下更為明顯，特別是端部Coil區(qū)。此外，與MHC鏈和MLC鏈相比，RLC兩條鏈在18 kV·cm-1模擬體系條件下的RMSF值波動(dòng)顯著高于對(duì)照組。

3 討論

3.1 脈沖電場(chǎng)影響肌球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)

本研究模擬了類(lèi) PSE雞肉肌球蛋白分子在 18 kV·cm-1電場(chǎng)強(qiáng)度PEF下的結(jié)構(gòu)變化。模擬結(jié)果顯示，18 kV·cm-1的PEF會(huì)修飾原有的肌球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，使肌球蛋白分子多聚體發(fā)生解螺旋和解折疊，大部分α-螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)規(guī)則卷曲，導(dǎo)致其鏈段結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯波動(dòng)，表現(xiàn)為更高的 RMSD值，這可能歸因于 PEF對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞。ENGLISH等[28]進(jìn)行的外加電場(chǎng)下溶菌酶分子動(dòng)力學(xué)模擬表現(xiàn)出蛋白質(zhì)變性及二級(jí)結(jié)構(gòu)的顯著變化，王麗娟[29]也觀察到 25 kV的PEF誘導(dǎo)油菜籽蛋白變性，蛋白多肽鏈發(fā)生了解螺旋，α-螺旋含量顯著降低，同時(shí)無(wú)規(guī)則卷曲含量顯著升高，這與本研究的模擬結(jié)果一致。

而更劇烈的RMSF波動(dòng)體現(xiàn)在蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)被破壞，多肽鏈的展開(kāi)使更多的殘基暴露，為蛋白質(zhì)分子與蛋白質(zhì)分子和其他水分子結(jié)合交聯(lián)提供活性位點(diǎn)，促進(jìn)新的蛋白聚集體的形成。熱誘導(dǎo)凝膠是指蛋白質(zhì)經(jīng)加熱變性后通過(guò)分子間的（非）共價(jià)鍵相互交聯(lián)，形成的具有包埋水分子的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[30]，全面了解蛋白熱誘導(dǎo)凝膠的功能特性對(duì)于能否獲得產(chǎn)品品質(zhì)好以及出品率高的類(lèi)PSE肉制品至關(guān)重要。而凝膠結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生就是蛋白質(zhì)之間適當(dāng)?shù)慕宦?lián)聚集的過(guò)程，因此，推斷PEF處理通過(guò)影響蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)從而進(jìn)一步改變類(lèi)PSE雞肉蛋白體系分散穩(wěn)定性和凝膠特性（保水性及流變特性）。

3.2 脈沖電場(chǎng)影響肌球蛋白分子相互作用力

從分子相互作用力上來(lái)看，PEF作用影響了肌球蛋白分子之間的氫鍵、靜電相互作用以及蛋白分子與水之間的結(jié)合。根據(jù)ZHAO等[31]的說(shuō)法，PEF可以釋放能量誘導(dǎo)蛋白質(zhì)分子內(nèi)部介電常數(shù)發(fā)生變化并產(chǎn)生分子極化現(xiàn)象，增強(qiáng)蛋白質(zhì)分子之間的靜電相互作用。PEF引起肌球蛋白展開(kāi)使更多的殘基暴露同樣會(huì)引起新的氫鍵生成[17]。二者進(jìn)一步誘導(dǎo)了類(lèi) PSE 雞肉蛋白質(zhì)的增溶，這與DONG等[16]觀察18 kV·cm-1的PEF處理類(lèi)PSE雞肉蛋白溶解性變化結(jié)果相同。蛋白質(zhì)溶解性的提高，促進(jìn)了其穩(wěn)定性的增強(qiáng)，這與34 min時(shí)PEF處理樣品掃描結(jié)果顯示出更高穩(wěn)定性的結(jié)果一致。保水性是熱誘導(dǎo)凝膠最重要的特征之一，反映了蛋白質(zhì)在加工過(guò)程中吸收水分子的能力與蛋白質(zhì)水合能力的強(qiáng)弱緊密相關(guān)[32]。殘基的暴露也增強(qiáng)蛋白質(zhì)與溶劑水的相互作用，同時(shí)水分子加速聚合使各個(gè)水分子之間的距離縮短變得更為緊密，從而提高蛋白凝膠的保水性能。

另外，保水性的提高還可能與PEF處理減小蛋白分子粒徑尺寸有關(guān)，使其形成了顆粒較小且均勻的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。AMIRI等[24]同樣發(fā)現(xiàn)牛肉蛋白粒徑大小與凝膠保水性呈反比關(guān)系，并指出減小蛋白顆粒尺寸使其凝膠結(jié)構(gòu)具有良好的保水性。蛋白體系分散穩(wěn)定性在掃描初期，PEF處理組蛋白體系的TSI值高于對(duì)照組即穩(wěn)定性降低，類(lèi)似的現(xiàn)象也出現(xiàn)在凝乳酶-山羊奶混合體系中[21]，這可能是由于蛋白質(zhì)分子介電常數(shù)的改變加速了蛋白顆粒在溶液中的布朗運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的。

據(jù)報(bào)道，展開(kāi)的蛋白質(zhì)分子間的靜電吸引以及形成的氫鍵會(huì)發(fā)生廣泛的分子間相互作用，從而形成更強(qiáng)的蛋白質(zhì)彈性網(wǎng)絡(luò)[33]，氫鍵的存在同樣會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)凝膠的黏性升高有促進(jìn)作用[34]。這也解釋了PEF處理后類(lèi)PSE雞肉蛋白凝膠相較于未處理樣品表現(xiàn)出更高的黏彈性這一現(xiàn)象。

3.3 脈沖電場(chǎng)對(duì)肌球蛋白分子構(gòu)象的影響

從肌球蛋白分子構(gòu)象的角度來(lái)看，模擬中更強(qiáng)的RMSF波動(dòng)則說(shuō)明PEF處理誘導(dǎo)肌球蛋白分子極化以及水分子聚合后，打破了維持蛋白空間結(jié)構(gòu)的非共價(jià)鍵和靜電相互作用，部分展開(kāi)的肌球蛋白分子之間相互折疊纏繞，通過(guò)空間位阻及蛋白質(zhì)鏈內(nèi)的相互摩擦提高黏度[33]，展開(kāi)后的蛋白質(zhì)暴露出更多的親水基團(tuán)，在凝膠形成時(shí)能很好地與水結(jié)合，使蛋白質(zhì)分子溶脹增加摩擦，即黏性的提高[35]。DONG等[16]發(fā)現(xiàn)經(jīng)PEF處理后類(lèi)PSE雞肉蛋白表面巰基含量增加，可以推測(cè)電場(chǎng)作用下更多蛋白分子中外露的疏水基團(tuán)可能會(huì)改變蛋白分子之間和蛋白質(zhì)分子與水分子之間的相互作用力，使結(jié)構(gòu)尺寸減小，對(duì)形成良好保水性的凝膠質(zhì)地有一定貢獻(xiàn)。ZHANG等[36]也觀察到PEF處理后的油菜籽蛋白二級(jí)變化所引起的活性巰基和表面疏水性增加等構(gòu)象的變化導(dǎo)致的保水性提高，這與本研究中模擬和保水性結(jié)果一致。

然而，高電場(chǎng)強(qiáng)度（28 kV·cm-1）處理則會(huì)對(duì)類(lèi)PSE雞肉蛋白凝膠水合能力和黏彈性產(chǎn)生負(fù)面影響。這可能是由于高電場(chǎng)強(qiáng)度的PEF處理對(duì)肌球蛋白去折疊作用增強(qiáng)，分子內(nèi)部活性基團(tuán)的過(guò)度暴露，破壞不同作用力之間的平衡狀態(tài)，此時(shí)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用相較于蛋白質(zhì)-水而言更強(qiáng)[1]，高度暴露的巰基也可以通過(guò)氧化相鄰蛋白質(zhì)鏈上的兩個(gè)半胱氨酸殘基形成二硫鍵，蛋白質(zhì)進(jìn)一步聚集產(chǎn)生聚集體[16]，使蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)束縛水分的能力下降，黏彈性降低。金聲瑯等[37]的研究也觀察到相似的結(jié)果，其探究了PEF預(yù)處理對(duì)淀粉和豬肉蛋白混合凝膠保水性的影響，結(jié)果顯示隨PEF電場(chǎng)強(qiáng)度的增加，混合凝膠的保水性表現(xiàn)出先高后低的趨勢(shì)。

4 結(jié)論

優(yōu)化的PEF處理?xiàng)l件能夠通過(guò)修飾蛋白分子構(gòu)象發(fā)生轉(zhuǎn)變，影響蛋白質(zhì)與水分子的結(jié)合作用以及熱誘導(dǎo)凝膠形成，從而有效改善類(lèi)PSE雞肉蛋白的凝膠特性。隨著電場(chǎng)強(qiáng)度從0增加至28 kV·cm-1，類(lèi)PSE雞肉蛋白的凝膠保水性和流變特性（G′、G″）呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。其中，18 kV·cm-1的PEF處理表現(xiàn)出更優(yōu)的凝膠保水性和彈性網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這歸因于較小的顆粒尺寸和水的流動(dòng)性。TSI結(jié)果證實(shí)，經(jīng)PEF處理后蛋白粒徑變小，且體系分散穩(wěn)定性?xún)?yōu)于對(duì)照組。而分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，優(yōu)化的PEF條件（18 kV·cm-1）可以改變蛋白原有構(gòu)象，螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生解折疊，造成鏈段結(jié)構(gòu)的波動(dòng)，表現(xiàn)出更高的分子柔性。研究結(jié)果闡明了PEF技術(shù)提高類(lèi)PSE雞肉蛋白凝膠特性及構(gòu)象修飾的機(jī)理，并為禽肉加工業(yè)解決異質(zhì)禽肉提供了一種新的解決方法。