MBF2轉(zhuǎn)錄調(diào)控小菜蛾谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶代謝氯蟲苯甲酰胺的功能

葛天成，尹飛，胡瓊波，彭爭科，李振宇

1廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640；2華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，廣州 510642

0 引言

【研究意義】小菜蛾（Plutella xylostella）屬鱗翅目（Lepidoptera）菜蛾科（Plutellidae），主要危害十字花科蔬菜，每年造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)7.7億美元，是抗藥性最強(qiáng)的世界性害蟲之一[1]。氯蟲苯甲酰胺（chlorantraniliprole）自 2008年[2]上市以來一直是防治小菜蛾的主要雙酰胺類藥劑[3]，每年全球銷售額超1.4億美元[4]。但該藥劑的連續(xù)使用使小菜蛾對其已產(chǎn)生嚴(yán)重抗性[5]，廣東地區(qū)抗性最高可達(dá)1 749.96倍[6]?？顾幮詸C(jī)理的闡明是抗性治理的基礎(chǔ)，針對小菜蛾抗藥性機(jī)理的研究主要集中在靶標(biāo)抗性和代謝抗性兩方面，其中代謝抗性在抗藥性產(chǎn)生的初期起主要作用，課題組前期研究表明谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）在小菜蛾對氯蟲苯甲酰胺抗性中起主要作用[7]，明確其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，將有助于小菜蛾的抗藥性治理及新藥劑的研發(fā)。【前人研究進(jìn)展】靶標(biāo)抗性與解毒酶活性的增加是小菜蛾抗性升高的主要原因[8]。氯蟲苯甲酰胺作用于小菜蛾魚尼丁受體，破壞細(xì)胞內(nèi)鈣離子釋放通道，G4946E為主要突變位點(diǎn)[9]。解毒酶活性升高是另一個主要原因，多種解毒酶參與到抗性升高過程中[10-11]。GST作為昆蟲體內(nèi)重要的解毒酶之一，已被證實(shí)參與到小菜蛾抗性發(fā)展的過程中[12]，在對氯蟲苯甲酰胺的抗性發(fā)展過程中更是起主要作用[13-14]。外源化合物可以誘導(dǎo)昆蟲解毒酶基因的表達(dá)水平升高，反式作用因子在其中起著非常重要的作用。ZHU等[15]研究證實(shí)GSTU1參與小菜蛾解毒過程，其反義轉(zhuǎn)錄本能從轉(zhuǎn)錄水平阻止GSTU1降解，增強(qiáng)小菜蛾抗性；王茹夢[16]研究發(fā)現(xiàn)PxCRBL2參與小菜蛾GST代謝茚蟲威的過程。目前，氯蟲苯甲酰胺誘導(dǎo)小菜蛾 GST共表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制尚不明確，從轉(zhuǎn)錄水平系統(tǒng)研究GST在抗性中的作用，有助于找到調(diào)控多個GST基因的途徑，從而為抗藥性研究提供新的靶標(biāo)基因。轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子MBF2（multiprotein bridging factor 2）是一個22 kD的糖蛋白轉(zhuǎn)錄激活因子，可以在轉(zhuǎn)錄過程中與轉(zhuǎn)錄起始因子TFIIA結(jié)合[17]，作為轉(zhuǎn)錄輔助因子來調(diào)控下游基因的表達(dá)[18]。少量研究表明其或其同源基因在昆蟲病毒免疫及抗逆性反應(yīng)中起作用[19-20]。研究較多的同源MBF1在植物抗熱脅迫等應(yīng)激反應(yīng)中起重要作用[21]；在哺乳動物中有調(diào)節(jié)類固醇激素的生成[22]、調(diào)節(jié)脂類代謝平衡的功能[23]；參與馬鈴薯青枯病抗性升高過程，在響應(yīng) ABA信號通路中發(fā)揮重要作用[24]。【本研究切入點(diǎn)】目前未見MBF家族基因參與昆蟲抗藥性發(fā)生的報(bào)道。前期在抗性/敏感小菜蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選到差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因MBF2，該基因?qū)ST的調(diào)控作用及其在小菜蛾抗氯蟲苯甲酰胺中的功能有待于進(jìn)一步明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】測定不同抗性小菜蛾種群GST活性，研究MBF2表達(dá)量與抗性水平的關(guān)系、氯蟲苯甲酰胺處理對MBF2表達(dá)量的影響以及MBF2對GST基因的調(diào)控作用，為解毒酶基因在轉(zhuǎn)錄水平上的研究提供新思路。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2021年3月至2022年6月在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所完成。

1.1 材料

1.1.1 供試蟲源 選定不同種植模式下的廣東連州（LZ）、云南通海（TH）及室內(nèi)敏感（SS）小菜蛾種群作為實(shí)驗(yàn)種群。LZ種群于2021年11月3日采自廣東省連州市龍坪監(jiān)測點(diǎn)；TH種群于 2019年2月26日采自云南省通海市監(jiān)測點(diǎn)飼養(yǎng)至今，隔代用LC25處理以保持小菜蛾的抗藥性水平。SS種群由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所提供，該種群為2014年采集于深圳市田間的幼蟲和蛹，之后用菜心苗（Brassica campestris）在室內(nèi)未接觸任何殺蟲劑條件下飼養(yǎng)至今。

1.1.2 藥劑及試劑 98.6%氯蟲苯甲酰胺原藥購自廣州進(jìn)展生物科技有限公司，使用二甲基亞砜DMSO和乳化劑配置成5%乳油。

細(xì)胞組織RNA快速提取試劑盒Easyspin RNA kit（Aidlab艾德萊生物）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒 TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA STHthesis SupperMix（Transgen全式金生物）；熒光定量預(yù)混試劑 2×RealStar Green Fast Mixture（Genstar康潤生物）；dsRNA合成試劑盒T7 RNAi Transcription Kit-BOX1（Vazyme諾唯贊生物）。

1.2 方法

1.2.1 不同小菜蛾種群對氯蟲苯甲酰胺的抗性及GST活性測定 采用浸葉法進(jìn)行不同小菜蛾種群抗性測定，測定方法、結(jié)果調(diào)查等均參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)“十字花科小菜蛾抗藥性監(jiān)測技術(shù)規(guī)程”（NY/T 2360—2013）進(jìn)行?？剐员稊?shù)（RR）=田間種群的LC50/敏感品系的LC50。其中，RR≤10為低水平抗性；10＜RR＜100為中等水平抗性；RR≥100為高水平抗性。GST活性測定參照梁沛等[25]的方法。

1.2.2 不同小菜蛾種群MBF2表達(dá)量測定 各種群總RNA提取按試劑盒說明書進(jìn)行，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行cDNA的合成，用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行RNA質(zhì)量檢測，Nanodrop2000微量紫外分光光度計(jì)測定濃度。

引物由北京擎科生物科技有限公司合成，以核糖體蛋白基因RPL32為內(nèi)參基因。采用CFX96實(shí)時熒光定量PCR儀系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），以SYBR Green I為染料，測定MBF2的相對表達(dá)量。反應(yīng)體系：2×RealStar Fast SYBR qPCR Mix 10 μL，cDNA 模板1 μg，上、下引物各0.5 μL，用 ddH2O補(bǔ)足至20 μL。RT-qPCR程序采用兩步法：95℃ 2 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)。每組3個生物學(xué)重復(fù)，統(tǒng)計(jì)分析時將敏感種群的表達(dá)量作為對照，設(shè)置為1。

1.2.3 氯蟲苯甲酰胺短時誘導(dǎo)小菜蛾后MBF2表達(dá)量變化 采用浸葉法，選用致死中濃度（LC50）氯蟲苯甲酰胺對LZ、TH和SS種群3齡幼蟲進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)后每2 h取15頭3齡早期小菜蛾幼蟲，取滿12 h，放入-80℃冰箱中。每5頭作為一個生物學(xué)重復(fù)，每組3個生物學(xué)重復(fù)。MBF2的相對表達(dá)量測定方法同1.2.2。統(tǒng)計(jì)分析時以同等濃度DMSO處理種群的表達(dá)量作為對照，計(jì)算時表達(dá)量設(shè)置為1。

1.2.4 基于RNAi的MBF2功能驗(yàn)證 根據(jù)MBF2序列信息，設(shè)計(jì)特異性上游引物（5′-TCTACACGAACCC TGGGAAC-3′），下游引物（5′-ACACCTGCACCTGGT ATGTG-3′），dsRNA合成引物在5′端加上T7啟動子 TAATACGACTCACTATAGGG，合成方法參照Vazyme T7 RNAi Transcription Kit-BOX1說明書。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測dsRNA完整性。選取LZ 3齡早期小菜蛾幼蟲，使用Nanoliter 2010微量注射泵，在小菜蛾第3腹足處注射，每頭注射300 ng dsRNA。以ddH2O、dsGFP（綠色熒光蛋白 green fluorescent protein）為對照，重復(fù)3次，干擾24 h后，使用RT-qPCR方法進(jìn)行相關(guān)表達(dá)量測定。參考YOU等[26]的小菜蛾基因組及課題組轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，篩選22個GST基因，設(shè)計(jì)檢測引物，驗(yàn)證引物擴(kuò)增效率介于 90%—110%。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)分析使用 IBM SPSS Statistics 23軟件ordinary one-way ANOVA檢驗(yàn)，熒光定量數(shù)據(jù)使用Bio-Rad CFX Manager計(jì)算相對表達(dá)量，GraphPad Prism 8.3作圖。

2 結(jié)果

2.1 不同小菜蛾種群對氯蟲苯甲酰胺的抗性水平

生物活性測定結(jié)果表明，通海（TH）小菜蛾種群對氯蟲苯甲酰胺抗性水平為中等抗性，其抗性倍數(shù)為54.27；連州（LZ）小菜蛾種群達(dá)到高抗性水平，其抗性倍數(shù)為289.58（表1）。

表1 氯蟲苯甲酰胺對3個小菜蛾種群的毒力Table 1 Toxicity of chlorantraniliprole on three P.xylostella populations

2.2 不同小菜蛾種群GST活性

3個小菜蛾種群GST活性存在顯著差異，GST活性隨著種群抗性倍數(shù)的增加而增加，LZ小菜蛾種群GST活性是SS種群的2.19倍，TH小菜蛾種群GST活性是SS種群的1.62倍（表2）。

表2 不同小菜蛾種群GST活性Table 2 GST activity of different P.xylostella populations

2.3 抗性與敏感小菜蛾種群中MBF2的表達(dá)量

MBF2在SS、TH和LZ 3個小菜蛾種群中的表達(dá)量呈梯度變化，TH和LZ小菜蛾種群表達(dá)量顯著高于SS種群，MBF2在TH種群小菜蛾體內(nèi)的表達(dá)量為SS種群的4.6倍，在LZ種群小菜蛾體內(nèi)的表達(dá)量為SS種群的9.4倍（圖1）。

圖1 MBF2在不同小菜蛾種群中的相對表達(dá)量Fig.1 Relative expression of MBF2 in different P.xylostella populations

2.4 氯蟲苯甲酰胺短時誘導(dǎo)后小菜蛾MBF2表達(dá)量變化

用LC50的氯蟲苯甲酰胺處理SS、LZ和TH 3個小菜蛾種群3齡幼蟲后，以相同濃度DMSO處理的3齡小菜蛾為對照，SS與TH種群處理6 h時，MBF2表達(dá)量達(dá)到最高，SS種群表達(dá)量達(dá)到4.94倍，TH種群達(dá)到7.02倍；LZ種群在8 h時表達(dá)量最高，為對照組的10.27倍；SS種群在12 h時與對照組無顯著差異，而另外兩個種群在12 h時仍顯示出一定的上調(diào)，且差異顯著（圖2）。

圖2 氯蟲苯甲酰胺誘導(dǎo)后不同小菜蛾種群MBF2表達(dá)變化Fig.2 Relative expression changes of MBF2 in different P.xylostella populations after chlorantraniliprole induction

2.5 MBF2與GST的關(guān)系

LZ種群注射dsMBF224 h后，與對照dsGFP組和注射 ddH2O處理組相比，沉默效率達(dá)到 70%（圖3-A）。檢測22個GST基因的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，dsMBF2組小菜蛾體內(nèi)多個GST基因表達(dá)出現(xiàn)顯著下調(diào)，GSTD2、GSTD5、GSTE1、GSTE5、GSTO1、GSTO5、GSTT1、GSTU1及GSTZ1下調(diào)量均超過50%，GSTU1和GSTZ1效果最為顯著，下調(diào)量90%以上（圖3-B）。

圖3 MBF2沉默效率（A）及沉默后GST基因表達(dá)量（B）Fig.3 MBF2 knocking down efficiency (A) and GST genes expression level after knocking down (B)

LZ小菜蛾種群沉默MBF2后，GST活性檢測發(fā)現(xiàn)，dsGFP組、注射ddH2O及dsMBF2組酶活性分別為 42.21、32.65 和 17.83 nmol·min-1·mg-1，dsMBF2處理組GST活性顯著低于對照組，與dsGFP對照組相比活性降低57.76%（圖4）。

圖4 RNAi后小菜蛾3齡幼蟲GST活性Fig.4 GST activity of the 3rd instar larvae of P.xylostella after RNAi

dsMBF2處理小菜蛾3齡幼蟲24 h，使用75 mg·L-1氯蟲苯甲酰胺對MBF2沉默后的小菜蛾進(jìn)行毒力測定，結(jié)果如圖5所示，dsMBF2處理組小菜蛾死亡率顯著高于對照組，處理組小菜蛾死亡率為56.67%，比對照組死亡率高23.34%。

圖5 RNAi后小菜蛾對氯蟲苯甲酰胺脅迫的敏感性Fig.5 Sensitivity of P.xylostella after RNAi to chlorantraniliprole stress

3 討論

3.1 GST在小菜蛾對氯蟲苯甲酰胺的抗藥性中起重要作用

害蟲抗性升高主要是由于解毒酶活性升高、靶標(biāo)位點(diǎn)敏感性降低以及表皮穿透性降低導(dǎo)致[27]。在解毒酶領(lǐng)域研究較多的主要有細(xì)胞色素酶（P450）、羧酸酯酶（CarE）及谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST），三者被認(rèn)為與抗藥性有密不可分的關(guān)系。GST在昆蟲第二階段解毒過程中起到了關(guān)鍵作用[28-29]，LIU等[30]利用氯蟲苯甲酰胺誘導(dǎo)菜粉蝶（Pieris rapae）后，9個GST基因上調(diào)，推測其參與了菜粉蝶抗氯蟲苯甲酰胺的過程；飛蝗（Locusta migratoria）抗氯蟲苯甲酰胺過程中GST活性顯著提升[31]；課題組前期利用RNAi技術(shù)證實(shí)了PxGST2L在小菜蛾抗氯蟲苯甲酰胺過程中起重要作用[7]。本研究結(jié)果亦表明GST在小菜蛾抗藥性中起重要作用，對選取的3個小菜蛾種群進(jìn)行GST活性測定，發(fā)現(xiàn)隨著抗性的升高，GST活性不斷升高，而GSTD2、GSTD5、GSTE1等多個基因下調(diào)表達(dá)，致使 GST活性降低，小菜蛾對氯蟲苯甲酰胺的敏感性上升，表明GST與小菜蛾對氯蟲苯甲酰胺抗性有密不可分的關(guān)系且多個 GST基因共表達(dá)調(diào)控，結(jié)果與HU等[32]研究結(jié)果相一致。

3.2 MBF2通過調(diào)控GST的表達(dá)參與抗性發(fā)展

外源化合物可以誘導(dǎo)昆蟲解毒酶基因的表達(dá)水平升高，反式作用因子在其中起著非常重要的作用。在轉(zhuǎn)錄過程中，反式調(diào)控因子和順式作用元件的變化均會導(dǎo)致下游轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)量改變。在反式調(diào)控因子即轉(zhuǎn)錄因子的研究中，Nrf2（nuclear factor erythroid-derived 2-related factor 2）被多次證實(shí)參與解毒酶基因上調(diào)的過程。MISRA等使用苯巴比妥刺激果蠅（Drosophila melanogaster），發(fā)現(xiàn)GST解毒酶基因通過Nrf2/Keap1轉(zhuǎn)錄途徑顯著上調(diào)[33]。CHEN在2018年證明活性氧（ROS）可通過誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子Nrf2與啟動子結(jié)合的方式使GSTE1過量表達(dá)[34]。在昆蟲體內(nèi)，Nrf2 的直系同源物 CncC（cap “n” collar isoform C）是GST、P450等解毒酶的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[35-37]。以往研究已明確，在家蠶（Bombyx mori）、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）及斜紋夜蛾（S.litura）中，CncC對于GSTE3、GSTD1、GSTT1、GSTE6有調(diào)控作用[38-41]。轉(zhuǎn)錄激活因子MBF家族基因在昆蟲免疫和抗逆性中起重要作用，在果蠅中可調(diào)節(jié)與代謝相關(guān)的基因來參與冷脅迫，周春燕使用黑胸?cái)⊙挎邨U菌（Bacillus bombyseptieus）處理家蠶后，MBF2被誘導(dǎo)上調(diào)，說明MBF2參與到家蠶的免疫過程中[42]。在植物中，MBF家族基因可作為正向調(diào)節(jié)子協(xié)同有關(guān)信號分子和抗性標(biāo)志基因參與馬鈴薯青枯病抗性[24]。本研究結(jié)果表明，MBF2參與小菜蛾對氯蟲苯甲酰胺的抗性。致死中濃度（LC50）氯蟲苯甲酰胺誘導(dǎo)小菜蛾，在 1—8 h內(nèi)MBF2表達(dá)量顯著提高。同時，沉默MBF2后多個GST表達(dá)量顯著下調(diào)，GST活性也下降，而在沉默MBF2后，抗性種群對于氯蟲苯甲酰胺的敏感性升高，同等濃度下較對照組死亡率顯著上升23.34%。研究結(jié)果說明MBF2直接或間接參與了小菜蛾GST抗氯蟲苯甲酰胺的解毒過程，但是其調(diào)控通路需進(jìn)一步明確。

3.3 MBF2調(diào)控通路預(yù)測

過往研究中，MBF2與轉(zhuǎn)錄起始因子TFIIA結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體的一部分[43]，經(jīng)由轉(zhuǎn)錄因子再去調(diào)控下游基因的表達(dá)。筆者在MBF2上游200 bp的轉(zhuǎn)錄啟動子區(qū)域預(yù)測到了與CncC結(jié)合的位點(diǎn)信息。推測該轉(zhuǎn)錄調(diào)控完整通路是MBF2結(jié)合 CncC/Maf-s的轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體TFIIA，激活CncC/Maf-s轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控或上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平，由CncC/Maf-s來調(diào)控GST的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而三者形成一個抗性響應(yīng)過程。

4 結(jié)論

小菜蛾在受到氯蟲苯甲酰胺的毒性脅迫時，可能通過過表達(dá)轉(zhuǎn)錄激活因子MBF2，從轉(zhuǎn)錄水平直接或間接地調(diào)控GST基因大量表達(dá)，從而提高小菜蛾對氯蟲苯甲酰胺的代謝能力，進(jìn)而提高小菜蛾對氯蟲苯甲酰的抗性。