抗人類腸道病毒71藥物及疫苗研究進(jìn)展*

謝小暉，陳路路，李超英，鄭惠丹，張 怡，陶 玲 綜述，徐銀蘭△審校

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院外語學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

人類腸道病毒71(EV71)屬腸道微生物群，是微小病毒科，歸屬于人類腸道病毒A。在腸道毒菌群中，EV71是迄今發(fā)現(xiàn)最晚的腸道病毒，主要引起5歲以下嬰幼兒神經(jīng)系統(tǒng)疾病，感染力強(qiáng)且致病率極高[1]。部分患者可出現(xiàn)腦水腫、腦炎、腦脊髓炎、循環(huán)衰竭等較為嚴(yán)重的腦部疾病。1981年在我國上海發(fā)現(xiàn)該病毒，1987年EV71在香港流行，于2008年1月至2019年6月中國疾病預(yù)防控制中心建立的手足口病監(jiān)測系統(tǒng)報告了2 254萬例手足口病病例，導(dǎo)致3 704例患者死亡[2]。

目前，據(jù)文獻(xiàn)報道，EV71已有6種基因型，在中國流行的主要是A、B、C型。EV71為二十面體立體結(jié)構(gòu)的單股正鏈RNA病毒，無包膜和突起球形結(jié)構(gòu)，直徑為24～30 nm，基因組大小為7.4 kb。腸道病毒EV71的復(fù)制周期包括吸附、進(jìn)入、脫殼、蛋白翻譯、多聚蛋白加工、基因組RNA復(fù)制及病毒組裝和釋放?，F(xiàn)將目前EV71的治療與預(yù)防研究現(xiàn)狀綜述如下。

1 抗EV71藥物研究進(jìn)展

1.1抑制病毒復(fù)制過程 利巴韋林屬于人工合成的核苷類廣譜抗病毒藥物，作用位點為病毒核糖核酸聚合酶。利巴韋林可對次黃嘌呤脫氫酶產(chǎn)生抑制作用，加速細(xì)胞內(nèi)三磷酸鳥苷庫的消耗，使細(xì)胞內(nèi)能量調(diào)控異常，直接對病毒翻譯起始及肽鏈延伸階段產(chǎn)生影響，抑制病毒核酸復(fù)制過程，與喜炎平聯(lián)用可提高小兒手足口病治愈率，減輕臨床癥狀，降低不良反應(yīng)發(fā)生率[3]。然而利巴韋林的大量使用，導(dǎo)致藥物不良反應(yīng)發(fā)生率上升，臨床表現(xiàn)多種多樣，其中藥物不良反應(yīng)常見表現(xiàn)有惡心、嘔吐、胸悶和瘙癢，目前已停止使用。瑞德西韋(RDV)是一種腺苷小分子類化合物，發(fā)揮抗病毒效果的形式為磷酸化的三磷酸，通過抑制病毒中RNA依賴性的RNA聚合酶活性從而發(fā)揮作用[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，RDV可以識別并與一些病毒的RNA轉(zhuǎn)錄酶相作用，顯著降低小鼠橫紋肌肉瘤中的病毒載量[5]。藥物發(fā)揮作用也能通過阻斷EV71復(fù)制過程中的絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路來實現(xiàn)，WANG等[6]發(fā)現(xiàn)的延胡索堿在一定濃度范圍內(nèi)可抑制p38-MAPK和c-Jun氨基末端激酶(JNK)-MAPK信號通路，造成環(huán)加氧酶2表達(dá)量發(fā)生變化，進(jìn)而發(fā)揮抗EV71感染的作用。3D蛋白酶又稱為依賴于RNA的RNA聚合酶，是EV71基因組復(fù)制的關(guān)鍵酶。2′-脫氧-2′-β-氟-4′-疊氮胞苷是一種小核苷類似物抑制劑，通過靶向競爭EV71 3D蛋白酶抑制EV71的復(fù)制及RNA的合成，體外抗病毒活性顯著。每2天用1 mg/kg劑量進(jìn)行1次2′-脫氧-2′-β-氟-4′-疊氮胞苷治療可顯著增強(qiáng)小鼠對EV71的抵抗力，降低小鼠組織中EV71載量，對小鼠起到很好的保護(hù)作用[7]。

1.2抑制病毒翻譯過程 EV71的翻譯過程依靠內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(IRES)，其是病毒翻譯過程中的關(guān)鍵位點，黃酮類化合物山萘酚能抑制病毒依賴的IRES的翻譯過程，降低IRES水平發(fā)揮抗病毒作用。作為一種黃病毒抑制劑，腺苷類似物NITD008能阻斷病毒RNA的合成，具有強(qiáng)大的抗EV71作用。NITD008在體外對幾種杯狀病毒表現(xiàn)出低毒性，低濃度即可產(chǎn)生較強(qiáng)的抗病毒活性，該化合物作為治療開發(fā)的支架將具有相當(dāng)大的益處，具有廣泛的應(yīng)用前景[8]。

1.3抑制EV71多聚蛋白關(guān)鍵酶 3C蛋白酶是EV71結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵酶，首先EV71基因組會翻譯出多聚蛋白，3C蛋白酶需要對合成后的多聚蛋白進(jìn)一步切割加工，使多聚蛋白成為更小的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，同時，其還可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并幫助EV71逃避宿主免疫系統(tǒng)的追殺。槲皮素是一種類黃酮化合物，對多種病毒具有抗病毒活性，槲皮素可使EV71 3C蛋白酶活性降低，同時，不影響其他關(guān)鍵酶的活性。YAO等[9]研究表明，在橫紋肌肉瘤和Vero細(xì)胞中槲皮素會出現(xiàn)低細(xì)胞毒性，50%組織細(xì)胞感染量大于200 μm，與利巴韋林比較，槲皮素有更好的抗EV71活性和更低的細(xì)胞毒性作用。EV71 3C蛋白酶抑制劑——NK-1.8k是近年來研發(fā)的抗EV71藥物，EV71 3C蛋白酶結(jié)構(gòu)是一種開放性構(gòu)象，與其他小RNA病毒的結(jié)構(gòu)有所差異。NK-1.8 k與EV71 3C蛋白酶中的活性位點發(fā)生反應(yīng)，使3C蛋白酶無法發(fā)揮其功能，能較好地抑制EV71活性，抗EV71效果顯著[10]。EV71 2A蛋白酶主要參與多蛋白的加工、抑制宿主蛋白合成、逃避先天免疫和誘導(dǎo)細(xì)胞死亡等，以目標(biāo)2A蛋白基因為目標(biāo)序列合成的小干擾RNA(SiRNA)可專一地作用于2A蛋白酶，進(jìn)而產(chǎn)生抗EV71的作用。當(dāng)SiRNA濃度為60 nm時能讓EV71感染細(xì)胞達(dá)到最高的轉(zhuǎn)染效率，用SiRNA-2Apro處理后病毒蛋白含量和RNA含量均會明顯低于對照組[11]。

1.4抑制病毒脫衣殼 EV71 VP1蛋白是其關(guān)鍵蛋白，具有EV71標(biāo)志物的作用，抗原識別位點也于此處。普可那利是一種廣譜抗腸道病毒和鼻病毒藥品，作為病毒衣殼結(jié)合劑能與VP1蛋白結(jié)合，抑制其構(gòu)象的改變及EV71進(jìn)入宿主細(xì)胞的過程，但存在很大的安全性問題。LI等[12]基于普可那利的母核設(shè)計出的DBPR103安全濃度較高。靈芝的活性成分有很多，如有機(jī)酸、氨基酸等，其主要活性成分為靈芝三萜。靈芝三萜類化合物可與EV71顆粒相互作用，阻斷EV71的吸附過程，破壞病毒的脫衣殼過程。

1.5抑制病毒的吸附和穿入 兩性霉素B與附著物相作用，抑制EV71在細(xì)胞中的內(nèi)化過程，清道夫受體Ⅱ是EV71的細(xì)胞受體，能感染人體細(xì)胞，在病毒的早期感染中發(fā)揮關(guān)鍵作用。JIN等[13]構(gòu)建的EV71小鼠模型中小鼠腦組織和脊髓在病毒感染后7 d呈現(xiàn)出局灶性變化，神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞的變性增生，炎性反應(yīng)強(qiáng)烈。ZHANG等[14]構(gòu)建了一種抗人類清道夫受體2(SCARB2)的單克隆抗體，稱為JL2。JL2單克隆抗體對EV71的感染具有抑制作用，通過3個螺旋α2、α5、α14與人類SCARB2 結(jié)合，抑制EV71的吸附與穿入過程。阿卡波糖作為一種潛在的藥物，可有效阻斷EV71從腸道向全身的動態(tài)轉(zhuǎn)移，F(xiàn)ENG等[15]研究表明，小腸被證實是EV71感染部位，回腸是EV71在小鼠體內(nèi)增殖和運輸部位，阿卡波糖通過抑制EV71與細(xì)胞表面受體的結(jié)合發(fā)揮抗EV71作用。

1.6天然化合物 傳統(tǒng)中草藥價格低廉，易于獲得，便于培植，還具有廣譜抗病毒優(yōu)點。很多中藥單體均是天然化合物，抗EV71作用較好。使用中草藥發(fā)揮抗病毒的效果將會是一個廣泛的應(yīng)用前景。開發(fā)和研究傳統(tǒng)中草藥抗EV71作用具有重要的臨床實用意義。

1.6.1姜黃素 姜黃素是姜黃的主要活性成分，具有許多方面的作用，如抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗纖維化等，還擁有較為廣泛的抗病毒活性。姜黃素廣泛使用在臨床中醫(yī)藥治療中，由于具有抗氧化等特性，在抗感染、抗腫瘤、抗病毒感染中發(fā)揮作用[16]。姜黃素具有顯著的抗病毒效應(yīng)，可抑制豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)誘導(dǎo)的線粒體凋亡，降低細(xì)胞凋亡率，緩解PCV2誘導(dǎo)的線粒體凋亡[17]。姜黃素不調(diào)節(jié)EV71的吸附與內(nèi)化過程，僅可以對EV71的復(fù)制具有抑制作用，與α干擾素(IFN-α)聯(lián)用可顯著增強(qiáng)IFN-α的抗EV71活性。有研究發(fā)現(xiàn)，EV71會降低SH-SY5Y細(xì)胞中I型干擾素受體水平，姜黃素通過抑制SH-SY5Y細(xì)胞中干擾素受體水平的降低增強(qiáng)IFN-α的抗EV71活性[18]。

1.6.2苦參堿 苦參始于神農(nóng)本草經(jīng)，含有多種化學(xué)成分，其主要成分為苦參堿和氧化苦參堿。在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的觀點中苦參具有多種藥理學(xué)作用，如清熱燥濕、利尿、殺蟲等作用，現(xiàn)代研究表明，苦參除以上作用外，還可改善心律失常，以及抗病毒、抗瘤等作用[19]?？鄥A對EV71具有預(yù)防作用，安全范圍較好，較低濃度可預(yù)防EV71感染，并且能對EV71的活性有很好的抑制作用。XU等[20]研究表明，苦參堿與蛇床子素聯(lián)合使用可通過降低PCV2降解物激活蛋白的表達(dá)共同抑制PCV2導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。

1.6.3莪術(shù)醇 莪術(shù)醇是從莪術(shù)根中提取的一種天然化合物，莪術(shù)醇具有多種生物學(xué)活性，已用于治療心肌炎，且可用于抑制腦心肌炎病毒活性。有研究發(fā)現(xiàn)，與利巴韋林陽性對照組比較，莪術(shù)醇抑制率明顯高于利巴韋林，安全濃度較高。莪術(shù)醇可增加T淋巴細(xì)胞內(nèi)IFN-β蛋白的表達(dá)，從而對腦心肌炎病毒的活性產(chǎn)生抑制作用[21]。

1.6.4黃芩苷 黃芩苷是黃芩的主要活性成分之一，具有優(yōu)秀的抗炎作用，還可調(diào)整線粒體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑，使活化的T、B淋巴細(xì)胞加速凋亡。黃芩苷對腦心肌炎病毒的最大抑制率高于利巴韋林，同時，選擇性指數(shù)低于陽性對照組，說明黃芩苷具有良好的抗病毒活性[22]。

1.6.5片仔癀 片仔癀具有顯著的抗病毒、抗腫瘤作用，在抗EV71體外感染過程中可有效抑制多種EV71毒株的活性，抑制病毒綠色熒光蛋白質(zhì)的表達(dá)，降低EV71的感染能力[23]。在病毒吸附前使用槐啶堿可增加細(xì)胞對EV71的抵抗力。

1.6.6金銀花 喂食金銀花提取物或接種micoRNA-let-7a的EV71感染的吸吮小鼠，表現(xiàn)出臨床評分降低和存活時間延長等特點，伴有病毒RNA、蛋白表達(dá)和病毒滴度降低[24]，表明金銀花水提取物可抑制EV71在體內(nèi)、外的復(fù)制。

1.7抗氧化物 氧化應(yīng)激可增強(qiáng)病毒復(fù)制能力，EV71感染會誘導(dǎo)宿主細(xì)胞氧化應(yīng)激能力的提升，從而增強(qiáng)病毒的侵襲能力，故抑制機(jī)體氧化應(yīng)激可抑制EV71的感染。

1.7.1薄荷 薄荷可清熱解毒，同時，具有藥理作用廣、毒性低、成本低廉等優(yōu)點，因此，薄荷的應(yīng)用價值是多種多樣的。薄荷的成分眾多復(fù)雜，具有抗氧化作用，其普列薄荷成分具有廣泛的抗癌作用[25]。

1.7.2靈芝類 近年來，以二氧化碳超臨界萃取法制備的靈芝孢子油作為一種新型產(chǎn)品而出現(xiàn)，具有抗腦缺血再灌注損傷和抗氧化、清除自由基等功效，作為靈芝主要活性成分的靈芝三萜是從靈芝菌絲中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，具有抗病毒、抗癌活性。

1.7.3蘆丁 蘆丁是一種類黃酮類化合物，廣泛分布于各種常見物質(zhì)中，如水果、蔬菜等，具有一系列廣泛的作用，如抗氧化、抗病毒、抗癌等[26]。蘆丁衍生物的藥理活性很多，MECENAS等[27]合成的蘆丁乙酸酯具有很好的抗氧化性，可降低感染細(xì)胞的氧化應(yīng)激能力和活性氧含量，且對哺乳動物無毒。

1.7.4漆黃素 漆黃素是一種較常見的類黃酮多酚物質(zhì)，廣泛分布于水果、黃櫨、蔬菜和漆樹中。漆黃素分子結(jié)構(gòu)中存在自由的羥基和羰基具有良好的抗氧化作用，可通過多酚氧化酶發(fā)揮自由基清除作用，也可抑制活性氧生成，保護(hù)細(xì)胞[28]。

1.8細(xì)胞因子 腫瘤壞死因子-α是一種功能強(qiáng)大的細(xì)胞因子，在免疫活動中具有強(qiáng)大的適應(yīng)性，促炎細(xì)胞因子——腫瘤壞死因子-β參與了多種炎癥、抗病毒和免疫刺激反應(yīng)。白細(xì)胞介素-4由先天淋巴細(xì)胞如自然殺傷T細(xì)胞和髓樣細(xì)胞(如嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞)產(chǎn)生，是2型免疫反應(yīng)的標(biāo)志性細(xì)胞因子，也具有非免疫功能[29]。

2 疫苗研究進(jìn)展

防控EV71最有效的措施還是注射疫苗，抗EV71的疫苗主要包括以下幾種。

2.1減毒活疫苗 減毒活疫苗是將完整病原體進(jìn)行活疫苗的減毒，可誘導(dǎo)細(xì)胞免疫及體液免疫，給機(jī)體帶來更長久的保護(hù)，但存在多種安全性問題。

2.2滅活疫苗 滅活疫苗是將病原體滅活得到的疫苗，相比于減毒活疫苗，不良反應(yīng)較小，產(chǎn)生抗體的能力強(qiáng)，有效性和安全性較好。2015年我國成功研制出EV71全病毒滅活疫苗，并于2016年開始投入使用[30]，在后期的臨床調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，被觀察者體內(nèi)干擾素、白細(xì)胞介素、免疫球蛋白G等水平均得到上調(diào)，疫苗的保護(hù)周期長、安全性高、免疫原性強(qiáng)[31]。FAN等[32]研發(fā)的二價滅活EV71/柯薩奇病毒A16型(CA16)疫苗可使小鼠體內(nèi)免疫相關(guān)趨化因子表達(dá)上調(diào)，可提高小鼠對EV71、CA16感染的有效免疫力。

2.3病毒樣顆粒(VLP)疫苗 YANG等[33]在畢赤酵母中制備了EV71 VLP疫苗，當(dāng)EV71 VLP為每劑1～5 μg、佐劑為每劑225 μg時可引發(fā)強(qiáng)大的保護(hù)性中和抗體反應(yīng)，并針對小鼠提供強(qiáng)有力免疫屏障。WANG等[34]發(fā)現(xiàn)，接種在皮基亞牧羊犬中產(chǎn)生的重組EV71樣顆粒疫苗小鼠的免疫血清也表現(xiàn)出對EV71異源亞型的交叉中和活性。LUO等[35]制備的EV71 VLP及其嵌合體疫苗可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，保護(hù)小鼠抵抗致死性EV71、CA16感染。

3 小 結(jié)

預(yù)防EV71感染，疫苗防控仍是目前的主流手段，但安全性問題較多，保護(hù)效果不佳，存在毒力恢復(fù)等安全性問題，且大多數(shù)疫苗均是針對的EV71 C4亞型，加之目前尚無特效藥品治療EV71感染，現(xiàn)在使用的藥物多少均存在著一些不良反應(yīng)，有些藥物還容易引起病毒的耐藥性，開發(fā)新的、不良反應(yīng)少的抗EV71藥物迫在眉睫。傳統(tǒng)中草藥具有價格低廉、易于獲得、便于培植、廣譜抗病毒等許多優(yōu)點。天然化合物的聯(lián)合使用可減少病毒耐藥性的產(chǎn)生，還可減少藥物用量，可能成為新的抗EV71的研究方向。