新型聚合物納米造影劑的合成及體內(nèi)磁共振成像研究

孫天賜, 楊 懷, 閆 旭, 方蔚偉, 張培松, 何 濤

(1.合肥工業(yè)大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院,安徽 合肥 230009; 2.武警安徽省總隊(duì)醫(yī)院 普外三科,安徽 合肥 230061)

磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)無(wú)輻射、安全性高、軟組織分辨能力較強(qiáng),在臨床影像醫(yī)學(xué)腫瘤檢測(cè)上應(yīng)用廣泛[1]。MRI通常需要使用造影劑(contrast agent)進(jìn)行高分辨的影像學(xué)診斷[2]。臨床上一般用低分子量的釓(Gd)類鰲合物造影劑來(lái)提升磁共振信號(hào),如Magnevist、Omniscan等,但這些造影劑具有體內(nèi)循環(huán)時(shí)間短、弛豫率低、用藥量大等缺點(diǎn)[3-5]。近年來(lái),為了克服現(xiàn)有造影劑的缺點(diǎn),納米技術(shù)被廣泛應(yīng)用于MRI造影劑的研究中,相關(guān)研究表明尺寸小于20 nm的納米造影劑具有較低的細(xì)胞攝取水平以及更長(zhǎng)的體內(nèi)滯留時(shí)間[6-7]。兩親性聚合物納米顆粒是良好的藥物傳遞載體,將釓融入聚合物納米中制備的納米造影劑有良好的弛豫性能[8]。兩親性聚合物納米顆粒一般基于樹(shù)枝狀聚合物、星狀聚合物等結(jié)構(gòu),或者是由兩親性共聚物自組裝得到[9]。但是樹(shù)枝狀聚合物、星狀聚合物納米合成步驟繁瑣,提純困難[10];由兩親性共聚物自組裝得到的聚合物納米結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定[11]。因此,制備合成過(guò)程簡(jiǎn)單、無(wú)需自組裝的兩親性聚合物納米載體具有重要的科研和利用價(jià)值。

本文直接合成不需要自組裝的兩親性支化共聚物納米顆粒,并用于合成納米造影劑。采用可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合(reversible addition-fragmentation chain transfer polymerization,RAFT)方法,以疏水性單體甲基丙烯酸正丁酯(n-BMA)與交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)共聚物鏈段作為疏水性內(nèi)核,親水性單體寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯(OEGMA)與含1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7-三乙酸三叔丁酯(DO3A)結(jié)構(gòu)的單體共聚物鏈段作為親水性支鏈形成兩親性支化聚合物納米顆粒(P(DO3A)),與氯化釓(Ⅲ)六水合物(GdCl3·6H2O)進(jìn)行螯合反應(yīng)后合成了一種新型的MRI納米造影劑P(DO3A-Gd3+);研究了P(DO3A-Gd3+)生物安全性以及MRI造影性能,結(jié)果表明:P(DO3A-Gd3+)具有良好的生物安全性以及顯著的MRI造影增強(qiáng)效果;P(DO3A-Gd3+)納米顆粒由單個(gè)支化聚合物納米顆粒P(DO3A)螯合Gd3+構(gòu)成,無(wú)需自組裝,合成方法簡(jiǎn)單,可大量制備,有臨床轉(zhuǎn)化的潛力。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑與儀器

4-氰基-4-(苯基碳硫硫基硫代)戊酸N-琥珀酰亞胺酯(CTA-NHS)購(gòu)于Aldrich;寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯(OEGMA,Mw為300)、甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)、溴乙酸(BA)、甲基丙烯酸正丁酯(n-BMA)、1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7-三乙酸叔丁醇乙酯(TBTT)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)，均購(gòu)于Aladdin;三氟乙酸(TFA)、氯化釓(Ⅲ)六水合物(GdCl3·6H2O)、二氯甲烷(DCM)、乙腈、甲醇、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)。

采用安捷倫VNMR S600型核磁共振儀進(jìn)行核磁共振氫譜(1H nuclear magnetic resonance,1H NMR)測(cè)試;采用馬爾文MS-2000型激光粒度分析儀進(jìn)行動(dòng)態(tài)光散射(dynamic light scaltering,DLS)測(cè)試;采用日本JEM-2100F型場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡(field emission transmission electron microscope,FETEM)分析樣品形貌結(jié)構(gòu)。

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.2.1 聚合物納米造影劑的合成

聚合物納米造影劑的合成過(guò)程如圖1所示。

圖1 聚合物納米造影劑的合成過(guò)程

將HEMA(1 mmol/L)與BA(1.5 mmol/L)溶解在20 mL DCM中,反應(yīng)24 h,通過(guò)純化得到產(chǎn)物HEMA-BA。將HEMA-BA(1 mmol/L)與TBTT(1 mmol/L)溶解在20 mL 乙腈中,反應(yīng)24 h,通過(guò)純化得到產(chǎn)物HEMA-TBTT。

鏈轉(zhuǎn)移劑CTA-NHS(0.1 mmol/L),單體OEGMA(1 mmol/L)、HEMA-TBTT(0.5 mmol/L),引發(fā)劑AIBN(0.01 mmol/L)在反應(yīng)管中溶解于3 mL DMF,隨后在無(wú)氧條件下70 ℃反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后,減壓除去溶劑,粗產(chǎn)物在甲醇中沉降3次,干燥得到共聚物P1(POEGMA-HEMA-TBTT)。

將P1(0.8 g,1 mmol/L),單體n-BMA(10 mmol/L),引發(fā)劑AIBN(0.01 mmol/L),交聯(lián)劑EDGMA(0.15 mmol/L)溶解于4 mL DMF中,液氮冷凍脫氣,70 ℃下反應(yīng)10 h。反應(yīng)結(jié)束后,減壓除去溶劑,粗產(chǎn)物在甲醇中沉降3次,干燥得到支化共聚物納米顆粒P2(PEGDMA-n-BMA-OEGMA-HEMA-TBTT)。

上述支化聚合物P2(2.00 g)與TFA(10 mL)溶解在20 mL DCM中,0 ℃下反應(yīng)4 h,切斷HEMA-TBTT鏈段中的叔丁基。反應(yīng)結(jié)束后,粗產(chǎn)物去除溶劑,用5 mL THF復(fù)溶,隨后在冰的正己烷中沉降,真空干燥后得到產(chǎn)物P3(PEGDMA-n-BMA-OEGMA-HEMA-DO3A)，簡(jiǎn)稱P(DO3A)。

將P3(1 g)溶解在15 mL 異丙醇中,將GdCl3·6H2O(1.86 g,5 mmol)溶解在50 mL 乙酸銨中后與上述溶液混合,55 ℃下反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后,混合溶液在水中透析48 h,干燥后用THF復(fù)溶,隨后在冰的正己烷中沉降,真空干燥后得到納米造影劑P4(P(DO3A-Gd3+))。

1.2.2 細(xì)胞安全性測(cè)試

細(xì)胞安全性的測(cè)試采用標(biāo)準(zhǔn)的3-(4,5二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法[12]。將小鼠乳腺癌細(xì)胞(4T1)以5×104個(gè)/孔接種于含有細(xì)胞培養(yǎng)基的96孔板中,然后加入不同濃度Gd3+的P(DO3A-Gd3+),在37 ℃、5% CO2環(huán)境下共培養(yǎng)24 h。采用PBS洗滌細(xì)胞3次,再在每個(gè)孔板中加入50 μL MTT(1 mg/mL),于37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。接著去除上清液,加入100 μL二甲亞砜后搖勻,用分光光度酶標(biāo)儀(Elx800,BioTek,USA)測(cè)定570 nm處的吸光度,相對(duì)細(xì)胞活性計(jì)算公式為:

相對(duì)細(xì)胞活性=(Atreated/Acontrol)×100%,

其中:Atreated為P(DO3A-Gd3+)共培養(yǎng)后的吸光度;Acontrol為培養(yǎng)液的吸光度值。

1.2.3 生物安全性測(cè)試

將10只新西蘭小鼠(雄性,24 g)分為2組:一組通過(guò)尾靜脈注射P(DO3A-Gd3+)作為實(shí)驗(yàn)組;另一組不做任何處理作為對(duì)照組。將2組小鼠在相同的環(huán)境下培育14 d,通過(guò)觀察2組小鼠的生理狀況來(lái)評(píng)估P(DO3A-Gd3+)的生物安全性。

1.2.4 體外弛豫率的測(cè)定

將P(DO3A-Gd3+)溶液以及Magnevist注射液各稀釋至含Gd3+濃度為0.025、0.050、0.100、0.200、0.400、0.800 mmol/L的水溶液,移至離心管中并置于臨床Siemens Magnetom Trio 3.0T MR成像儀中掃描,測(cè)得不同濃度的縱向弛豫時(shí)間T1,儀器參數(shù)為:回波時(shí)間TE為7 ms;重復(fù)時(shí)間TR為31、300、700、1 400、2 500、3 500、5 500、7 500 ms。弛豫率r1由縱向弛豫時(shí)間T1的倒數(shù)對(duì)Gd3+濃度進(jìn)行線性擬合得到。

1.2.5 體內(nèi)MRI測(cè)試

用10%的水合氯醛麻醉25 g的小鼠后,尾靜脈注射P(DO3A-Gd3+)水溶液(Gd約0.05 mmol/kg),置于臨床Siemens Magnetom Trio 3.0T MR成像儀中掃描。分別收集0、60、120 min時(shí)的T1加權(quán)圖像。

2 結(jié)果與討論

2.1 P(DO3A)的合成

聚合物納米P(DO3A)的1HNMR譜圖如圖2所示。

從圖2可以看出,P2鏈段中各單體的主要?dú)滟|(zhì)子的化學(xué)位移有δ=1.38處表示HEMA-TBTT鏈段上叔丁基的質(zhì)子峰;δ=0.93處表示聚合物主鏈上甲基的質(zhì)子峰;δ=1.80處表示聚合物主鏈上亞甲基的質(zhì)子峰;δ=3.64、3.53處表示POEGMA鏈段上亞甲基的質(zhì)子峰;δ=3.64處歸屬于POEGMA鏈段上末端甲基的質(zhì)子峰;δ=3.92,1.59,1.31處表示n-BMA鏈段上亞甲基的質(zhì)子峰;δ=0.85處為n-BMA鏈段末端甲基的質(zhì)子峰,表明聚合物納米P(DO3A)的成功合成。

圖2 聚合物納米P(DO3A)的1H NMR譜圖

2.2 P(DO3A-Gd3+)的形貌和尺寸分析

對(duì)鰲合釓后的P(DO3A-Gd3+)納米顆粒水溶液進(jìn)行形貌和尺寸分析,如圖3所示。

圖3 P(DO3A-Gd3+)納米顆粒水溶液形貌和尺寸

從圖3a可以看出,納米顆粒的尺寸在100 nm左右,呈單分散狀態(tài)且形貌比較均一。從圖3b可以看出,納米顆粒的尺寸在110 nm左右,且分布均勻。一個(gè)P(DO3A-Gd3+)納米顆粒由單個(gè)超支化聚合物納米顆粒P(DO3A)螯合若干Gd3+構(gòu)成,無(wú)需自組裝,因此呈單分散狀態(tài)且形貌比較均一。Gd3+能穩(wěn)定鰲合在納米顆粒內(nèi)部,不易泄露,因此相對(duì)于小分子造影劑,P(DO3A-Gd3+)具有更好的穩(wěn)定性。均一的納米尺寸能夠提高P(DO3A-Gd3+)的細(xì)胞攝取性,延長(zhǎng)其在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間。

2.3 P(DO3A-Gd3+)的安全性分析

P(DO3A-Gd3+)的細(xì)胞安全性用MTT法進(jìn)行衡量,如圖4所示。

圖4 P(DO3A-Gd3+)的細(xì)胞安全性MTT法衡量

從圖4a可以看出,當(dāng)P(DO3A-Gd3+)的質(zhì)量濃度大于200 μg/mL時(shí),4T1細(xì)胞相對(duì)細(xì)胞活性仍然高于95%,表明P(DO3A-Gd3+)具有很高的細(xì)胞安全性。

從圖4b可以看出,在相同環(huán)境下培養(yǎng)14 d內(nèi),注射P(DO3A-Gd3+)的小鼠與未處理的正常小鼠體質(zhì)量沒(méi)出現(xiàn)明顯差別。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,2組小鼠生理狀況良好,全部存活,表明P(DO3A-Gd3+)具有良好的生物安全性。

2.4 P(DO3A-Gd3+)的體外弛豫率

P(DO3A-Gd3+)的體外T1加權(quán)圖像和P(DO3A-Gd3+)、Magnevist的弛豫率r1擬合圖如圖5所示。

圖5 P(DO3A-Gd3+)的體外T1加權(quán)圖像和弛豫率r1擬合圖

體外MRI成像結(jié)果表明P(DO3A-Gd3+)有顯著的MRI增強(qiáng)效果;P(DO3A-Gd3+)的弛豫率為5.3(mmol/L)-1·s-1,比臨床造影劑Magnevist(約2.94(mmol/L)-1·s-1)的高,表明P(DO3A-Gd3+)弛豫性能更強(qiáng),從而能夠在一定程度上降低用藥量,有良好的臨床應(yīng)用前景。P(DO3A-Gd3+)中親水的POEGMA和內(nèi)部交聯(lián)納米結(jié)構(gòu)能夠有效地提高造影劑的水交換速率,進(jìn)而提高弛豫率[13-14]。

2.5 P(DO3A-Gd3+)的體內(nèi)MRI成像

為進(jìn)一步驗(yàn)證P(DO3A-Gd3+)在體內(nèi)的造影增強(qiáng)效果,采用尾靜脈注射法將P(DO3A-Gd3+)注射到已長(zhǎng)出腫瘤的老鼠體內(nèi),在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)老鼠的腫瘤部位進(jìn)行MRI掃描。不同時(shí)間點(diǎn)的T1加權(quán)圖像如圖6所示。從圖6可以看出,在注射P(DO3A-Gd3+)60 min后腫瘤部位明顯變亮,120 min后仍然具有明顯的造影效果,表明P(DO3A-Gd3+)具有很好的MRI造影功能。

圖6 腫瘤鼠在注射P(DO3A-Gd3+)后體內(nèi)T1加權(quán)圖像

3 結(jié) 論

本文通過(guò)可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合方法合成了一種不需要復(fù)雜自組裝的兩親性支化共聚物納米顆粒(PEGDMA-n-BMA-OEGMA-HEMA-DO3A),以該共聚物作為基體鰲合GdCl3·6H2O,制備了一種新型的聚合物MRI納米造影劑P(DO3A-Gd3+)并對(duì)其性能進(jìn)行表征。其結(jié)構(gòu)與尺寸測(cè)試結(jié)果表明,P(DO3A-Gd3+)納米結(jié)構(gòu)穩(wěn)定;細(xì)胞安全性以及生物安全性測(cè)試結(jié)果表明,P(DO3A-Gd3+)具有良好的生物安全性;體外弛豫率測(cè)試結(jié)果表明,P(DO3A-Gd3+)具有很好的MRI造影增強(qiáng)效果。P(DO3A-Gd3+)的合成方法簡(jiǎn)單,可大量制備,相比于臨床造影劑有更好的弛豫性能以及穩(wěn)定性,同時(shí)體內(nèi)循環(huán)時(shí)間更長(zhǎng)、用藥量更低,有向臨床轉(zhuǎn)化的潛力。