川芎萃取物對植物病原真菌的抑制作用*

沈亞倫, 王欣， 陳思博， 劉迦南， 王猛， 李云鵬

(黑龍江大學(xué) 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150080)

植物真菌病害約占植物病害的70%～80%，嚴(yán)重影響了農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量，化學(xué)藥劑雖然防治效果好，但會對人、畜和環(huán)境有所危害[1-3].因此，研發(fā)高效、低毒、對人類與環(huán)境無害的農(nóng)藥是發(fā)展的必然趨勢.植物源殺菌劑可在環(huán)境中迅速分解，對環(huán)境友好，是符合農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展需求的新型農(nóng)藥.我國藥用植物資源豐富,藥用植物中的多種次生代謝產(chǎn)物具有良好的抗菌活性,為植物源殺菌劑的開發(fā)提供了龐大的資源庫,如小檗堿，可從黃連、黃柏、三棵針和唐松草等植物中提取，也可人工合成，具有抑菌、殺蟲、除草及其他農(nóng)用活性[4-5].

中藥材川芎是傘形科植物川芎(Ligusticumchuanxiong)的干燥根莖，含有揮發(fā)油類、生物堿類和酚酸類等生物活性成分[6]，如藁本內(nèi)酯、川芎嗪、阿魏酸和川芎酚等[7-10].目前，已有一些關(guān)于川芎提取物對植物病原真菌抑菌效果的研究.如川芎提取物對擴(kuò)展青霉的孢子形成有一定的抑制作用[11]；川芎和苦參的等量混合物對草莓3種再植真菌病害的防治有一定效果[12]；川芎提取液在離體和活體條件下對采后臍橙的主要致腐菌意大利青霉和指狀青霉均有抑制作用[13]；0.05 g/mL川芎提取物對棉花枯萎病菌的菌絲生長抑制率達(dá)80.4%；0.1 g/mL川芎提取物對棉花枯萎病菌孢子萌發(fā)的抑制率達(dá)99.1%[14]；8.25 mg/mL川芎乙醇提取物對獼猴桃青霉病致病菌-草酸青霉菌絲的生長相對抑制率高達(dá)92.79%，并能顯著抑制已感染果實(shí)的病斑擴(kuò)大[15].

白菜黑斑病是由蕓薹鏈格孢(Alternariabrassicae)引起的白菜葉部常見病害之一，全國各地分布廣泛，病害除造成減產(chǎn)外，還會導(dǎo)致莖葉變苦，品質(zhì)下降，種子帶菌[16-17].由茄鏈格孢菌(Alternariasolani)引起的番茄早疫病是發(fā)生在植株莖葉及果實(shí)上的一種嚴(yán)重病害，一般年份會導(dǎo)致番茄減產(chǎn)10%～30%，流行年份番茄產(chǎn)量損失高達(dá)30%～40%，甚至絕產(chǎn)[18].稻瘟病是由稻梨孢(Magnaportheoryzae)引起的世界性病害，可引起水稻大幅度減產(chǎn)，每年都有發(fā)生，在病害盛行的時候，產(chǎn)量一般減少10%～20%，較嚴(yán)重的地區(qū)高達(dá)40%～50%，甚至顆粒無收[19].

為進(jìn)一步探究川芎提取物抑制植物病原真菌的效果及其抑菌物質(zhì)極性，并探討抑菌活性較好萃取物的防病效果，以白菜黑斑病菌、番茄早疫病菌和稻瘟病菌為供試病原菌，研究川芎乙醇粗提物不同溶劑萃取物的抑菌活性和防病效果，為利用川芎提取物研制植物源殺菌劑提供依據(jù)，也為植物病原真菌綠色防控技術(shù)的建立提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

中草藥川芎：購于哈爾濱泰景中西大藥房，粉碎后過孔徑為0.45 mm的篩，置于通風(fēng)干燥處備用.

供試病原菌：白菜黑斑病菌、番茄早疫病菌和稻瘟病菌均由黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院作物逆境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存.

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g(煮熟取汁液)、葡萄糖20 g及瓊脂18 g以蒸餾水定容至1 000 mL，錐形瓶密封后于121 ℃下滅菌30 min，使用前100 mL培養(yǎng)基添加0.003 g硫酸鏈霉素，防止細(xì)菌污染.

試劑與儀器：所用試劑均為國產(chǎn)分析純.多功能粉碎機(jī)(CHY-6001型，金華市莫菲家用電器有限公司)；超聲波清洗機(jī)(SB5200DT，寧波新芝生物科技股份有限公司)； 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52A型，上海亞榮生化儀器廠)；冷卻水循環(huán)機(jī)(SHZ-D(Ⅲ)型，天津華鑫儀器廠)；冰箱(BCD-220E3C，合肥美菱股份有限公司)； 立式壓力蒸汽滅菌器(YXQ-LS-70A型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)；超凈工作臺(JHT-SDC型，濟(jì)南康寶凈化設(shè)備有限責(zé)任公司)；電子天平(CP224S，德國Sartorius公司)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9240A，上海一恒科技有限公司)；恒溫培養(yǎng)箱(DHP-9052型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；生物顯微鏡(CX22LED型，奧林巴斯(中國)有限公司).

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 川芎提取物制備

稱取20 g川芎粉末，加入100 mL 80%乙醇溶液，置于超聲波振蕩器中30 ℃下振蕩提取60 min，減壓抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至浸膏后以20 mL蒸餾水溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇進(jìn)行萃取，分別得到石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物以及水相萃余物，將各萃取物旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至浸膏后分別用50%乙醇溶液定容，得到濃度為1 g/mL的各萃取物母液，于4 ℃冰箱中冷藏，備用.

1.2.2 抑菌活性測定

采用菌絲生長速率法進(jìn)行測定.在紫外消毒后的超凈工作臺內(nèi)，吸取1 mL各萃取物分別加入已滅菌的99 mL PDA培養(yǎng)基中，充分混勻后制備成含藥10 mg/mL的藥板，以50%乙醇為空白對照，藥板中央接種直徑為0.599 cm的菌餅，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)，72 h后采用十字交叉法測定菌落直徑，為防止因個別處理出現(xiàn)污染而缺失數(shù)據(jù)，每個處理重復(fù)4次并編號，如果前3皿有污染的(限1皿，多于1皿則重做試驗(yàn))，則以第4皿代替進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以此確保每個處理均有3個數(shù)據(jù)，從而篩選出抑菌活性最好的萃取物用于后續(xù)試驗(yàn).

菌絲生長抑制率(%)=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-菌餅直徑)×100.

1.2.3 菌絲生長毒力測定

用50%乙醇溶液作為稀釋溶液，配制質(zhì)量濃度為0.125、0.250、0.500、0.750 g/mL和1.000 g/mL的川芎石油醚萃取物各4 mL，分別加入96 mL的PDA培養(yǎng)基中，制成含藥5、10、20、30 mg/mL和40 mg/mL的藥板，以50%乙醇為空白對照，培養(yǎng)方法、測定方法及重復(fù)次數(shù)等同1.2.2，計算不同濃度各萃取物的菌絲生長抑制率，求出毒力回歸方程和抑制中濃度(IC50)，篩選出被抑制程度最高的植物病原真菌用于后續(xù)試驗(yàn).

1.2.4 孢子萌發(fā)抑制率測定

將白菜黑斑病菌接種于PDA平板上，培養(yǎng)至產(chǎn)生孢子后用鑷子刮取病菌孢子，使用0.5%吐溫80溶液將孢子洗下，雙層紗布過濾，稀釋，使孢子數(shù)量達(dá)到在顯微鏡(10×40倍)下每個視野有200個左右.取川芎石油醚萃取物母液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后用0.5%吐溫80溶液定容至濃度為1 g/mL，并分別稀釋成含藥10、20、40、60 mg/mL和80 mg/mL的川芎石油醚萃取物，分別取各濃度萃取物1 mL與1 mL孢子懸浮液充分混合，取20 μL混合液滴加至凹玻片的凹面中央，以0.5%吐溫80溶液與孢子懸浮液的混合液為對照，3次重復(fù).混合液于28 ℃下溫育6 h(預(yù)試驗(yàn)測得此條件下對照孢子萌發(fā)可達(dá)90%以上)，于400倍顯微鏡下進(jìn)行鏡檢，計算孢子萌發(fā)抑制率.

孢子萌發(fā)率(%)=(視野中萌發(fā)孢子數(shù)/視野中孢子總數(shù))×100；

孢子萌發(fā)抑制率(%)=[(對照組萌發(fā)率-處理組萌發(fā)率)/對照組萌發(fā)率]×100 .

1.2.5 萃取物對白菜黑斑病的盆栽防治效果

將白菜種子播種在裝有營養(yǎng)土的花盆(8 cm×8 cm)內(nèi)，出苗后每盆留 1～2株，置于陽光溫室內(nèi)培養(yǎng)幼苗.待幼苗長出兩片真葉后進(jìn)行防病試驗(yàn)：將等體積的孢子懸浮液(濃度為1×105CFU/mL)以針刺噴霧法分別接種在白菜苗上，覆蓋保鮮膜保濕誘導(dǎo)發(fā)病，接種后每天澆水1次，保持其環(huán)境濕度.發(fā)病后對白菜噴施川芎萃取物(萃取物母液配制方法同1.2.4，濃度為菌絲生長IC50，即3.57 mg/mL)，以代森錳鋅(70%代森錳鋅400倍液)噴霧為陽性對照，0.5%吐溫80溶液為陰性對照，每個處理設(shè)置3次重復(fù)，每個重復(fù)5株，于施藥后每4 d調(diào)查一次，共調(diào)查5次.逐一調(diào)查處理組與對照組所有植株，計算白菜發(fā)病均勻、病情穩(wěn)定時期的病情指數(shù)與防治效果.白菜黑斑病病情分級標(biāo)準(zhǔn)如下：

0級，無病斑；1級，接種葉產(chǎn)生零星(<1/4葉面積)直徑2 mm以下退綠斑；3級，接種葉產(chǎn)生直徑2～3 mm退綠斑，病斑占葉面積1/4～1/2，無霉層；5級，接種葉產(chǎn)生較多直徑3 mm以上褐色斑，不連成片，占葉面積1/2～2/3,有少量霉層；7級，接種葉產(chǎn)生大而多的褐色病斑，連成片，占葉面積2/3以上，有明顯霉層并有輕度萎蔫；9級，接種葉產(chǎn)生大而多的褐黑色病斑，連成片，多數(shù)植株葉片萎蔫，稍久干枯，霉層濃密明顯[20].

病情指數(shù)(%)=[Σ(病級數(shù)×該病級發(fā)病株數(shù))/(最高發(fā)病級數(shù)×總調(diào)查數(shù))] ×100.

防治效果(%)=(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)×100.

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)基本處理；采用DPS統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析和Duncan多重比較、毒力回歸方程和IC50計算.

2 結(jié)果與分析

2.1 各川芎萃取物抑菌活性的初步篩選

從表1可以看出，川芎石油醚萃取物對3種植物病原真菌菌絲生長的抑制率均最高，乙酸乙酯萃取物也有一定抑菌效果，而正丁醇萃取物和萃余物幾乎沒有抑菌活性.濃度為10 mg/mL的川芎石油醚萃取物對3種植物病原真菌菌絲生長的抑制率均在60%以上，因此選擇川芎石油醚萃取物進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn).

表1 10 mg/mL各川芎萃取物對3種植物病原真菌菌絲生長的抑制率

2.2 川芎石油醚萃取物對3種植物病原真菌菌絲生長的室內(nèi)毒力分析

由表2和表3可以看出，川芎石油醚萃取物對3種植物病原真菌菌絲生長的抑制活性均隨著供試濃度的增高而增強(qiáng)，總體上川芎石油醚萃取物對白菜黑斑病菌的抑制效果最好，在質(zhì)量濃度為40 mg/mL時，其對白菜黑斑病菌菌絲生長的抑制率達(dá)98.50%，IC50為3.57 mg/mL.

表2 不同濃度川芎石油醚萃取物對3種病菌菌絲生長的抑制率

表3 川芎石油醚萃取物對3種病菌菌絲的毒力分析

2.3 川芎石油醚萃取物對白菜黑斑病菌孢子萌發(fā)的室內(nèi)毒力分析

由表4和圖1可以看出，川芎石油醚萃取物對白菜黑斑病菌孢子萌發(fā)有較強(qiáng)的抑制作用，且隨著萃取物濃度升高，抑制作用增強(qiáng).川芎石油醚萃取物濃度為10 mg/mL及以上時，對孢子萌發(fā)的抑制率均高于50%；依據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)得到毒力回歸方程為y=2.542 3+2.431 3x，相關(guān)系數(shù)(r)為0.951 0，IC50為10.25 mg/mL.

表4 不同濃度川芎石油醚萃取物對白菜黑斑病菌孢子萌發(fā)的抑制作用

2.4 川芎石油醚萃取物對白菜黑斑病的盆栽防治效果

由于第1次和第2次調(diào)查時白菜苗的發(fā)病情況不明顯，而第4次和第5次部分白菜苗因生理原因枯死，無法判斷其發(fā)病情況，而第3次調(diào)查時上述兩個方面問題影響較小，所得的數(shù)據(jù)比較具有代表性,因此最終選擇用接種后第3次調(diào)查所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析.從表5可以看出，噴施3.57 mg/mL的川芎石油醚萃取物明顯抑制了白菜黑斑病的病斑擴(kuò)展蔓延，防治效果達(dá)51.7%，葉片缺綠情況較陽性對照組輕.

表5 川芎石油醚萃取物對白菜黑斑病的防治效果

從左至右川芎石油醚萃取物濃度依次為0、5、10、20、30 mg/mL和40 mg/mL.

3 討論

探究了川芎80%乙醇提取物的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物及萃余物對白菜黑斑病菌、番茄早疫病菌和稻瘟病菌菌絲生長的抑制作用，結(jié)果與王欣等[21]的研究結(jié)果相似，發(fā)現(xiàn)川芎石油醚萃取物的抑菌活性最高，說明川芎抑制植物病原真菌的抑菌物質(zhì)極性較小，主要存在于石油醚萃取物中.進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，川芎石油醚萃取物對白菜黑斑病菌、番茄早疫病菌和稻瘟病菌菌絲生長的IC50分別為3.57、4.65 mg/mL和4.81 mg/mL；其對白菜黑斑病菌孢子萌發(fā)也有一定抑制效果，IC50為10.25 mg/mL，這進(jìn)一步證實(shí)了川芎石油醚萃取物的抑菌潛力.代森錳鋅是一種廣譜、低毒的保護(hù)性殺菌劑，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上常用于白菜黑斑病的防治[16]，因此在盆栽防病試驗(yàn)中，選擇代森錳鋅作為陽性對照.試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3.57 mg/mL川芎石油醚萃取物對白菜黑斑病的防治效果達(dá)51.7%，高于代森錳鋅，可見川芎石油醚萃取物具有進(jìn)一步開發(fā)為防治白菜黑斑病等植物真菌病害的新型植物源農(nóng)藥的潛力.今后，可對川芎石油醚萃取物的抑菌成分和抑菌機(jī)理進(jìn)行研究，并進(jìn)行田間防病試驗(yàn)，進(jìn)一步探討其防病效果和機(jī)理，為植物真菌病害的綠色防控提供依據(jù).

4 結(jié)語

通過液液萃取法得到了川芎80%乙醇提取物的不同極性溶劑萃取物，探究其對植物病原真菌的抑菌和防病效果，發(fā)現(xiàn)川芎石油醚萃取物的抑菌效果最好，對白菜黑斑病菌菌絲生長和孢子萌發(fā)均有較強(qiáng)的抑制作用，盆栽試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了其對白菜黑斑病具有防病潛力.