市售水產品中恩諾沙星殘留現(xiàn)狀和檢測方法

李 麗，司曉晶，黃 玥，張路遙，白 晨

（上海商學院 食品系，上海 200235）

恩諾沙星屬于氟喹諾酮類藥物，是一種微黃色或淡黃色結晶性粉末，常用于合成抗菌性藥物，被國家指定為動物專用藥。由于可預防和治療禽獸的細菌性感染及支原體病，價格低、效果好，而且恩諾沙星在常用魚類抗生素中不良反應發(fā)生率較低。因此，商家為了防治魚病，降低水產品死亡概率，恩諾沙星被廣泛應用于水產養(yǎng)殖業(yè)中[1-2]。但是，抗生素類藥物在水產品中的吸收率不高，大部分會殘留在水產品體內，這樣會導致很多水產品中存有超量的恩諾沙星，對人體造成一定的健康危害。如果長期攝入恩諾沙星藥物殘留超標的水產品，可引起輕度腸道刺激或不適，如頭暈、頭疼、失眠等癥狀，大劑量地攝入還可能引起肝損害；還有可能使人體產生耐藥性，影響軟骨發(fā)育，導致畸形[3]。超量存放在自然環(huán)境中對生態(tài)也會有一定的破壞。恩諾沙星進入水體后，使水體中恩諾沙星長期保持低濃度水平，不僅不能顯著殺傷水體微生物，還很容易產生耐藥性[4-5]。

歐盟、美國、日韓等國家和地區(qū)對恩諾沙星在水產品中的使用和殘留限量都有明確的標準。我國在農業(yè)部235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中做出了對液態(tài)奶中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的最高殘留限量（MRL）的明確規(guī)定[6]。同時，在《食品安全國家標準食品中獸藥最大殘留限量》（GB 31650—2019）中規(guī)定恩諾沙星的ADI（每日允許攝入量）為0～6.2μg/kg。其中，明確恩諾沙星殘留標志物為恩諾沙星和環(huán)丙沙星的加和，并且規(guī)定其在魚的皮和肉中最大殘留限量值為100μg/kg。在貝類、蝦等水產品中肌肉、脂肪部分限量值為100μg/kg，肝腎為200μg/kg[7]。

1 恩諾沙星殘留現(xiàn)象

在2018年，國家市場監(jiān)督管理總局發(fā)布的水產品的監(jiān)督抽檢結果分析報告中發(fā)現(xiàn)，魚類的不合格項目最多的是恩諾沙星。淡水魚一共有15次不合格批次，其中6次都是由于恩諾沙星超標，占40%；海水魚一共12批次，有9次是由于恩諾沙星超標。綜合來看，魚類樣品共檢出7個不合格項目，其中恩諾沙星的不合格項次（15項次）占不合格項次總數(shù)（29項次）的51.7%。其他水產品如蝦、貝類、蟹類也出現(xiàn)了恩諾沙星超標的現(xiàn)象，但數(shù)量不多[8]。

水產品的不合格檢驗項目見圖1，各地區(qū)水產品恩諾沙星殘留不合格數(shù)量見圖2，全國水產品中恩諾沙星檢出情況見表1。

圖1 水產品的不合格檢驗項目

圖2 各地區(qū)水產品恩諾沙星殘留不合格數(shù)量

在2020—2021年，通過食安通公布的食品抽檢信息結果，統(tǒng)計了全國各個地區(qū)水產品恩諾沙星不合格的數(shù)量（見圖2）。經過統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，浙江省數(shù)量最多，在2020年水產品中檢出不合格批次高達70例。結合表1，在同階段，各個地區(qū)恩諾沙星不合格批次中水產品占比較大，大多地區(qū)水產品在恩諾沙星不合格項目中為主要產品類別。沿海地區(qū)浙江省在2020—2021年恩諾沙星不合格率有所下降，但是水產品的檢出率還是高達80%以上，居高不下。2021年北京市恩諾沙星不合格檢出量有所下降，但是水產品在其中的檢出率高達96%。通過上述的分析，可以發(fā)現(xiàn)水產品獸藥超標的批次中，大部分都是由于恩諾沙星超標造成，氟喹諾酮類藥物數(shù)量更高。

表1 全國水產品中恩諾沙星檢出情況

同時，發(fā)現(xiàn)上海市2015—2021年市售水產品抽查情況中，不合格項目恩諾沙星的抽查結果相比于國內其他地區(qū)，殘留不合格檢出量不是很高，最高是在2017年，總檢出量為23。但是，每年檢出的不合格批次，水產品一直都是主要檢出產品。在2019年后，國家對于食品安全更加嚴格監(jiān)測，食品安全受到高度重視，不合格的數(shù)量有所下降，基本是個位數(shù)，但是水產品在其中的檢出率仍然很高。我國規(guī)定恩諾沙星的殘留量≤100μg/kg，在檢測結果中顯示，一些批次檢測到的檢測殘留量超過界限值10倍高，濫用的現(xiàn)象仍然存在。在2015年，一批鳊魚中檢出的恩諾沙星殘留量為5 491.3μg/kg，遠遠超過國家限量。若這批產品沒有被檢測或者檢測方法不準確，將會對消費者的健康和生態(tài)環(huán)境產生很大的危害。

上海市水產品恩諾沙星檢測結果見表2。

表2 上海市水產品恩諾沙星檢測結果

目前，國內外對于恩諾沙星等氟喹諾酮類藥物的使用量有了明確的限制，而且在美國、加拿大、中國臺灣、中國香港等國家或地區(qū)均未允許將恩諾沙星等喹諾酮類藥物用于水產養(yǎng)殖，因此這幾個國家和地區(qū)的限量均為不得檢出。在國內，通過分析各個地區(qū)，發(fā)現(xiàn)恩諾沙星殘留超標的現(xiàn)象仍然存在，而且恩諾沙星屬于不合格項目中的主要項目，其中水產品在產品類別中數(shù)量超過50%。水產品中恩諾沙星殘留問題在未來幾年仍將存在，所以為了給廣大消費者提供安全保障，保證我國的食品安全，水產品中恩諾沙星殘留量檢測需要準確、快速的分析方法。

2 恩諾沙星分析方法

目前，已有一些常見分析方法能夠快速準確地檢測出食品中恩諾沙星殘留的含量，如熒光法、酶聯(lián)免疫吸附法、高效液相色譜法、微生物檢測法和電化學分析法等[9]。其中，目前能夠實現(xiàn)快速方便檢測的電化學方法已經成為了確保食品和藥物質量安全的主題之一。

2.1 熒光法

由于恩諾沙星的結構中含有具有熒光特性的苯環(huán)剛性平面結構，可采用熒光法進行檢測。劉小鳴等人[10]將熒光法結合化學計量學法建立了一種快速檢測恩諾沙星的分析方法，熒光光譜檢測的恩諾沙星的含量數(shù)據(jù)通過偏最小二乘法和偏最小二乘判別分析可較好地預測牛乳中恩諾沙星的含量，且回收率在96.0%～111.4%。

近年來，新型熒光功能材料的應用也大大豐富了恩諾沙星的熒光檢測方法。Guo X J等人[11]以蘋果酸和甘氨酸為原料制備了表面富含羧基和氨基的氮摻雜的碳量子點（N-CDs），研究顯示該N-CDs熒光可被Cu2+以電子轉移方式猝滅，加入恩諾沙星后，NCDs熒光得到恢復，基于該原理設計了一種基于NCDs-Cu2+體系的快速、靈敏的熒光傳感策略，用于選擇性檢測恩諾沙星，最優(yōu)條件下該方法的線性范圍為1.0～15.0μg/mL，最低檢出限（LOD）為0.16μg/mL，結果令人滿意。

符東等人[12]以CdTe量子點為反應底物，在一定技術上制備成CdTe-Al熒光探針，與恩諾沙星結合形成CdTe-Al-恩諾沙星體系，對小龍蝦中恩諾沙星殘留檢測具有效果較好，在最佳因素條件下，該探針的熒光強度對恩諾沙星質量濃度在7.19×10-4～3.59×10-3mg/kg時線性良好，檢出限為1.44×10-4mg/kg，具有靈敏度高、成本低等優(yōu)點。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法是食品安全快速檢查常用方法之一，在測定時，把受檢標本和酶標抗原或抗體按不同步驟與固相載體表面的抗原與抗體發(fā)生反應后顯色，顏色的深淺與受檢物質的量呈正比，可以用于定性或者定量測定。該測定方法快速靈敏、操作方便，在食品等各個領域廣泛應用。

趙秋伶等人[13]建立了酶切信號轉導的酶聯(lián)適配體比色法檢測牛奶中恩諾沙星殘留量。波長450 nm處的吸光度與恩諾沙星濃度呈線性關系，線性范圍為36～254μg/L，檢測限為15μg/L。在樣品驗證中，平均回收率在93.5%～99.6%，而且測出批內變異系數(shù)為6.03%～8.12%，批間變異系數(shù)為7.31%～13.42%。適合測量微量樣品及批量測定。

袁艷茹[14]運用酶聯(lián)免疫試劑盒測定飼料中的恩諾沙星，標準品吸光度值與標準品濃度成半對數(shù)相關性，從而得到標準曲線。然后把樣品吸光值代入標準曲線，得到樣品對應濃度，再乘以對應樣品稀釋倍數(shù)，即可快速得出樣品中恩諾沙星實際含量。

為了提高檢測速率，Hu S等人[15]以酶標二抗為探針建立了酶聯(lián)免疫吸附方法（ELISA），制備的抗恩諾沙星單抗牛血清白蛋白作為免疫原，對恩諾沙星的檢測靈敏度提高了6倍。

2.3 高效液相色譜法

由于水產品樣品處理后一般為液體，所以不需要氣化處理，大多選擇具有熒光檢測器的高效液相色譜法測定。

馮濤等人[16]采用熒光檢測器-反相高效液相色譜法測定水產品中恩諾沙星含量。采用乙腈-甲酸水溶液作為流動相，將水產品用該流動相溶液提取，HLB固相萃取柱凈化后進樣梯度洗脫，熒光檢測器的激發(fā)波長為280 nm，發(fā)射波長為450 nm。在優(yōu)化的色譜條件下，對杭州某市場中對蝦、大閘蟹、黑魚10份樣品進行分析檢測，發(fā)現(xiàn)在1份黑魚的樣品中有恩諾沙星的殘留，分析方法準確可靠。

隨著分析儀器的不斷發(fā)展，高效液相色譜法和質譜法聯(lián)用技術常用來作為恩諾沙星的檢測方法，將色譜和質譜優(yōu)點相結合，更具有高分離和強鑒定能力，靈敏度高，除了能夠基本檢測之外，HPLCMS/MS還能夠提供出一定的分子結構信息，防止檢測樣品假陽性的現(xiàn)象。但是存在操作條件嚴格、檢測費用昂貴等缺點。

王麗娟等人[17]分別采用高效液相色譜法和高效液相色譜法-串聯(lián)質譜法檢測水產品中的恩諾沙星等喹諾酮類藥物。在最佳的色譜、質譜條件下，HPLCMS/MS對恩諾沙星的檢測限為1.0μg/kg，而且靈敏度更高，色譜峰出峰更快，更能快速檢測。但是同時HPLC-MS/MS的線性范圍比HPLC小，更適合低濃度樣品的檢測。

張穎等人[18]建立了QuEChERS EMR-Lipid結合的LC/MS/MS分析方法同時測定水產品中15種喹諾酮類抗生素。該方法前處理簡單快速、凈化效果好、靈敏度高。結果表明，15種抗生素方法檢出限（S/N=3）在0.5～2.0μg/kg，在2，20，50μg/kg這3個質量濃度下，平均回收率為75.8%～112.3%，在1～200 ng/mL質量濃度內線性關系良好（R2〉0.998），RSD在2.3%～10.2%（n=6），比較適用于養(yǎng)殖水產品中多組分喹諾酮類抗生素的檢測。

2.4 電化學分析法

電化學分析把測定對象當成一個化學電池的組成部分，通過測量電池的某些物理量，比如電導、電位、電流等信號，求得物質的含量或測定物質的電化學性質。電化學分析成本低、快速、便捷。而且CdS、石墨烯、碳纖維等納米材料修飾電極，通過增加電極表面積、電子傳輸速率可顯著增加電化學檢測方法的靈敏度；在電極表面修飾分子識別元件酸適配體可提高檢測方法的特異性和選擇性。

劉宇婷等人[19]研制了納米CdS為修飾劑的涂絲型恩諾沙星離子選擇電極，將設計的電極用于豬肉樣品中恩諾沙星的檢測，經過測定結果與標準方法無顯著性差異。

Donmez F等人[20]以硼摻雜金剛石電極（BDD）為工作電極，在表面活性劑十二烷基硫酸鈉（SDS，0.9μmol/L）信號增敏作用下建立了恩諾沙星的電化學檢測方法。最優(yōu)條件下，電化學響應信號與恩諾沙星質量濃度在0.025～1.000μg/mL呈線性關系，檢測限（LOD）為0.005 7μg/mL。

秦思楠等人[21]以恩諾沙星為模板分子，鄰苯二胺和鄰氨基苯酚為復合功能單體制備了分子印跡電化學傳感器，對實際樣品牛奶、雞肉、豬肉和雞蛋中的恩諾沙星進行檢測，加標回收率在83.2%～92.7%，相對標準偏差在1.0%～4.8%（n=5）。

該課題組[22]以鎳修飾的碳纖維制備電化學傳感器快速測定上海市場中鱸魚、大黃魚、鯽魚、泥鰍、大頭蝦中恩諾沙星的殘留情況。經過測試，鱸魚和大頭蝦中有恩諾沙星殘留檢出，其中大頭蝦中恩諾沙星的最高殘留限量（MRL）平均值為77.90μg/kg，不超過100μg/kg的國家標準，質量合格，而且回收率較好為97%～101%，RSD為1.0%（n=3），并且抗干擾性和穩(wěn)定性較好。

因此，電化學分析方法選擇性強、穩(wěn)定性好、操作簡便、檢測快速靈敏、成本低，具有良好的應用前景，對保障水產品的質量安全有重要意義。

3 結論

從上述的研究調查發(fā)現(xiàn)，目前我國水產品在養(yǎng)殖和運輸過程中恩諾沙星普遍使用，而且在水產品中檢出率極高，殘留量超標現(xiàn)象也有存在。因此，應加強各環(huán)節(jié)對水產品的監(jiān)督管理，對養(yǎng)殖戶和經營戶加強抗生素類獸藥和經營管理的知識培訓。同時，開發(fā)和建立恩諾沙星殘留的快速、簡便、靈敏的檢測方法，為水產品中恩諾沙星殘留檢測提供了新的技術支持，保障水產品質量安全。