外界因素對(duì)茶黃素（TF）水溶液穩(wěn)定性的影響研究

俞晨秀，孫 莉，孫益民，秦亞東，高 煥

（（1.安徽中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系，安徽 蕪湖 241000；2.蕪湖市食品藥品檢驗(yàn)中心，安徽 蕪湖 241000；3.安徽師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，安徽 蕪湖 241000）

近年來，茶黃素功效的報(bào)道日益增多，其研究也備受關(guān)注。茶黃素因其在乙酸乙酯中呈現(xiàn)黃色而得名[1]，它是Roberts在1957年從紅茶中分離并鑒定獲得，是茶葉中多酚類物質(zhì)氧化聚合而成的一類多酚羥基具苯駢卓酚酮結(jié)構(gòu)的物質(zhì)[2]，是形成紅茶茶湯“黃金圈”的物質(zhì)，對(duì)紅茶茶湯鮮爽度和強(qiáng)度等滋味起著重要作用[3]。茶黃素具有良好的抗氧化性[4]、抗炎癥[5-6]、抗尿酸[7]、抗病毒[8]、抗菌[9]、抗腫瘤等作用[10-12]。到目前為止，各類茶黃素有28種之多[13]，其中最主要的單體有4種化合物，即茶黃素（Theaflavins，TF）、茶黃素-3-單沒食子酸酯（Theaflavin-3-gallate，TF-3-G）、茶黃素-3'-單沒食子酸酯（Theaflavin-3'-gallate，TF-3'-G）、茶黃素-3,3'-雙沒食子酸酯（Theaflavin-3,3-digallate，TFDG）。

茶黃素結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 茶黃素結(jié)構(gòu)式

在這4種單體中及總的28種中，茶黃素是具有最基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)的單體，其穩(wěn)定性與其他單體的穩(wěn)定性密切相關(guān)。因此，研究茶黃素的穩(wěn)定性能較好反映其他單體的穩(wěn)定性。在茶黃素中有多個(gè)酚羥基、多個(gè)環(huán)和大共軛體系，這種結(jié)構(gòu)有著怎樣的穩(wěn)定性無疑是茶黃素提取、分離和應(yīng)用中需要考慮的，而這方面系統(tǒng)的專題研究卻未見報(bào)道。研究了TF在多種環(huán)境下的穩(wěn)定性，以期為茶黃素的開發(fā)應(yīng)用和深入研究中提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

茶黃素（TF），純度99.636%，成都瑞芬思生物科技有限公司提供；乙酸、EDTA-2Na、抗壞血酸、三氯化鐵、硝酸銀、鹽酸均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；甲醇、乙腈均為色譜純，德國(guó)默克公司提供；水（娃哈哈純凈水）。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent HPLC-1260型高效液相色譜儀、DAD檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫科技有限公司產(chǎn)品；DV215CD型精密電子天平，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；RA24型電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司產(chǎn)品；FYL-YS-310L型冰箱，北京福意電器有限公司產(chǎn)品；PHS-25型pH計(jì)，上海今邁儀器儀表有限公司產(chǎn)品；JK-250DB型數(shù)控超聲波清洗器，合肥金尼克機(jī)械制造有限公司產(chǎn)品；20 W家用日光燈，PAK/三雄極光產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 茶黃素水溶液的配制

精密稱取一定量的茶黃素（TF）（萬分之一天平稱取），用40℃水溶解，配成約40μg/mL的溶液。

1.3.2 茶黃素不同pH值溶液的配制

pH值約為4的茶黃素溶液（茶黃素水溶液：pH值為3的鹽酸=9∶1），pH值約為5的茶黃素溶液（茶黃素水溶液：pH值為4的鹽酸=9∶1），pH值約為7的茶黃素溶液（1.3.1中所配茶黃素水溶液），pH值約為8的茶黃素溶液（茶黃素水溶液：pH值為9的氫氧化鈉=9∶1），pH值約為9的茶黃素溶液（茶黃素水溶液：pH值為10的氫氧化鈉=9∶1），溶液均過0.45μm膜。

1.3.3 不同濃度Fe3+的茶黃素溶液的配制

分別取1 mmol/L的三氯化鐵溶液0.1，0.2，0.3，0.4 mL于4支5 mL容量瓶中，用茶黃素水溶液（見1.3.1）稀釋至刻度，配成含不同濃度Fe3+的茶黃素溶液，搖勻后過0.45μm膜。

1.3.4 穩(wěn)定溶液的配制

依據(jù)GB/T 31740.3—2015[7]配制穩(wěn)定溶液，分別將EDTA-2Na溶液25 mL，抗壞血酸溶液25 mL，乙腈50 mL加入500 mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻。

（1）EDTA-2Na溶液。10 mg/mL（現(xiàn)配）。精密稱取EDTA-2Na 1.0 g，用水稀釋至100 mL。

（2）抗壞血酸溶液。10 mg/mL（現(xiàn)配）。精密稱取抗壞血酸1.0 g，用水稀釋至100 mL。

1.3.5 茶黃素的穩(wěn)定液溶液

稱取一定量的茶黃素（TF），用穩(wěn)定溶液稀釋至刻度，搖勻后過0.45μm膜。

1.3.6 茶黃素溶液的含量變化測(cè)試

茶黃素含量測(cè)定采用高效液相色譜法，依據(jù)GB/T 31740.3—2015[7]測(cè)定中的色譜條件和梯度條件，以常溫下同批次標(biāo)準(zhǔn)品水溶液的吸收峰面積為100%含量，比較不同環(huán)境下樣品的峰面積變化值，來確定含量的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶黃素（TF）標(biāo)準(zhǔn)物的測(cè)試

茶黃素（TF）標(biāo)準(zhǔn)品純度高，測(cè)試其HPLC色譜圖中峰數(shù)單一，峰形尖銳；基線平直，零點(diǎn)吻合，因此可以作為試驗(yàn)中參比的標(biāo)準(zhǔn)。

HPLC色譜圖見圖2。

圖2 HPLC色譜圖

2.2 加熱溫度的影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示，茶黃素水溶液在40℃以下較穩(wěn)定，50℃以上加熱30 min分解明顯，吸收峰面積（響應(yīng)值）只有空白樣的49.76%，80℃以上加熱30 min吸收峰面積為0，表明此時(shí)已經(jīng)全部分解完全，可見溫度對(duì)茶黃素水溶液的穩(wěn)定性影響非常大，溫度越高影響越大。

溫度對(duì)茶黃素水溶液穩(wěn)定性的影響曲線見圖3。

圖3 溫度對(duì)茶黃素水溶性穩(wěn)定性的影響曲線

2.3 酸堿度的影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示，茶黃素水溶液在pH值為4～7，酸性和中性條件下比較穩(wěn)定，在pH值〉8的堿性條件下不穩(wěn)定，pH值=8時(shí)吸收峰面積（響應(yīng)值）只有空白樣的26.74%，這與酚類化合物自身是弱酸性物質(zhì)，在酸性和中性條件下較穩(wěn)定的推測(cè)一致。

pH值對(duì)茶黃素水溶性穩(wěn)定性的影響曲線見圖4。

圖4 p H值對(duì)茶黃素水溶性穩(wěn)定性的影響曲線

2.4 Fe3+的影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)e3+極易與茶黃素反應(yīng)，當(dāng)Fe3+的濃度為0.02 mmol/L的極低濃度時(shí)，茶黃素仍然與Fe3+有明顯的反應(yīng)。

不同濃度Fe3+存在下的吸收峰面積見圖5。

圖5 不同濃度Fe3+存在下的吸收峰面積

2.5 室溫、低功率照射、穩(wěn)定液中放置時(shí)間的影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示，茶黃素水溶液在冬天10～20℃下放置有緩慢的分解，8 d后茶黃素的吸收峰面積是空白樣的87.55%；在低功率照射下（20 W日光燈），茶黃素的吸收峰面積變化曲線與室溫下面積變化曲線基本一致，照射8 d后茶黃素的吸收峰面積是空白樣的89.91%，與87.55%接近，說明低功率照射對(duì)茶黃素水溶液的穩(wěn)定性基本無影響；穩(wěn)定液中的茶黃素在10～20℃下放置8 d幾乎不分解，8 d后吸收峰面積是空白樣的101.58%，沒有降低，說明有穩(wěn)定液存在對(duì)茶黃素的穩(wěn)定性起到了一定的保護(hù)作用。

3種條件下的吸收峰面積變化曲線見圖6。

圖6 3種條件下的吸收峰面積變化曲線

3 討論

茶黃素（TF）由中間的苯與七員雙烯環(huán)酮并合結(jié)構(gòu)，另2個(gè)苯與四氫吡喃并合結(jié)構(gòu)共3個(gè)部分構(gòu)成。中間的并合結(jié)構(gòu)是大共軛體系，七員雙烯環(huán)酮上有一個(gè)烯醇式結(jié)構(gòu)；另2個(gè)并合結(jié)構(gòu)通過單鍵與中間并合結(jié)構(gòu)相連，在2個(gè)并合結(jié)構(gòu)與單鍵連接的兩旁都有氧吸電子基，這些因素使得單鍵上電子云向兩端轉(zhuǎn)移而容易斷裂，當(dāng)溫度升高有可能發(fā)生斷鍵的分解作用。從溫度增加吸收峰面積降低，HPLC法測(cè)定中的吸收峰數(shù)目增多，說明了分解反應(yīng)的發(fā)生。

在茶黃素中有多個(gè)酚羥基而顯示弱酸性[14]，因此茶黃素在酸性和中性中穩(wěn)定，而在堿性中試驗(yàn)結(jié)果是吸收峰面積下降明顯，吸收峰數(shù)目明顯增多，可能是茶黃素發(fā)生了開環(huán)和斷鍵反應(yīng)，具體原因還不清楚。

酚能與三氯化鐵發(fā)生顯色反應(yīng)[15]，茶黃素中有多個(gè)酚羥基，所以茶黃素極易與Fe3+發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)屬于配位反應(yīng)[16]，從反應(yīng)的現(xiàn)象由淡黃色變?yōu)榈仙颊f明了該反應(yīng)的特點(diǎn)。

酚具有易氧化的性質(zhì)[15]，烯醇式結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，茶黃素的多酚結(jié)構(gòu)和烯醇式結(jié)構(gòu)使得茶黃素的水溶液容易被氧化，在實(shí)驗(yàn)室常溫密閉放置下也會(huì)緩慢被氧化；加入了由抗氧化劑（VC）和金屬離子配合物（EDTA）組成的穩(wěn)定液，因穩(wěn)定液能參與氧化，結(jié)合大部分金屬離子，因此它們能提高茶黃素的穩(wěn)定性；低功率照射則因照射能力低而幾乎沒有影響。

4 結(jié)論

茶黃素（TF）是由3個(gè)并合結(jié)構(gòu)通過單鍵連接的多酚物質(zhì)，易發(fā)生分解和氧化及與Fe3+的配位反應(yīng)，在加熱、堿性和Fe3+存在下不穩(wěn)定，因此，茶黃素在使用時(shí)要盡量選擇低溫、酸性和無Fe3+影響的條件下，避免加熱、堿性和Fe3+的影響，普通日光燈照射基本不影響，穩(wěn)定液對(duì)茶黃素水溶液的穩(wěn)定性有一定的保護(hù)作用。