靈芝發(fā)芽糙米蒲公英復(fù)合飲料研制

熊亞琴，羅建光

（1.淮安生物工程高等職業(yè)學(xué)校，江蘇 淮安 223232；2.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 淮安 223023）

靈芝（Ganoderma lucidum）又名赤芝、萬年蕈、靈芝草，是一種多孔擔(dān)子菌亞門藥食用真菌的子實(shí)體，富含靈芝多糖、靈芝酸、氨基酸、微量元素等物質(zhì)，具有免疫調(diào)節(jié)、安神益腦、補(bǔ)氣活血、提高機(jī)體耐缺氧能力、清除自由基、預(yù)防腫瘤等作用[1-4]。發(fā)芽糙米含有豐富的維生素B族、生育酚、膳食纖維、肌醇六磷酸鹽、γ-氨基丁酸等營(yíng)養(yǎng)元素，其中γ-氨基丁酸對(duì)改善人體的神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、新陳代謝、肝臟功能具有良好的功能[5]。蒲公英又名婆婆丁、黃花地丁，多年生草本植物，有“天然抗生素”的美譽(yù)，為傳統(tǒng)藥食同源材料，含有豐富的甾醇、菊糖、膽堿、有機(jī)酸、維生素、胡蘿卜素、微量元素等，具有抗菌消炎、清熱解毒、健胃散結(jié)、消腫利尿、保肝利膽、抗病毒等功能[6-11]。

目前，隨著飲料產(chǎn)業(yè)不斷轉(zhuǎn)型升級(jí)，健康化、營(yíng)養(yǎng)化飲料的研究開發(fā)越來越受到重視。以靈芝子實(shí)體、發(fā)芽糙米和蒲公英為原料開發(fā)的產(chǎn)品較多[12-14]；而以發(fā)芽糙米為主要原料，通過靈芝液體發(fā)酵和添加野生蒲公英提取物研制復(fù)合飲料的研究在國(guó)內(nèi)尚未見報(bào)道。為此，以發(fā)芽糙米為原料進(jìn)行靈芝液體發(fā)酵，獲得靈芝發(fā)酵液，再添加蒲公英提取物、木糖醇和檸檬酸等輔料，開發(fā)出一種既具有獨(dú)特風(fēng)味和清鮮口感，又保留了靈芝、發(fā)芽糙米和蒲公英原有營(yíng)養(yǎng)保健功效的復(fù)合飲料，為靈芝、發(fā)芽糙米和蒲公英進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論支持，開辟出靈芝、發(fā)芽糙米和蒲公英等相關(guān)復(fù)合飲料研制的新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種:靈芝（赤芝，紅靈芝、CICC14042），中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供。

發(fā)芽糙米粉、發(fā)芽黃豆粉，新鮮的糙米、黃豆經(jīng)實(shí)驗(yàn)室發(fā)芽、烘干、粉碎、過60目篩加工制成。

發(fā)芽大麥粉，購(gòu)自淮安廣濟(jì)大藥房，經(jīng)粉碎過60目篩加工制成。

葡萄糖、NaCl、CaCO3、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4，無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司提供；蛋白胨、瓊脂，上海博微生物科技有限公司提供；麥芽糖，江蘇先卓食品科技股份有限公司提供；海藻酸鈉、CMC-Na、檸檬酸、木糖醇，河南千志商貿(mào)有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

DLSB-5L/20型低溫冷卻液循環(huán)泵，鞏義市子華儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；101-3A型數(shù)顯式電熱恒溫干燥箱，上海陽(yáng)光實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；ZG-1M2型真空冷凍干燥機(jī)組，杭州創(chuàng)意真空冷凍干燥設(shè)備廠產(chǎn)品；TDL-40C型低速臺(tái)式大容量離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；ZWY-2102型恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司產(chǎn)品；SHA-C型恒溫水浴振蕩器，常州榮華儀器制造有限公司產(chǎn)品；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；SW-CJ-2FD型雙人單面垂直凈化工作臺(tái)，江蘇通凈凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；GNP-9050型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；RE-3000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 靈芝發(fā)芽糙米發(fā)酵液的制備

（1）菌種活化。從靈芝母種斜面上取一塊約0.5 cm2大小的菌塊置于PDA斜面培養(yǎng)基上，在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，制得活化斜面菌種。

（2）種子培養(yǎng)。在250 mL錐形瓶中裝入100 mL種子培養(yǎng)基，高壓蒸汽滅菌后冷卻至室溫，于無菌條件下接入活化的2～3菌塊（5 mm2），然后置于搖床中，于28℃下以轉(zhuǎn)速180 r/min培養(yǎng)7 d，制得液體靈芝菌種。

（3）液體發(fā)酵。在500 mL三角瓶中裝入200 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基，高壓蒸汽滅菌后冷卻至室溫，于無菌條件下按5%接種量接入種子培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)7 d（溫度28℃，轉(zhuǎn)速180 r/min）。

1.3.2 靈芝發(fā)酵液的制備

將液體發(fā)酵培養(yǎng)基倒入離心管中離心（離心轉(zhuǎn)速4 000 r/min）→吸取上清液→得到發(fā)酵液原液。

1.3.3 蒲公英提取物的制備

將采集的蒲公英洗凈、烘干→打成顆粒度較大的粉末（30 s）→過50目篩→加入純凈水在60℃提取2次→抽濾真空泵粗過濾→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮→真空冷凍干燥成粉末。

1.3.4 靈芝發(fā)芽糙米蒲公英復(fù)合飲料加工工藝

原液→加入蒲公英提取物→調(diào)配→均質(zhì)→灌裝、排氣、封口→加熱殺菌→冷卻→貼標(biāo)→成品。

1.3.5 操作要點(diǎn)

①培養(yǎng)基配制時(shí)要注意攪拌均勻，以防止沉淀和煳底；②接種要保證在無菌的條件下操作，操作人員應(yīng)該預(yù)先對(duì)接種培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌，再在超凈工作臺(tái)下用紫外燈照射15～30 min，再用酒精對(duì)帶有手套的雙手消毒后再進(jìn)行接種；③接種時(shí)接種鏟溫度不宜過高，會(huì)將靈芝菌種燙死；④接種操作時(shí)要注意瓶塞擺放的位置、瓶塞與錐形瓶的間距；⑤接種結(jié)束后，應(yīng)立即放置于搖床內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)；⑥蒲公英打粉要注意時(shí)間應(yīng)該控制在30～35 s；⑦蒲公英濃縮時(shí)應(yīng)注意旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中溶液的體積，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的轉(zhuǎn)速不宜過高；⑧蒲公英提取物配制飲料添加時(shí)應(yīng)注意快速稱取，防止其吸潮，產(chǎn)生質(zhì)地上的變化；⑨飲料均質(zhì)應(yīng)該注意轉(zhuǎn)速不宜過高，以防止飲料產(chǎn)生大量的泡沫，而影響產(chǎn)品的感官品質(zhì)。

1.3.6 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）發(fā)酵液添加量的確定。以10%，20%，30%，40%，50%的發(fā)酵液分別添加4%木糖醇，0.01%檸檬酸，0.45%蒲公英提取物，用純凈水定容至100 mL，即100 mL中發(fā)酵液體積分別為10，20，30，40，50 mL，按此方法分別制成的靈芝發(fā)芽糙米蒲公英復(fù)合飲料進(jìn)行感官評(píng)定，確定最佳的發(fā)酵液添加量。

（2）蒲公英提取物添加量的確定。以添加量0.15%，0.25%，0.35%，0.45%，0.55%的蒲公英提取物分別添加40%發(fā)酵液，4%木糖醇，0.01%檸檬酸，用純凈水定容至100 mL，即100 mL中蒲公英提取物添加量分別為0.15，0.25，0.35，0.45，0.55 g，按此方法分別制成的靈芝發(fā)芽糙米蒲公英復(fù)合飲料進(jìn)行感官評(píng)定，確定最佳的蒲公英提取物添加量。

（3）木糖醇添加量的確定。以2%，4%，6%，8%，10%的木糖醇分別添加40%發(fā)酵液，0.45%蒲公英提取物，0.01%檸檬酸，用純凈水定容至100 mL，即100 mL中木糖醇用量分別為2，4，6，8，10 g，按此方法分別制成的靈芝發(fā)芽糙米蒲公英復(fù)合飲料進(jìn)行感官評(píng)定，確定最佳的木糖醇添加量。

（4）檸檬酸添加量的確定。以添加量0.005%，0.010%，0.015%，0.020%，0.025%的檸檬酸都分別添加40%發(fā)酵液，0.45%蒲公英提取物，4%木糖醇，用純凈水定容至100 mL，即100 mL中檸檬酸用量分別為0.005，0.010，0.015，0.020，0.025 g，按此方法分別制成的靈芝發(fā)芽糙米蒲公英復(fù)合飲料進(jìn)行感官評(píng)定，確定最佳的檸檬酸添加量。

1.3.7 正交優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)L9（34）對(duì)靈芝發(fā)芽糙米蒲公英復(fù)合飲料的配方進(jìn)行篩選，以靈芝發(fā)芽糙米蒲公英復(fù)合飲料的感官評(píng)分作為考查指標(biāo)，通過后期的正交試驗(yàn)考查各個(gè)因素相互之間的影響，確定靈芝發(fā)芽糙米蒲公英復(fù)合飲料的最佳配方。

靈芝發(fā)芽糙米蒲公英復(fù)合飲料正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 靈芝發(fā)芽糙米蒲公英復(fù)合飲料正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)/%

1.3.8 穩(wěn)定劑的選擇試驗(yàn)

穩(wěn)定劑可以抑制因重力作用而沉淀的大分子顆粒下沉，一定程度上讓產(chǎn)品長(zhǎng)時(shí)間保持均一和穩(wěn)定。試驗(yàn)中選擇飲料加工常用的海藻酸鈉、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）2種穩(wěn)定劑，以不同的復(fù)配比例按照0.3%添加量進(jìn)行試驗(yàn)，確定穩(wěn)定劑的最佳添加量。

1.3.9 產(chǎn)品感官品質(zhì)評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

按照感官綜合評(píng)分方法，隨機(jī)選取10名具有食品專業(yè)背景和感官評(píng)定經(jīng)驗(yàn)的品鑒人員對(duì)靈芝發(fā)芽糙米蒲公英復(fù)合飲料樣品進(jìn)行隨機(jī)感官評(píng)價(jià)，以其平均分作為該復(fù)合飲料的總感官評(píng)分。

感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

1.3.10 產(chǎn)品理化及微生物質(zhì)量評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

（1）理化檢驗(yàn)。鋅測(cè)定，參考《GB 5009.14—2017食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鋅的測(cè)定》；銅測(cè)定，參考《GB 5009.13—2017食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中銅的測(cè)定》；鐵測(cè)定，參考《GB 5009.90—2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中鐵的測(cè)定》；氰化物測(cè)定，參考《GB 5009.36—2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中氰化物的測(cè)定》；靈芝多糖檢測(cè)采用苯酚-硫酸比色法[15]；γ-氨基丁酸采用苯酚-次氯酸鈉比色法[16]。

（2）微生物檢驗(yàn)。菌落總數(shù)按《GB 4789.2—2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》計(jì)數(shù)；大腸菌群按《GB 4789.3—2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》中規(guī)定的方法計(jì)數(shù)；霉菌、酵母按《GB 4789.15—2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母》計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵液添加量對(duì)飲料品質(zhì)的影響

發(fā)酵液添加量對(duì)靈芝發(fā)芽糙米蒲公英復(fù)合飲料品質(zhì)的影響見圖1。

圖1 發(fā)酵液添加量對(duì)靈芝發(fā)芽糙米蒲公英復(fù)合飲料品質(zhì)的影響

由圖1可知，隨著發(fā)酵液添加量的增大，靈芝發(fā)芽糙米蒲公英復(fù)合飲料的感官評(píng)分逐漸增加，當(dāng)添加量為40%時(shí)，飲料的感官評(píng)分到達(dá)最高，考慮可能是在發(fā)酵液添加量不足時(shí)，飲料溶液的稀釋比較大，受到其他因素的影響較大，不足以凸顯發(fā)酵液的特殊風(fēng)味，其次在低添加量時(shí)，靈芝的有效成分含量不足，無法顯現(xiàn)出保健功能。而在發(fā)酵液添加量大于50%時(shí)，由于發(fā)酵液本身具有的苦澀感無法被其他因素所掩蓋，而使飲料的感官評(píng)分下降，說明添加量過高對(duì)感官評(píng)定人員來說認(rèn)可度不高，所以綜合考慮選擇添加量30%，40%，50%作為正交試驗(yàn)的因素水平。

2.2 蒲公英提取物添加量對(duì)飲料品質(zhì)的影響

蒲公英提取物添加量對(duì)靈芝發(fā)芽糙米蒲公英復(fù)合飲料品質(zhì)的影響見圖2。

由圖2可知，隨著蒲公英提取物添加量的增大，靈芝發(fā)芽糙米蒲公英復(fù)合飲料的感官評(píng)分逐漸增加，當(dāng)添加量為0.35%時(shí)，飲料的感官評(píng)分到達(dá)最高，當(dāng)添加量較低時(shí)不足以彰顯蒲公英的特殊風(fēng)味與香氣，色澤也較淡，而當(dāng)添加量較高時(shí)，蒲公英苦澀味明顯，飲料顏色呈現(xiàn)明顯的棕黑色和深棕色，不符合大部分感官評(píng)定人員的一般口味。蒲公英提取物經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮和真空冷凍干燥，提取物中風(fēng)味物質(zhì)濃度比較大，對(duì)飲料的色澤和香氣影響較大，所以適量添加才更符合大眾對(duì)飲料的基本要求。因此，綜合考慮選擇添加量0.35%，0.45%，0.55%作為正交試驗(yàn)的因素水平。

圖2 蒲公英提取物添加量對(duì)靈芝發(fā)芽糙米蒲公英復(fù)合飲料品質(zhì)的影響

2.3 木糖醇添加量對(duì)飲料品質(zhì)的影響

木糖醇添加量對(duì)靈芝發(fā)芽糙米蒲公英復(fù)合飲料品質(zhì)的影響見圖3。

圖3 木糖醇添加量對(duì)靈芝發(fā)芽糙米蒲公英復(fù)合飲料品質(zhì)的影響

由圖3可知，隨著木糖醇添加量的增大，靈芝發(fā)芽糙米蒲公英復(fù)合飲料的感官評(píng)分先增加后較為平緩地逐漸降低，先增加的原因在于檸檬酸定量時(shí)，適當(dāng)增大木糖醇添加量，可達(dá)到適宜的飲料糖酸比，而后逐漸下降。分析原因?yàn)槌康哪咎谴紝?duì)飲料糖酸比影響較大，甜味過高會(huì)直接影響飲料的總體滋味，也會(huì)增加飲料的制作成本。由于木糖醇本身的甜度是蔗糖的1.2倍，差異度不大，但是木糖醇溶解時(shí)會(huì)吸收大量的熱量，故會(huì)產(chǎn)生一種爽口的感覺，對(duì)飲料的滋味具有改善作用，但是攝入量過大會(huì)造成腹瀉等風(fēng)險(xiǎn)，所以綜合考慮選擇添加量2%，4%，6%作為正交試驗(yàn)的因素水平。

2.4 檸檬酸添加量對(duì)飲料品質(zhì)的影響

檸檬酸添加量對(duì)靈芝發(fā)芽糙米蒲公英復(fù)合飲料品質(zhì)的影響見圖4。

由圖4可知，檸檬酸添加量相對(duì)較少，但是感官評(píng)分趨勢(shì)變化較大，隨著檸檬酸添加量的增大，靈芝發(fā)芽糙米蒲公英復(fù)合飲料的感官評(píng)分先增加后呈直線降低，先增加的原因在于木糖醇的固定時(shí)，適當(dāng)增加檸檬酸添加量，可以使飲料滋味達(dá)到合適酸甜度，而后稍有增大檸檬酸添加量，便會(huì)使飲料的酸感明顯；同時(shí)，由于檸檬酸的酸感不太柔和，再加上蒲公英提取物中含有一些酸性物質(zhì)，結(jié)果造成飲料的酸感突出，使飲料的感官評(píng)分呈直線下降。因此，綜合考慮選擇添加量0.005%，0.010%，0.015%作為正交試驗(yàn)的因素水平。

圖4 檸檬酸添加量對(duì)靈芝發(fā)芽糙米蒲公英復(fù)合飲料品質(zhì)的影響

2.5 靈芝發(fā)芽糙米蒲公英復(fù)合飲料最佳配方的確定

靈芝發(fā)芽糙米蒲公英復(fù)合飲料正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 靈芝發(fā)芽糙米蒲公英復(fù)合飲料正交試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，影響靈芝發(fā)芽糙米蒲公英復(fù)合飲料感官評(píng)分的主次因素為蒲公英提取物添加量（B）〉檸檬酸添加量（D）〉發(fā)酵液添加量（A）〉木糖醇添加量（C）。由此可見，蒲公英添加量對(duì)飲料的感官評(píng)分的影響顯著性較大，得到的最優(yōu)組合為A2B2C2D1，并不在正交試驗(yàn)的9組試驗(yàn)中，但是通過超過3次的驗(yàn)證試驗(yàn)，其感官評(píng)分每次都高于任何一組的試驗(yàn)結(jié)果，感官評(píng)分得到88分。最終確定靈芝發(fā)芽糙米蒲公英復(fù)合飲料的最佳配方為發(fā)酵液添加量20%，蒲公英添加量0.35%，木糖醇添加量4%，檸檬酸添加量0.005%。

靈芝發(fā)芽糙米蒲公英復(fù)合飲料方差分析結(jié)果見表4。

由表4可知，蒲公英添加量和檸檬酸添加量對(duì)靈芝發(fā)芽糙米蒲公英復(fù)合飲料的顯著性較大，所以確定最佳組合時(shí)才需要考慮飲料中蒲公英和檸檬酸的最適添加量。

表4 靈芝發(fā)芽糙米蒲公英復(fù)合飲料方差分析結(jié)果

2.6 穩(wěn)定劑對(duì)產(chǎn)品穩(wěn)定性的影響

試驗(yàn)參照單垣愷等人[17]方法略作修改，將飲料常用的穩(wěn)定劑CMC-Na與海藻酸鈉進(jìn)行復(fù)配，加0.3%于飲料中，并比較了不同復(fù)配比例對(duì)飲料穩(wěn)定效果。

不同穩(wěn)定劑對(duì)靈芝發(fā)芽糙米蒲公英復(fù)合飲料穩(wěn)定性影響見表5。

表5 不同穩(wěn)定劑對(duì)靈芝發(fā)芽糙米蒲公英復(fù)合飲料穩(wěn)定性影響

由表5可知，CMC-Na與海藻酸鈉按照1∶2比例進(jìn)行復(fù)配，形成的穩(wěn)定劑對(duì)復(fù)合飲料穩(wěn)定效果最佳，因而，在復(fù)合飲料加工過程中，選擇0.1%CMC-Na和0.2%海藻酸鈉作為復(fù)配穩(wěn)定劑。

2.7 靈芝發(fā)芽糙米蒲公英復(fù)合飲料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

2.7.1 感官指標(biāo)

香氣：有靈芝和蒲公英的特殊香氣，無異香，無臭味；滋味：有靈芝和蒲公英的應(yīng)有滋味，無雜味，異味；色澤：具有清亮的棕褐色或淡咖啡色，溶液成半透明狀；狀態(tài)：均勻一致，有一定黏度，無雜質(zhì)，無沉淀。

2.7.2 產(chǎn)品理化指標(biāo)

鋅、銅、鐵總和15 mg/L，氰化物（以HCN計(jì)）0.02 mg/L，酸度pH值5.2，可溶性固形物3.1%，γ-氨基丁酸131.62 mg/L，靈芝多糖0.922 mg/L。

2.7.3 產(chǎn)品微生物指標(biāo)

細(xì)菌總數(shù)40 CFU/mL，大腸桿菌總數(shù)6 MPN/mL，霉菌總數(shù)12 CFU/mL，酵母總數(shù)9 CFU/mL，致病菌未檢出。

3 結(jié)論

以研制出一款色香味形較佳的靈芝發(fā)芽糙米蒲公英復(fù)合飲料為試驗(yàn)?zāi)康?，將發(fā)酵液添加量、蒲公英提取物添加量、木糖醇添加量、檸檬酸添加量作為4個(gè)因素考查，以感官評(píng)分作為評(píng)定指標(biāo)，最終通過正交試驗(yàn)，得到產(chǎn)品的最佳配方為發(fā)酵液添加量40%，蒲公英提取物添加量0.35%，木糖醇添加量4%，檸檬酸添加量0.005%。此外，復(fù)配穩(wěn)定劑添加量為0.3%（羧甲基纖維素鈉與海藻酸鈉之比為1∶2）時(shí)，靈芝發(fā)芽糙米蒲公英復(fù)合飲料穩(wěn)定性最佳。由此配比制得的靈芝發(fā)芽糙米蒲公英復(fù)合飲料，具有濃郁的靈芝與蒲公英的特殊香氣，風(fēng)味獨(dú)特，色澤黃褐。該飲料的各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)均達(dá)到國(guó)家的標(biāo)準(zhǔn)，符合當(dāng)代消費(fèi)者對(duì)安全、營(yíng)養(yǎng)、綠色、功效食品的要求。