液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜非靶向篩查玉米粉和小麥粉中35種真菌毒素

張淑霞，劉勝男，祝偉霞，封 琳，田 亞，宋麗亞，邢榮花

(鄭州海關技術中心，鄭州 450000)

隨著檢測技術的發(fā)展，真菌毒素的檢測方法和手段越來越多。目前有關糧食及其制品中真菌毒素的檢測主要有光譜法、酶聯(lián)免疫法(ELISA)、膠體金快速檢測法、高效液相色譜法(HPLC)[1-5]等。本研究采用超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道離子阱質譜法建立小麥粉和玉米粉中35 種典型真菌毒素的篩查方法，采集了標準物質化合物色譜信息，通過高分辨質譜正負離子切換FullMS/ddMS2掃描方式分析，獲得多種真菌毒素的保留時間、一級母離子和二級碎片離子精確質量數，建立了35種真菌毒素標準數據庫，并完成裂解途徑解析與特征碎裂片段篩選； 采用數據非依賴掃描，獲取可追溯的樣品質譜信息，建立非定向篩查方法。該方法具有前處理簡單、檢測時間短、靈敏度和準確度高的優(yōu)勢，適用于大批量糧食及其制品中多種真菌毒素的快速篩查。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與設備

Milli-Q超純水凈化系統(tǒng)，美國Millipore公司； Hettich Rotofix 32A離心機，德國Hettich公司；S10H型超聲波清洗器，德國Elma公司；Heidolph multi reax多功能振蕩器，德國 Heidolph公司；液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱質譜(HPLC-Q-Exactive配Ultimate 3000液相色譜)，美國Thermo Fisher公司。

1.2 試劑與材料

甲醇、乙腈(色譜純，德國Merck公司)；甲酸(色譜純，美國 ACS 恩科化學公司)；乙酸銨(色譜純，美國ThermoFisher Scientific公司)；35種真菌毒素混合標準儲備液(濃度均為10 mg/L，天津阿爾塔科技有限公司)(表1)。玉米、小麥粉，購于當地農貿市場或超市。

表1 35種真菌毒素標準數據庫信息

1.3 方法

稱取2.0 g樣品于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈-水-甲酸(84:15:1)混合提取溶液，超聲提取10 min，加入3 g無水硫酸鎂、1 g氯化鈉渦旋振蕩1 min，4 000 r/min離心5 min，移取4 mL上層溶液至試管，在40℃水浴下氮氣吹干，最后加入1 mL甲醇-水-甲酸(30+70+0.1)超聲溶解1 min，渦旋振蕩1 min，過0.22 μm有機系微孔濾膜，供HPLC-Q/Exactive測定。

1.4 基質匹配溶液的配制

按照樣品的前處理方法處理2種不同基質的空白樣品，得空白基質溶液，取混合標準儲備液，用空白基質溶液將其逐級稀釋，得到混合標準曲線溶液。

1.5 分析條件

1.5.1 色譜條件 35種真菌毒素依據其化學性質在正、負離子模式下同時進行數據采集，色譜條件如下：色譜柱：ACQUITY UPLC HSS C18 SB色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；柱溫：35℃；流動相A為0.1%(體積分數)甲酸-1 mmol/L乙酸銨水溶液；流動相B為甲醇。色譜梯度為：0～2 min，10% B相；2～4 min，10% B～20% B相；4～5 min，20% B～26% B相；5～7 min，26% B相；7～10.5 min，26% B～60% B相；10.5～13.5 min，60% B相；13.5～14.5 min，60% B～95% B相；14.5～17 min，95% B相；17～18 min，95% B～10% B相；18～21 min，10% B相。流速：0.3 mL/min；進樣體積：5 μL。

1.5.2 質譜條件 噴霧電壓：3 500 V；毛細管溫度：320℃；離子源加熱溫度：300℃；鞘氣流量：30 Arb，輔助氣流量10 Arb；質譜掃描模式：Full MS/ddMS2(TopN)；全掃描分辨率：70 000 FWHM；AGC target：3e6；一級Maximum IT：100 ms，掃描范圍：70～800 m/z；二級分辨率：17 500 FWHM；AGC target：1e5；TopN：5；進樣時間50 ms；當待碎裂的離子響應強度達到強度閾值2e4時，即送往高能碰撞解離碰撞池(HCD)進行碰撞，碰撞池能量分別為17.5、35.0、52.5 eV。

1.5.3 數據分析 對質譜采集到的原始.RAW圖譜文件，采用XCaliber 2.0、TraceFinder 3.1數據處理系統(tǒng)和Msaa Frontier 7.0軟件進行數據分析。

2 結果與討論

2.1 前處理方法的優(yōu)化

甲醇和乙腈是目前常用的提取溶劑，由于甲醇溶解性強，易將樣品中的酸、蛋白、脂肪等物質提取出來，而乙腈對不同極性的真菌毒素均有較好的溶解性，且其可沉淀蛋白，共提物較少，因此選用乙腈作為提取劑。由于35種真菌毒素大部分為中性和酸性物質，提取溶液的pH值會影響真菌毒素的解離狀態(tài)，進而影響其回收率，加入1%甲酸能抑制待測酸性物質離子化使其更多地溶于有機相，同時考慮真菌毒素的極性問題，選擇乙腈:水:甲酸(84:15:1)作為提取溶劑。

2.2 質譜條件的優(yōu)化

配制35種真菌毒素混合標準工作液，采用高分辨質譜正負離子切換FullMS/ddMS2掃描方式分析，根據目標物分子式在正負模式和不同加合方式下分別計算精確質量數，提取離子色譜圖，比較待測物在正負離子模式下的響應強度和不同加合方式下的響應強度。研究發(fā)現，玉米赤霉烯酮、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇在負離子模式下響應高，母離子均為[M-H]-；T-2毒素、HT-2毒素、15-乙?；撗跹└牭毒┐肌⑸咝尉睾托虑巡＄牭毒┐荚谡x子模式下響應高，母離子為[M+NH4]+；疣孢青霉原和T-2三醇的母離子為[M+Na]+；其余目標物則均為[M+H]+模式信號更強。選擇質譜信號響應最佳的加合離子作為定量離子進行分析，通過綜合考慮母離子精確質量數、保留時間和二級碎片離子等相關信息進行篩查確證，母離子峰面積定量，確保定性定量結果的準確性，35種真菌毒素相應的提取離子色譜圖見圖1。

圖1 35種真菌毒素提取離子色譜圖

2.3 二級碎片離子的選擇

將從ChemSpider化學數據庫官網上下載的35種真菌毒素的結構式導入Mass Frontier 7.0軟件進行模擬碎裂，研究其碎裂機理，并將結構與采集的目標物的二級碎片進行匹配，選擇質荷比較大且響應較高的碎片離子為35種真菌毒素的特征碎片離子。以黃曲霉毒素G2為例，該化合物的裂解過程主要為電荷中心誘導的鍵斷裂(i斷裂)、電子遷移反應和遠端重排反應(rHR)，脫去1個O后形成m/z313.070 66的碎裂片段(圖2)。圖3為采集的黃曲霉毒素G2的二級質譜圖，紅色代表由Mass Frontier預測的碎片匹配，因此選取m/z313.070 41、m/z285.075 47和m/z245.080 81為其特征碎片離子。

圖2 黃曲霉毒素G2的部分碎裂途徑及其產生的碎裂片段

圖3 黃曲霉毒素G2的二級碎片離子與預測生成的碎片離子匹配圖

2.4 數據庫的建立及篩查確證方法參數設定

配制質量濃度為500 μg/L的35種真菌毒素混合標準工作液，采用Full MS/dd-MS2掃描模式采集真菌毒素標準品的質譜圖，通過一級全掃描模式確定待測物母離子的精確質量數和保留時間，同時通過自動觸發(fā)，設定3種不同碰撞能對強度大于2e4的母離子進行碰撞，獲得豐富的二級碎片離子的質荷比信息，構建了目標物的篩查譜庫，在本實驗儀器條件下35種真菌毒素標準數據庫信息見表1。

2.5 定性分析與篩查結果判斷

采用1.3的實驗方法進行樣品測定，在5 ppm質量窗口范圍內進行化合物提取，當滿足母離子精確質量數的質量偏差≤5×10-6、碎片離子精確質量數的質量偏差≤10×10-6、保留時間偏差≤30 s、目標物信號響應S/N≥3、目標物同位素豐度比偏差≤30%，且二級譜圖和高分辨質譜數據庫相比，可以匹配上一級母離子和至少一個二級碎片離子等條件，且無空白基質干擾，則可判斷樣品中可能檢出目標物。以脫氧雪腐鐮刀菌烯醇篩查為例，其提取離子流色譜圖見圖4A，由該圖可知脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的精確質量數偏差<5 ppm，保留時間偏差為3.6 s。母離子同位素分布見圖4B，同位素比值與脫氧雪腐鐮刀菌烯醇理論同位素分布匹配度為100%。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的3個二級碎片離子精確質量誤差小于0.000 01Da，結果見圖4C。由此判斷樣品中含有脫氧雪腐鐮刀菌烯醇。

圖4 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇篩查分析圖

2.6 定量分析方法的驗證

方法以母離子作為定量離子，空白基質標準曲線外標法定量。用基質空白溶液逐級稀釋標準溶液至儀器能夠檢出的最低濃度為方法的檢出限，如表2所示，35種真菌毒素在各自線性濃度范圍內線性良好，相關系數R2均大于0.99，其檢出限滿足我國真菌毒素限量規(guī)定指標。選擇玉米粉和小麥粉的空白樣品，分別添加20 μg/kg濃度水平的標準溶液，按照樣品處理方法進行3次重復性試驗，回收率在60.1%～115.6%之間，變異系數在1.6%～18.2%之間，真菌毒素的回收率和變異系數均符合GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規(guī)范 食品理化檢測》的要求。

表2 35種真菌毒素的線性范圍、檢出限、相關系數、平均回收率及相對標準偏差(n=3)

2.7 實際樣品測定

采用所建立的方法篩查10個不同品種的玉米粉和小麥粉中的真菌毒素，其中4個樣品檢出了伏馬毒素B1，含量為17～417 μg/kg，其中3個樣品還同時檢出了伏馬毒素B2和伏馬毒素B3，含量均約為33 μg/kg；10個樣品均檢出了脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，含量為17～220 μg/kg，4個樣品同時檢出了15-乙?；撗跹└牭毒┐己?-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，含量為3～28 μg/kg，1個樣品檢出了玉米赤霉烯酮，含量約為6.8 μg/kg，其余真菌毒素均為未檢出。檢測結果提示，市售的玉米粉和小麥粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇檢出率較高，但小于GB 2761—2017《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》規(guī)定的限量值，但仍應給予持續(xù)關注。

3 結論

本研究構建了玉米粉和小麥粉中35種真菌毒素的篩查數據庫，建立了基于液相色譜-四極桿/軌道阱質譜技術同時測定玉米粉和小麥粉中35種真菌毒素的篩查確證和定量分析方法。與傳統(tǒng)的液質聯(lián)用方法相比，本文建立的方法可實現正負離子模式同時掃描，具有分析速度快、靈敏度高、質量精度高的特點，且方法線性范圍、檢出限、回收率及精密度滿足標準要求，可用于多種真菌毒素的篩查確證和定量檢測，為真菌毒素污染風險監(jiān)測和評估提供有效的技術支撐。