pH響應型聚合物Eudragit L-100固定化阿魏酸酯酶產阿魏酸的研究

王凱鵬，鄭晶瑩，徐雪陽，丁怡玲，呂永梅，劉金彬，余曉紅，靳文斌

(鹽城工學院 海洋與生物工程學院，江蘇 鹽城，224051)

阿魏酸(ferulic acid, FA)是植物組織中含量最豐富的酚酸之一，以單體或二聚體的形式通過酯鍵或醚鍵與木質素和多糖共價連接[1]。由于FA是具有不飽和側鏈的酚酸，使其擁有強大的抗氧化能力，具有很高的商業(yè)價值[2]。美國食品藥品監(jiān)督管理局在食品添加劑清單中將FA列為抗氧化劑[3]。除此之外，F(xiàn)A在食品工業(yè)中還被用作防腐劑、風味前體、膠凝劑、增稠劑[4]。目前工業(yè)上通常采用堿液浸提法制備FA，即在高溫下堿液裂解原料的空間結構，使FA釋放出來，然后加入有機溶劑進行提取。但是該法生產過程中產生大量廢水廢渣，造成了大量環(huán)境污染[5]。而酶解法反應條件溫和且綠色環(huán)保，因此受到研究者的廣泛關注。

阿魏酸酯酶(E.C.3.1.1.73)，又稱肉桂酸酯酶，該酶能水解FA與半纖維素或木質素之間的酯鍵，從植物細胞壁釋放FA及其二聚體，通常被用作水解木質纖維素產FA。例如XU等[6]分離到一株阿魏酸酯酶的生產菌，在大腸桿菌中異源表達，純化的阿魏酸酯酶分解0.2 g脫淀粉麥麩可產生199 μg FA，具有巨大的應用潛力。但是市場上的商用阿魏酸酯酶稀缺，而且游離阿魏酸酯酶易失活，難以回收利用限制了其工業(yè)化應用[7]。固定化酶具有可循環(huán)利用、快速分離的特點，可以很好的解決這類問題。HE等[8]使用磁性納米顆粒固定化阿魏酸酯酶生產FA，與游離酶相比，固定化酶明顯提高了最適反應溫度和熱穩(wěn)定性，但是用于催化脫淀粉麥麩產FA時表現(xiàn)出較低的產物得率，主要是因為固定化酶與不溶性底物的接觸性較差。

Eudragit L-100是一種由甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯組成的pH響應型聚合物，當溶液pH<4.0時，該聚合物不溶于水；當溶液pH>6.0時該聚合物溶于水[9]。因此，在一定的pH范圍內，Eudragit L-100可與游離酶結合形成可溶性固定化酶用于催化反應，反應結束后，通過降低溶液pH值，將固定化酶從反應體系中分離出來[10]。該類型固定化酶用于催化反應尤其是作用于不溶性底物時，表現(xiàn)出較好的催化效果。例如YU等[11]在Eudragit L-100上共固定化3種酶(纖維素酶、葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶)，降解玉米秸稈中纖維素產葡萄糖酸，葡萄糖酸的產率為61.41%，6次循環(huán)后其活性仍保持52.38%。

近年來，隨著對FA及其衍生物的研究越來越多，對于阿魏酸酯酶的研究也隨之增加。針對固定化阿魏酸酯酶與不溶性的木質纖維素接觸較差，難以與殘留的固體底物完全分離這一問題，我們擬采用pH響應型聚合物Eudragit L-100固定化阿魏酸酯酶，探究其用于降解脫淀粉麥麩產FA的可行性。首先，對固定化酶的反應條件(交聯(lián)劑濃度、固定化pH、固定化時間、反應溫度等參數(shù))進行優(yōu)化，確定最佳固定化酶條件。其次，研究固定化后對阿魏酸酯酶酶學性質的影響。最后，采用固定化酶降解脫淀粉麥麩產FA，研究其催化性能。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

阿魏酸酯酶，Megazyme (Bray, Co.Wicklow, Ireland)；FA、阿魏酸甲酯(ferulic acid methyl ester, MFA)、Eudragit L-100、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽[1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide，EDC]，上海麥克林生化有限公司。

安捷倫1260高效液相色譜系統(tǒng)(紫外檢測器)，美國安捷倫科技有限公司；Nicolet iS 10傅里葉變換紅外光譜儀(Fourier transform infrared spectroscopy, FT-IR)，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；FEI Nova Nano SEM 450掃描電子顯微鏡，美國FEI公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 Eudragit L-100固定化酶

稱取5 g Eudragit L-100至90 mL蒸餾水中，緩慢滴加3 mol/L NaOH調節(jié)pH至11.0，待完全溶解后，再緩慢滴加3 mol/L HCl調節(jié)pH至6.0，超聲處理10 min，定容至100 mL，4 ℃貯存[11]。取一定濃度的EDC溶解于Eudragit L-100溶液(10 mL)中，攪拌10 min后，將阿魏酸酯酶(6 U)加入上述溶液中，室溫攪拌一定時間，用濃度為100 mmol/L醋酸緩沖液調節(jié)pH至4.0進行沉淀，然后在4 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min，再用pH 4.0的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液洗滌，最后將沉淀溶于10 mL 0.1 mol/L的PBS緩沖液(pH 6.0)中留作備用。

1.2.2 Eudragit L-100固定化酶形態(tài)和結構表征

采用掃描電鏡對Eudragit L-100固定化酶前后的形態(tài)特征進行表征。采用FT-IR對固定化酶進行結構鑒定。

1.2.3 阿魏酸酯酶活性測定

以1 mmol/L MFA溶液為底物，測定阿魏酸酯酶的酶活力。底物原液(950 μL)在40 ℃保溫10 min，加入稀釋后的酶液(50 μL)開始反應。將混合物在40 ℃下保溫5 min，然后煮沸5 min，終止反應。采用高效液相色譜法測定釋放阿魏酸的含量，酶活性單位定義為每分鐘釋放1 μmol FA所需的量[1]。

1.2.4 固定化阿魏酸酯酶最適反應溫度

50 μL固定化阿魏酸酯酶分別與950 μL 1 mmol/L MFA溶液在溫度為20、30、40、50、60 ℃條件下反應5 min，100 ℃煮沸5 min，高效液相色譜測定阿魏酸酯酶的催化活性，將固定化阿魏酸酯酶的最高酶活力分別定義為100%，計算不同溫度下固定化酶的相對酶活力。

1.2.5 固定化阿魏酸酯酶最適反應pH測定

50 μL固定化阿魏酸酯酶分別與950 μL pH為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的1 mmol/L MFA溶液反應5 min，100 ℃煮沸5 min，用高效液相色譜測定酶的催化活性，將固定化阿魏酸酯酶的最高酶活力定義為100%，計算不同pH值下固定化酶的相對酶活力。

1.2.6 固定化阿魏酸酯酶熱穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性測定

測定固定化酶熱穩(wěn)定性，將固定化阿魏酸酯酶在30～70 ℃的PBS緩沖液(pH 6.0)中孵育1 h，然后測定其活性。測定固定化酶pH穩(wěn)定性，將固定化阿魏酸酯酶置于40 ℃、pH 5.0～9.0的PBS緩沖液中孵育1 h，然后測定阿魏酸酯酶活性。

1.2.7 游離酶與固定化酶動力學參數(shù)測定

一定量的游離酶與固定化酶分別添加到一系列不同濃度MFA(0.25～10 mmol/L)的反應液中，在最適溫度與最適pH下測定酶活力，使用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作曲線計算出Km和Vmax值[12]。

1.2.8 固定化阿魏酸酯酶貯藏穩(wěn)定性測定

取游離酶與固定化阿魏酸酯酶，4 ℃冰箱放置，每隔7 d取50 μL游離酶與固定化酶測定其活性。

1.2.9 固定化阿魏酸酯酶可重復使用性測定

取10 mg/mL脫淀粉麥麩溶液，加入固定化酶在40 ℃、200 r/min的搖床上進行分解反應，12 h為1個循環(huán)。每次循環(huán)結束后，以8 000 r/min的速度離心使固定化阿魏酸酯酶與反應殘余固體底物分離。然后收集含有固定化酶的上清液，將混合物的pH值調至4.0實現(xiàn)固定化酶的析出，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，去掉上清液，pH 4.0的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液洗滌，進入下一輪反應，以此類推，重復使用5次[13]。

2 結果與分析

2.1 阿魏酸酯酶固定化參數(shù)的優(yōu)化

在制備固定化酶的過程中，固定化時間、交聯(lián)劑濃度、反應溫度和固定化pH等因素都會影響酶的固定化，因此分別對這些參數(shù)進行優(yōu)化。以加入的酶活性為總酶活性，固定化后的酶活性為剩余酶活性計算相對酶活性。

首先，研究了固定化時間對固定化酶活性的影響。如圖1-a所示，隨著固定化時間的延長，固定化酶的活性逐漸增加，并在固定化時間為1 h時達到峰值，隨著固定化時間的延長，酶活性略有下降。

如圖1-b所示，低濃度的EDC可能不能有效地激活Eudragit L-100上的羧基，因此使得固定化酶的活性較低。當EDC質量濃度為5 g/L時，固定化酶活性最高，由于基團活化已達到飽和，固定化酶的活性隨EDC濃度的繼續(xù)增加而略有下降。同時研究了固定化溫度對固定化酶活性的影響，如圖1-c所示，固定化酶活性在25 ℃時達到最大值，隨著固定化溫度的升高，固定化酶的活性略有下降。阿魏酸酯酶在Eudragit L-100上的固定化受pH的影響很大，如圖1-d所示，固定化的阿魏酸酯酶活性隨著pH從4.0增加到6.0而增加，并且在pH 6.0時達到最大值。當pH超過6.0時，固定化酶活性降低。原因可能是低pH值和高pH值的反應溶液使酶失活。載體在與交聯(lián)劑進行交聯(lián)反應后，會產生大量游離的OH-，使得溶液中pH值升高，而游離酶在高pH值情況下會損失部分酶活性(圖5-b)，因此會導致固定酶活性損失。

a-固定化時間;b-EDC質量濃度;c-固定化溫度;d-固定化pH

2.2 固定化前后的形態(tài)和結構特性

a-Eudragit L-100;b-固定化酶

進一步采用掃描電子顯微鏡觀察固定化酶形貌變化(圖3)，未改性Eudragit L-100共聚物的形態(tài)排列緊密，分布均勻，共聚物表面圓滑，呈球形(圖3-a)。Eudragit L-100載體對阿魏酸酯酶進行共價改性后，共聚物變得高度均一，蛋白膜表面粗糙空洞(圖3-b)。這是由于Eudragit L-100載體與蛋白酶分子共價交聯(lián)，導致共聚物分子與酶分子鍵合牢固。在冷凍干燥過程中，蛋白質分子相互作用，在蛋白質表面形成膜和孔，共聚物被包埋在蛋白質分子中，分布較為均勻，呈現(xiàn)出新的形態(tài)特征[11]。

a-Eudragit L-100;b-固定化酶

2.3 固定化酶最適反應溫度與最適反應pH

為確定固定化酶的最適反應溫度和pH值，在不同的溫度和pH值下進行催化反應。首先研究溫度對酶活性的影響，如圖4-a所示，游離阿魏酸酯酶和固定化酶在40 ℃下均表現(xiàn)出最佳催化活性。此外，固定化酶在更大范圍內保持了比游離阿魏酸酯酶更高的相對活性。游離阿魏酸酯酶活性在40 ℃以上迅速下降，在60 ℃保持83%的殘留活性。然而，固定化酶在60 ℃仍保持92%的殘余活性。原因可能是載體與酶分子之間的多點共價連接會降低酶的構象靈活性[10,16]。

a-最適溫度;b-最適pH

在pH為5.0～9.0，溫度為40 ℃條件下，研究pH對酶活性的影響，如圖4-b所示，游離阿魏酸酯酶和固定化酶的最適反應pH值分別為7.0和8.0。此外與游離酶相比，固定化酶在更大pH范圍內表現(xiàn)出更高的相對活性。根據(jù)文獻報道，有些酶在固定化后最適反應pH發(fā)生了改變[17-18]。此外通過共價結合固定酶的pH值范圍更廣。

2.4 固定化酶熱穩(wěn)定性與pH穩(wěn)定性

因為酶分子容易失活，因此考察固定化酶的穩(wěn)定性非常重要。如圖5-a所示，在30～70 ℃研究固定化酶的熱穩(wěn)定性。50 ℃保溫1 h后，固定化酶的殘留活性為50%。而游離阿魏酸酯酶在相同條件下只有30%的殘留活性。經相同時間的70 ℃熱處理后，固定化酶和游離酶的殘余活性分別約為28%和2%。結果表明，固定化酶的熱穩(wěn)定性優(yōu)于游離酶。這可能是由于載體與酶分子之間的多點共價鍵連接使酶的構象靈活性降低所致[19]。

a-熱穩(wěn)定性;b-pH穩(wěn)定性

同時本文還研究了pH對固定化酶穩(wěn)定性的影響，如圖5-b所示，40 ℃保溫1 h后，游離酶和固定化酶均能在pH 8.0時保持最大活性，殘余活性分別為52%和61%。然而固定化酶在pH 5.0～9.0具有更高的穩(wěn)定性，在pH 9.0時殘留的酶活性保持近56%，而游離酶活性保持了28%。原因很可能是載體對酶分子的活性位點進行了保護[20]。

2.5 固定化酶動力學參數(shù)

如表1所示，固定化酶的Km值與Vmax值是游離酶的1.6倍與8.9倍，固定化酶的kcat值則是游離酶的14.5倍，酶的催化活性以kcat/Km表示，游離酶為0.125 L/(mmol·min)，固定化酶為1.13 L/(mmol·min)，與游離酶相比，固定化酶的Vmax值增大，Km也有所增加，kcat/Km值增加了9.04倍，動力學參數(shù)的這些變化說明固定化后，酶的催化反應效率提升。這是因為Eudragit L-100分子附著在酶蛋白上，使得固定化酶分子具有高的生物相容性以及親水性，可能會影響到酶表面的水合度，反應條件為均相反應，沒有阻礙底物與酶分子的接觸，同時還抵御了外界環(huán)境的變化，對酶蛋白起保護作用，進而使得催化效率提高[21]。

表1 游離阿魏酸酯酶與固定化阿魏酸酯酶動力學參數(shù)

2.6 固定化阿魏酸酯酶貯藏穩(wěn)定性

如圖6所示，貯存1周時，游離酶與固定化酶的酶活性降低都不明顯，在貯存3周后，游離阿魏酸酯酶僅剩53%活性，而固定化阿魏酸酯酶仍能保持80%以上活性，說明經過固定化后，酶的貯存穩(wěn)定性有所提升，原因可能是(1)固定化后阿魏酸酯酶形成多點共價連接，形成了共價鍵，有效的保護了酶的催化活性中心；(2)阿魏酸酯酶被固定化后限制了酶分子間的相互作用，增加了其貯藏時間。

圖6 固定化酶貯藏穩(wěn)定性

2.7 固定化酶的重復使用性

為研究固定化酶的可重復使用性，對固定化阿魏酸酯酶進行連續(xù)水解脫淀粉麥麩實驗。利用游離阿魏酸酯酶和固定化阿魏酸酯酶，以脫淀粉麥麩為底物水解制備阿魏酸。如圖7所示，固定化酶能產生與游離阿魏酸酯酶幾乎相同的阿魏酸(相同酶活性0.52 U，反應時間12 h，0.1 g脫淀粉麥麩)。固定化酶的阿魏酸釋放量為總阿魏酸的9.3%，游離阿魏酸酯酶為9.8%。相比ZHANG等[22]固定化纖維素酶5次重復后剩余50%活性，阿魏酸酯酶在5次循環(huán)后仍有60%以上活性。重復使用后固定化酶活性的下降可能是(1)洗滌過程中造成了酶的喪失；(2)連續(xù)調節(jié)溶液pH，影響酶的活性部位，使部分酶失活。

圖7 固定化酶的重復使用性能

3 結論

綜上所述，通過共價結合將阿魏酸酯酶固定在可逆的可溶性載體Eudragit L-100上是可行的。在對固定化阿魏酸酯酶形貌及結構進行表征后，優(yōu)化固定化條件，研究了交聯(lián)劑濃度、固定化pH、固定化時間和反應溫度對固定化酶活性的影響。固定化的最佳條件為EDC 5 g/L，pH 6.0，固定化時間1 h，固定化溫度25 ℃。同時研究了固定化酶的最適溫度和pH值，比較后發(fā)現(xiàn)，固定化酶相對于游離酶擁有更高的適用范圍。而且與游離酶相比，固定化酶具有更好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性。同時對固定化酶貯藏穩(wěn)定性進行了研究，在4 ℃貯藏3周后仍保持80%以上活性。此外，以脫淀粉麥麩為底物制備阿魏酸時，固定化酶5次重復使用后仍保持約64%的殘余活性。對于不溶底物的酶解，本文研究的將酶固定化于可逆的可溶載體Eudragit L-100上提供了一個更加簡單有效的方法。