黑曲霉高耐熱葡聚糖酶的分子截短與制備條件優(yōu)化

吳尚武，楊夢(mèng)蓮，沈微*，單逸藍(lán)，王施嵐，楊海泉，夏媛媛，陳獻(xiàn)忠

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院, 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)2(蘇州藥明康德新藥開(kāi)發(fā)有限公司，江蘇 蘇州，215000)

β-葡聚糖廣泛存在于植物細(xì)胞壁中，在大麥、高粱等飼料類作物中有較高的含量。大分子質(zhì)量葡聚糖具有很高的黏度，在飼料中葡聚糖引起的高黏度一方面影響動(dòng)物對(duì)飼料的消化吸收，另一方面造成糞便的高黏度而帶來(lái)環(huán)境衛(wèi)生問(wèn)題[1]。大麥中的葡聚糖主要在啤酒工業(yè)中造成麥汁的高黏度而影響其過(guò)濾[2]。β-葡聚糖酶能降解葡聚糖降低其黏度從而改善麥汁的過(guò)濾性能、提高飼料的消化吸收效率[2]。在啤酒工業(yè)中，β-葡聚糖酶主要在糖化工段中使用，麥汁糖化需要在高溫條件下進(jìn)行，有時(shí)溫度可達(dá)65 ℃以上[3]。飼料中的β-葡聚糖酶主要在動(dòng)物的腸道中發(fā)揮作用，但飼料生產(chǎn)中的造粒過(guò)程卻是一個(gè)高溫過(guò)程[4]。在飼料工業(yè)中，禽類飼料的造粒溫度往往比較高。為了適應(yīng)禽類的攝食習(xí)慣，高質(zhì)量的禽類飼料需要有較高的顆粒穩(wěn)定性。提高飼料顆粒穩(wěn)定性的一個(gè)重要方法是利用高溫使飼料中的淀粉充分糊化，糊化的淀粉在干燥后形成較高的粘結(jié)力從而提高飼料的顆粒穩(wěn)定性。為了實(shí)現(xiàn)淀粉充分糊化，禽類飼料的造粒溫度往往在80 ℃以上[5]。因此高耐熱葡聚糖酶在飼料工業(yè)上有廣闊的應(yīng)用前景，國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)高耐熱葡聚糖酶進(jìn)行了大量探索性的研究[6-9]。本課題組前期工作中從黑曲霉基因組中克隆了一條編碼葡聚糖酶的基因eglA6，該基因表達(dá)產(chǎn)物的耐熱性顯著高于此前報(bào)道的來(lái)源于黑曲霉的葡聚糖酶[10]。之后的研究發(fā)現(xiàn)eglA6在乳酸克魯維酵母中的表達(dá)產(chǎn)物AnEglA6K具有更高的熱穩(wěn)定性，在80 ℃下的酶活力半衰期可達(dá)65 min，能較好的適應(yīng)禽類飼料生產(chǎn)的需要[11]。本文研究通過(guò)截短AnEglA6K分子大幅度提高該基因表達(dá)水平的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

表達(dá)宿主菌乳酸克魯維酵母KluyveromyceslactisGG799、表達(dá)載體pKLAC1，紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司；表達(dá)宿主菌巴斯德畢赤酵母PichiapastorisGS115、表達(dá)載體pPIC9K，Invitrogen公司。用作基因克隆模版的重組質(zhì)粒pPIC9K-eglA6為本課題組前期構(gòu)建[10]，重組大腸桿菌EscherichiacoliJM109/pPIC9K-eglA6已保藏在中國(guó)高校工業(yè)微生物資源信息平臺(tái)，保藏編號(hào)為CICIM B6953。表達(dá)eglA6成熟肽全長(zhǎng)基因的重組菌K.lactispKLAC1-eglA6 SL105[11]，P.pastorisGS115/pPIC9K-eglA6b HB133[10]均為本課題組前期構(gòu)建，用于酶學(xué)性質(zhì)及發(fā)酵性能的比較研究。上述2株重組菌以及本文構(gòu)建的重組菌乳酸克魯維酵母GG799/pKLAC1-eglA6c KlW114和巴斯德畢赤酵母GS115/pPIC9K-eglA6c PpW5均已保藏在中國(guó)高校工業(yè)微生物資源平臺(tái)，保藏編號(hào)分別為CICIM Y7062、CICIM Y1489、CICIM Y7093、CICIM Y7094。

1.1.2 酶及主要試劑

質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA片段回收試劑盒等，康寧生物(吳江)有限公司；DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、核酸電泳marker，寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；引物合成及DNA測(cè)序，蘇州金唯智科技有限公司；微晶纖維素，上海葉源生物科技有限公司；蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量，翌圣生物科技有限公司；大麥葡聚糖、地衣多糖、羧甲基纖維素鈉等，MegaZyme公司；大豆蛋白胨，北京鴻潤(rùn)寶順科技有限公司；大豆蛋白肽，山東佰諾生物科技有限公司；酵母氮基YNB，Difco公司；鎳親和層析填料，無(wú)錫天演技術(shù)有限公司；其余所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

用于酶活力檢測(cè)的底物濾紙為新華濾紙，棉花為醫(yī)用脫脂棉，O/O，為不含碳源和氮源的合成培養(yǎng)基。

1.1.3 培養(yǎng)基與試劑

用于大腸桿菌培養(yǎng)的LB培養(yǎng)基和酵母培養(yǎng)的YPD培養(yǎng)基等同文獻(xiàn)[12]。用于乳酸克魯維酵母重組菌篩選及發(fā)酵的培養(yǎng)基如下：

YCB培養(yǎng)基(g/L)：YNB 3，葡萄糖 5，乙酰胺 0.3。

YPG2培養(yǎng)基(g/L)：半乳糖30，酵母粉10，酪蛋白胨30，KH2PO43，K2HPO4·3H2O 2。充分溶解后用HCl或NaOH調(diào)整pH值至5.5。

YPS培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖30，酵母粉10，酪蛋白胨30，KH2PO43，K2HPO4·3H2O 2。充分溶解后用HCl或NaOH調(diào)整pH值至5.5。

巴斯德畢赤酵母重組菌篩選所使用的MD培養(yǎng)基、搖瓶發(fā)酵BMGY、BMMY培養(yǎng)基等均按文獻(xiàn)[12]一般方法配制。

結(jié)合緩沖液：稱取29.2 g NaCl和1.4 g咪唑用20 mmol/L的Na2HPO4和10 mmol/L的NaH2PO4溶解定容至1 L，并調(diào)節(jié)至pH 7.4。

洗脫緩沖液：稱取29.2 g NaCl，34.0 g咪唑用10 mmol/L的NaH2PO4溶解定容至1 L，并調(diào)節(jié)至pH 7.4。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 葡聚糖酶表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)eglA6的核苷酸序列(NCBI登錄號(hào)：MG913988)設(shè)計(jì)引物如下：

Pj101：5′-AATTACCGTACGTAAGTCCGAGGGCT AAGCGG-3′

Pj102：5′-AATTACCGGCGGCCGCTTAGTGGTGGT GATGGTGGTGATACCCCTCCAACACC-3′

Pj201：5′-AATTACCGAGATCTAGTCCGAGGGCT AAGCGG-3′

Pj202：5′-AATTACCGGTCGACTTAGTGGTGGTGA TGGTGGTGATACCCCTCCAACACC-3′

以重組質(zhì)粒pPIC9K-eglA6為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增目的基因。PCR反應(yīng)條件為98 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)。以Pj101和Pj102為引物的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后用SnaB I和NotI酶切，純化后與同樣經(jīng)過(guò)酶切的質(zhì)粒pPIC9K連接，連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒后用SnaB I和NotI酶切。Pj201和Pj202為引物的擴(kuò)增產(chǎn)物按上述同樣方法操作，將核酸內(nèi)切酶更換為BglⅡ和SalI。

1.2.2 酵母轉(zhuǎn)化及篩選

乳酸克魯維酵母GG799感受態(tài)細(xì)胞制備方法同文獻(xiàn)[11]。大量提取用于乳酸克魯維酵母表達(dá)的重組質(zhì)粒，用核酸內(nèi)切酶BstX I酶切線性化后用DNA片段純化試劑盒純化。取克魯維酵母感受態(tài)細(xì)胞90 μL，加入線性化質(zhì)粒10 μL，混合后轉(zhuǎn)入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中，冰浴10 min。1 200 V連續(xù)電擊2次，迅速加入冰水預(yù)冷的山梨醇溶液900 μL，懸浮菌體。菌體涂布以乙酰胺為唯一碳源的YCB培養(yǎng)基平板。培養(yǎng)72 h，任選300個(gè)單菌落劃線分離，劃線平板培養(yǎng)48 h形成單菌落后在4 ℃冰箱保藏并逐個(gè)發(fā)酵鑒定。

巴斯德畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞制備方法同文獻(xiàn)[12]。用于巴斯德畢赤酵母表達(dá)的重組質(zhì)粒用BglⅡ酶切線性化后轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化方法以及重組菌搖瓶發(fā)酵鑒定的方法均同文獻(xiàn)[10,12]。

1.2.3 重組蛋白表達(dá)與純化

由于2種重組酵母表達(dá)產(chǎn)物的C端均帶有His-tag標(biāo)簽，因此采用Ni柱進(jìn)行親和層析分離純化。方法如下：吸取1 mL Ni-NTA填料(0.5 mL床體積)到15 mL分離管中，打開(kāi)下端管口并靜置將上清液體全部放出，依次用10 mL超純水，10 mL結(jié)合緩沖液各洗滌填料層2次，靜置放出上清液后將10 mL發(fā)酵上清液與填料搖晃振蕩25 min使酶與Ni填料結(jié)合。振蕩完畢后先放出上清液，先用10 mL結(jié)合緩沖液緩慢洗滌填料層2次，再加入5 mL洗脫緩沖液洗滌填料層。收集洗滌組分用SDS-PAGE分析。

1.2.4 重組酶檢測(cè)與性質(zhì)分析

酶活力檢測(cè)、酶學(xué)性質(zhì)分析等方法均與文獻(xiàn)[11]相同。其中酶活力(U)定義為以大麥葡聚糖為底物，在70 ℃下，每分鐘分解底物產(chǎn)生的還原糖，其還原力相當(dāng)于1 μmol葡萄糖所需的酶量。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡聚糖酶AnEglA6的結(jié)構(gòu)分析

在已見(jiàn)報(bào)道的葡聚糖酶中，與AnEglA6同源性最高的是黑曲霉來(lái)源的另一種葡聚糖酶AnCelA[13]，兩者氨基酸同源性為50.63%[11]。YAN等[13]研究了AnCelA在巴斯德畢赤酵母中的表達(dá)并獲得了表達(dá)產(chǎn)物的晶體結(jié)構(gòu)。以AnCelA三級(jí)結(jié)構(gòu)為依據(jù)利用I-Tasser軟件[I-TASSER server for protein structure and function prediction (zhanggroup.org)]進(jìn)行同源建模，結(jié)果見(jiàn)圖1-a，AnEglA6由催化結(jié)構(gòu)域、連接橋和纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(cellulose binding domain, CBD)3個(gè)相對(duì)獨(dú)立的部分組成，其中后2個(gè)部分與水解結(jié)晶型纖維素有關(guān)[14]，而水解葡聚糖的功能很可能可以由催化結(jié)構(gòu)域獨(dú)立完成[15]。據(jù)此，將AnEglA6中與后2個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)的羧基端的81個(gè)氨基酸殘基截去后再進(jìn)行同源建模，結(jié)果如圖1-b所示，截短后的肽鏈形成的三級(jí)結(jié)構(gòu)與AnEglA6的催化結(jié)構(gòu)域幾乎完全相同。由上述分析看，AnEglA6的羧基端81個(gè)氨基酸殘基很可能可以截去，由此可以獲得一個(gè)分子質(zhì)量減小而葡聚糖水解功能仍然保留的新型葡聚糖酶。

a-AnEglA6K;b-AnEglA6cK

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以重組質(zhì)粒pPIC9K-eglA6為模板，分別以Pj101、Pj102和Pj201、Pj202為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的擴(kuò)增片段約為0.9 kbp，與預(yù)計(jì)的eglA6基因的截短體大小一致，為便于敘述截短體基因命名為eglA6c。上述擴(kuò)增產(chǎn)物按本文1.2.1的方法酶切純化后與載體連接，分別獲得重組質(zhì)粒pPIC9K-eglA6c和pKLAC1-eglA6c，圖2為重組質(zhì)粒酶切電泳圖。將上述兩個(gè)質(zhì)粒分別進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示2個(gè)重組質(zhì)粒中的插入片段的堿基序列與eglA6基因?qū)?yīng)區(qū)域的序列完全一致。

M1-DL 10000 marker;M2-DL 2000 marker

2.3 重組酵母的構(gòu)建與重組酶的表達(dá)

大量提取重組質(zhì)粒pPIC9K-eglA6c用核酸內(nèi)切酶BglⅡ酶切線性化后電轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母GS115，任選20個(gè)轉(zhuǎn)化子菌落搖瓶發(fā)酵并檢測(cè)酶活力。結(jié)果顯示其中13個(gè)轉(zhuǎn)化子發(fā)酵上清液中有明顯的葡聚糖酶活力，對(duì)照菌即空質(zhì)粒pPIC9K的轉(zhuǎn)化子則均沒(méi)有酶活力。上述13個(gè)轉(zhuǎn)化子中5#轉(zhuǎn)化子發(fā)酵獲得最高酶活力，為2 006 U/mL，9#轉(zhuǎn)化子酶活力最低為1 324 U/mL，13個(gè)轉(zhuǎn)化子的平均酶活力為1 501 U/mL。其中5#轉(zhuǎn)化子命名巴斯德畢赤酵母GS115/pPIC9K-eglA6c PpW5，簡(jiǎn)稱PpW5，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

大量提取重組質(zhì)粒pKLAC1-eglA6c用核酸內(nèi)切酶BstX I酶切線性化后轉(zhuǎn)化乳酸克魯維酵母GG799，在以乙酰胺為唯一氮源的培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子?？紤]到乳酸克魯維酵母重組菌篩選時(shí)假陽(yáng)性比較多[11,16]，隨機(jī)挑取了300個(gè)單菌落劃線分離后再取單菌落搖瓶發(fā)酵。結(jié)果顯示共有16個(gè)轉(zhuǎn)化子的單菌落發(fā)酵上清液中有明顯的酶活力，pKLAC1空質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子沒(méi)有酶活力。其中114#轉(zhuǎn)化子酶活力最高為79 U/mL，酶活力最低的是55#轉(zhuǎn)化子，為48 U/mL，16個(gè)轉(zhuǎn)化子的平均酶活力為61 U/mL。114#轉(zhuǎn)化子命名為乳酸克魯維酵母GG799/pKLAC1-eglA6c KlW114，簡(jiǎn)稱KlW114，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 重組葡聚糖酶的純化

上述2種重組質(zhì)粒構(gòu)建時(shí)，PCR擴(kuò)增的下游引物均增加了編碼6個(gè)組氨酸的密碼子，因此產(chǎn)物的羧基端帶有6×His標(biāo)簽，可以利用鎳填料進(jìn)行親和層析，以實(shí)現(xiàn)重組蛋白的高效純化。結(jié)果如圖3所示。經(jīng)過(guò)鎳填料親和純化的重組酶表現(xiàn)為單一條帶，說(shuō)明已經(jīng)獲得純酶。用圖像分析軟件Image lab 4.0分析可得，2種純酶的表觀分子質(zhì)量均為36 kDa，比截短體基因eglA6c編碼產(chǎn)物的理論分子質(zhì)量34 kDa高出約6%，這可能是酵母中蛋白分泌過(guò)程中在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中被糖基化修飾的結(jié)果。為便于敘述，重組畢赤酵母PpW5表達(dá)的重組酶命名為AnEglA6cP，而重組乳酸克魯維酵母表達(dá)的重組酶命名為AnEglA6cK。

M-蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量8～180 kDa;1-AnEglA6cK純酶;2-AnEglA6cP純酶

2.5 酶學(xué)性質(zhì)

2.5.1 重組葡聚糖酶的最適溫度及pH

在pH 4.5條件下，根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法在不同溫度條件下測(cè)定重組葡聚糖酶的酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 溫度對(duì)重組酶活性的影響

當(dāng)溫度小于75 ℃時(shí)，AnEglA6cK與AnEglA6cP的酶活力均隨溫度的上升而上升，二者的最適催化溫度均為75℃。當(dāng)溫度高于75℃時(shí)，AnEglA6cP酶活力迅速下降，而AnEglA6cK酶活力下降較為緩慢，在85℃時(shí)，AnEglA6cK相對(duì)酶活力仍在60%以上。在75℃不同pH環(huán)境下測(cè)定重組酶活力，結(jié)果如圖5所示。2種重組酶的最適pH均為4.5，但pH低于4.5時(shí)AnEglA6cK的酶活力下降更快，而高于4.5時(shí)AnEglA6cP的酶活力下降更快。在pH 4.0～5.0，2種酶的酶活力均保持在最高酶活力的80%以上。

圖5 pH對(duì)重組酶活性的影響

2.5.2 重組葡聚糖酶的穩(wěn)定性

在pH 4.5，不同溫度下檢測(cè)重組酶的穩(wěn)定性，在溫度低于65 ℃時(shí)2種酶均有很高的穩(wěn)定性，在65 ℃保溫6 h后殘余酶活力均在80%以上。在70 ℃以、保溫，2種酶均有明顯的失活。如圖6所示，在70 ℃和75 ℃下2種重組酶的穩(wěn)定性差異不大。在80 ℃下2種酶的差異很大，保溫1 h后AnEglA6cP的酶活力殘余只有約16%，而AnEglA6cK的酶活力殘留接近50%。進(jìn)一步檢測(cè)顯示在80 ℃下AnEglA6cK的酶活力半衰期大約為55 min，而AnEglA6P大約為17 min。AnEglA6cK能短時(shí)耐受85 ℃高溫，保溫1 h后其相對(duì)殘余酶活力大約為10%，進(jìn)一步檢測(cè)顯示AnEglA6cK在85 ℃下的半衰期約為10 min。AnEglA6cP在85 ℃下快速失活，酶活力半衰期不到5 min，保溫1 h后完全檢測(cè)不到酶活力。熱穩(wěn)定性比較顯示，在80 ℃以上高溫條件下，AnEglA6cK相對(duì)AnEglA6cP明顯更加穩(wěn)定。

圖6 重組葡聚糖酶熱穩(wěn)定性

2.5.3 重組葡聚糖酶的底物特異性

將重組酶分別與10 g/L的不同底物在pH 4.5、70 ℃下反應(yīng)并測(cè)定酶活力，結(jié)果見(jiàn)表1。對(duì)表1數(shù)據(jù)分析可見(jiàn)，2種宿主表達(dá)的截短體的比酶活力均比同一宿主中表達(dá)的全長(zhǎng)酶高出20%左右。2種宿主表達(dá)的截短體和全長(zhǎng)酶均能微弱水解棉花和濾紙。乳酸克魯維酵母表達(dá)的全長(zhǎng)酶能微弱水解微晶纖維素，但截短體不能水解微晶纖維素，可見(jiàn)CBD是水解結(jié)晶型纖維素的必須結(jié)構(gòu)。巴斯德畢赤酵母表達(dá)的全長(zhǎng)酶雖然帶有CBD但是不能水解微晶纖維素，這與王施嵐等[11]的研究結(jié)果一致，王施嵐等研究者認(rèn)為CBD部分的糖基化情況可能是影響其與結(jié)晶型纖維素結(jié)合的重要因素。

表1 重組葡聚糖酶底物特異性

2.5.4 重組酶AnEglA6cK的水解產(chǎn)物

AnEglA6cK過(guò)度水解大麥葡聚糖(圖7)，主要產(chǎn)物是相對(duì)分子質(zhì)量介于麥芽五糖和二糖之間的小分子寡糖，單糖和大于五糖的很少見(jiàn)。內(nèi)切型β-葡聚糖酶的一個(gè)重要特點(diǎn)是對(duì)葡聚糖分子內(nèi)部的β-1,4-糖苷鍵進(jìn)行隨機(jī)水解，產(chǎn)生大量相對(duì)分子質(zhì)量較小的寡糖。從水解產(chǎn)物可見(jiàn)，AnEglA6cK是一種內(nèi)切型β-葡聚糖酶。

M-麥芽寡糖標(biāo)樣;1-AnEglA6cK降解大麥葡聚糖產(chǎn)物;2-大麥葡聚糖

2.5.5 金屬離子及EDTA對(duì)重組酶活力的影響

不同濃度的金屬離子、EDTA等對(duì)重組酶活性的影響如表2所示。從表2中可以看出大部分常見(jiàn)金屬離子對(duì)重組酶活力無(wú)明顯影響，Co2+、Mn2+的存在會(huì)提高重組酶活力。而EDTA對(duì)重組酶活力有一定的抑制作用，但即使高濃度EDTA處理酶活力剩余仍在80%以上。

表2 金屬離子、EDTA對(duì)重組酶活力的影響

2.6 重組乳酸克魯維酵母發(fā)酵條件優(yōu)化

2.6.1 重組菌發(fā)酵進(jìn)程

從本文研究結(jié)果看，截短體基因在乳酸克魯維酵母中表達(dá)產(chǎn)物性質(zhì)顯著優(yōu)于其在巴斯德畢赤酵母中的表達(dá)產(chǎn)物，但表達(dá)水平明顯偏低。為了研究提高基因表達(dá)水平的可能性，進(jìn)一步對(duì)表達(dá)截短基因的KlW114和表達(dá)全長(zhǎng)基因的SL105的發(fā)酵特點(diǎn)進(jìn)行研究。根據(jù)課題組前期研究結(jié)果，在重組乳酸克魯維酵母發(fā)酵時(shí)，以蔗糖替代半乳糖可以得到類似的發(fā)酵結(jié)果，從節(jié)約生產(chǎn)成本考慮后續(xù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)均以YPS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)進(jìn)行。發(fā)酵結(jié)果如圖8所示。2株菌發(fā)酵性能有明顯的差異。KlW114前期發(fā)酵產(chǎn)酶更快，發(fā)酵至36 h即達(dá)到最高酶活力，在此之前其酶活力及酶活力增長(zhǎng)速度均顯著高于SL105。36 h之后則出現(xiàn)相反的情況，KlW114的酶活力迅速下降，到60 h的時(shí)候已顯著低于SL105，而SL105的發(fā)酵酶活力則繼續(xù)維持增長(zhǎng)，沒(méi)有出現(xiàn)酶活力快速下降的情況。KlW114和SL105采用了相同的表達(dá)系統(tǒng)，唯一的差異是后者表達(dá)的是全長(zhǎng)蛋白而前者表達(dá)的蛋白C端被截去了一段81個(gè)氨基酸殘基的片段。從2.1的分析看，這是一段高度糖基化的片段，截去后表達(dá)產(chǎn)物的分子質(zhì)量下降了1/3，分子的精簡(jiǎn)有利于酶的高效表達(dá)及分泌，這是KlW114在發(fā)酵前期酶活力快速增長(zhǎng)的原因。KlW114發(fā)酵后期酶活力快速下降的原因很可能是重組酶被宿主菌胞外蛋白酶降解，從實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象分析，AnEglA6分子中C端高度糖基化的片段可能對(duì)重組酶抵抗乳酸克魯維酵母蛋白酶降解有重要的作用。

圖8 Kl114與SL105發(fā)酵特性比較

2.6.2 不同有機(jī)氮源對(duì)重組菌發(fā)酵的影響

有機(jī)氮源是影響重組菌產(chǎn)酶的重要因素。在YPS培養(yǎng)基中，酵母粉是一種富含礦物營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)因子的氮源，因此在分析有機(jī)氮源影響時(shí)10 g/L的酵母粉不做改動(dòng)，只將其中30 g/L的酪蛋白胨改為相同質(zhì)量的其他氮源，結(jié)果如圖9所示。在所試驗(yàn)的有機(jī)氮源中，2種大豆蛋白的水解物最有利于重組酶的發(fā)酵。3種動(dòng)物來(lái)源的蛋白胨的作用相當(dāng)，以豆餅粉和大豆蛋白為氮源時(shí)發(fā)酵酶活力很低。用酵母粉替代蛋白胨獲得的結(jié)果也與上述3種動(dòng)物蛋白胨的結(jié)果相似。圖9采用的是發(fā)酵48 h的結(jié)果，上述3種動(dòng)物蛋白胨和酵母粉為氮源時(shí)最高酶活力均出現(xiàn)在36 h，之后酶活力快速下降。以大豆蛋白胨和大豆蛋白肽為氮源時(shí)進(jìn)行發(fā)酵，酶活力增長(zhǎng)可以維持到 48 h之后，所以酶活力較高。由于目前大豆蛋白肽價(jià)格較高，因此選用大豆蛋白胨為重組菌的發(fā)酵氮源。圖10是KlW114和SL105的發(fā)酵進(jìn)程曲線，由圖10可知，KlW114在以大豆蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基中酶活力增長(zhǎng)可以維持到48 h，最高酶活力達(dá)到121 U/mL，此后酶活力有所下降但下降速度較慢。SL105雖然發(fā)酵酶活力低于KlW114，但酶活力穩(wěn)定，發(fā)酵后期沒(méi)有出現(xiàn)酶活力明顯下降的趨勢(shì)。發(fā)酵至48 h，SL105最高酶活力為61 U/mL，KlW114的酶活力比SL105高出近1倍(98%)。

圖9 不同有機(jī)氮源對(duì)KlW114發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

圖10 以大豆蛋白為氮源的培養(yǎng)基中重組菌的發(fā)酵性能比價(jià)

3 結(jié)論

結(jié)構(gòu)分析顯示，AnEglA6羧基端的81個(gè)氨基酸殘基可能與其水解葡聚糖的功能無(wú)關(guān)。本文獲得了去除上述區(qū)域編碼區(qū)的截短體基因eglA6c。截短體表達(dá)產(chǎn)物的比酶活力比全長(zhǎng)酶大約提高了20%，底物特異性與全長(zhǎng)酶基本一致，唯一的顯著差異是乳酸克魯維酵母表達(dá)的全長(zhǎng)酶AnEglA6K能微弱水解微晶纖維素而截短體完全失去了這一功能，這充分證明基因AnEglA6K羧基端包含了纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，而這一結(jié)構(gòu)域是水解結(jié)晶型纖維素的必須結(jié)構(gòu)，這與有關(guān)纖維素酶結(jié)構(gòu)功能的研究結(jié)果一致[17-19]。

根據(jù)eglA6基因序列推測(cè)，AnEglA6全長(zhǎng)酶的理論分子質(zhì)量是41 kDa，截短體為34 kDa(包括6×His)。酵母基因分泌表達(dá)過(guò)程中，由于糖基化等修飾作用表達(dá)產(chǎn)物的實(shí)際分子質(zhì)量往往比理論分子質(zhì)量大。乳酸克魯維酵母表達(dá)的全長(zhǎng)酶AnEglA6K的表觀分子質(zhì)量為56 kDa，比理論分子質(zhì)量高14.6 kDa，而截短體AnEglA6cK的表觀分子質(zhì)量為36 kDa，相比理論分子質(zhì)量?jī)H高出2 kDa。由此推測(cè)，AnEglA6K的糖基化修飾絕大部分集中在羧基端的81個(gè)氨基酸殘基上。其他真菌纖維素酶結(jié)構(gòu)研究也有類似的結(jié)果，纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域和CBD之間的連接橋往往富含Ser、Thr、Gly和Pro等殘基，而這些區(qū)域往往有超O-糖基化現(xiàn)象[20-21]。這個(gè)區(qū)域通常會(huì)為整個(gè)酶提供多種功能，例如增強(qiáng)CBD對(duì)纖維素的吸附能力以及增強(qiáng)熱穩(wěn)定性等[22-23]。從本文研究結(jié)果看，截短體AnEglA6ck的熱穩(wěn)定性稍低于AnEglA6K，而AnEglA6cP的熱穩(wěn)定性也稍低于AnEglA6P，這說(shuō)明本文截去羧基端片段對(duì)酶的穩(wěn)定性也有一定的影響。

本文截短體在巴斯德畢赤酵母中的表達(dá)水平比全長(zhǎng)酶高1.3倍以上，而在乳酸克魯維酵母中的表達(dá)水平提高幅度不大，在針對(duì)性的優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基之后發(fā)酵水平提高幅度為98%左右，提高幅度仍未達(dá)到應(yīng)有水平。本文研究結(jié)果顯示乳酸克魯維酵母對(duì)截短體的水解可能是重要原因。本課題組對(duì)截短體在巴斯德畢赤酵母中的表達(dá)進(jìn)行研究卻未發(fā)現(xiàn)同樣的情況，由此推測(cè)乳酸克魯維酵母中可能存在特定的水解AnEglA6cK的蛋白水解酶。在今后的工作中，通過(guò)基因敲除的方法敲除相關(guān)的基因可能有利于提高酶在這一宿主中的表達(dá)。