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    基于Lachancea thermotolerans-Saccharomyces cerevisiae雙酵母混合發(fā)酵酸啤酒的工藝研究

    2023-03-07 13:29:16付曉芬郭立蕓侍亞敏謝鑫宋玉梅李十中
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2023年4期
    關(guān)鍵詞:麥芽釀酒啤酒

    付曉芬,郭立蕓,侍亞敏,謝鑫,宋玉梅,李十中

    1(北京燕京啤酒股份有限公司技術(shù)中心,啤酒釀造技術(shù)北京市重點實驗室,北京,101300)2(清華大學核能與新能源技術(shù)研究院,北京,100084)

    伴隨著生活方式的轉(zhuǎn)變與消費需求的多元化,新一代啤酒消費者對于個性化釀造和新風格啤酒的需求日益增長,促使啤酒企業(yè)不斷向產(chǎn)品多元化和高端化方向布局。非釀酒酵母是商業(yè)啤酒釀造中的非常規(guī)酵母,雖然其發(fā)酵性能不如釀酒酵母,但其對啤酒總體香氣特征的復雜性和多樣性有著積極的影響。近年來,對非傳統(tǒng)酵母的開發(fā)和應用成為中外葡萄酒和精釀啤酒的熱點,針對非釀酒酵母在發(fā)酵技術(shù)和方法上也不斷產(chǎn)生新的觀點[1-2]。將具有不同特性的非釀酒酵母與常規(guī)釀造釀酒酵母進行組合發(fā)酵,改良原有產(chǎn)品的風格缺陷,增強產(chǎn)品的風味,這種基于不同酵母的混菌發(fā)酵模式在葡萄酒的規(guī)模釀造中已得到較好的應用[3-5],但鮮有將這種混菌發(fā)酵技術(shù)應用于大規(guī)模啤酒生產(chǎn)中的嘗試。雖然這種基于不同酵母混菌發(fā)酵開發(fā)特色啤酒的方法極具前景,但因其需對工藝條件進行重大調(diào)整,以及發(fā)酵過程的穩(wěn)定性等問題的存在,很多大規(guī)模釀造工廠不愿在工業(yè)條件下使用混合發(fā)酵方式生產(chǎn)啤酒。

    近年來,人們對風味高度復雜的酸啤酒的興趣大大增加[6]。與常規(guī)的艾爾啤酒和拉格啤酒相比,酸啤酒含有大量的有機酸(如乳酸和乙酸),使得其pH值偏低。傳統(tǒng)酸啤酒的生產(chǎn)起源于比利時傳統(tǒng)酸啤酒Lambic釀造工藝[7-8],該工藝利用復雜的微生物菌群自發(fā)發(fā)酵進行生產(chǎn),通過長期的發(fā)酵過程(1~3年)可形成富含多種代謝物的傳統(tǒng)酸啤酒。然而,傳統(tǒng)酸啤酒的釀造工藝存在發(fā)酵周期長、釀造過程不可控、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性差等諸多問題降低了其大規(guī)模生產(chǎn)的可能性。為了規(guī)避野生菌群引發(fā)的產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定和發(fā)酵失敗風險大等問題,在煮沸麥芽汁前接入乳酸菌發(fā)酵劑進行糖化鍋酸化法(kettle souring)[6,9],48 h后依次進行煮沸、釀酒酵母發(fā)酵與木桶老化。采用此方法生產(chǎn)酸啤酒雖然發(fā)酵耗時相對較短,但提前酸化工藝仍然增加了工藝操作步驟,且對后期的罐體消殺要求較高。同時,煮沸后乳酸菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)減少,也是其缺點之一。雖然可使用木桶陳釀來增加啤酒香氣的復雜性,但這又延長了酸啤酒的生產(chǎn)周期。另有研究[10-11]將乳酸菌與釀酒酵母混合發(fā)酵或發(fā)酵后期添加乳酸菌進行酸啤酒生產(chǎn),但由于大部分乳酸菌屬于細菌,受到啤酒花的抑制作用,很難在釀酒酵母存在的情況下形成生長優(yōu)勢,所以其產(chǎn)生的乳酸和其他風味物質(zhì)也很有限。國內(nèi)外對酸啤酒的研究和開發(fā)已是熱點,但鮮有研究利用不同酵母進行可調(diào)控的混合發(fā)酵酸啤酒。

    為了獲得一款適用于大規(guī)模生產(chǎn)且果味馥郁的酸啤酒產(chǎn)品,本研究選擇在基質(zhì)利用和風味產(chǎn)生方面具有一定潛力的不同酵母菌種組合構(gòu)建穩(wěn)定的雙酵母混菌發(fā)酵體系,基于工業(yè)條件下成熟穩(wěn)定的啤酒釀造工藝,利用工業(yè)標準麥芽汁(不添加外源風味物質(zhì))生產(chǎn)新型果味酸啤酒。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株

    釀酒酵母Saccharomycescerevisiae68obg、耐熱拉錢斯氏酵母LachanceathermotoleransFBA-2、布魯塞爾酒香酵母BrettanomycesbruxellensisWDB24菌株由實驗室菌種保藏中心提供;馬克斯克魯維酵母Kluyveromycesmarxianus1695、Kluyveromycesmarxianus1042和耐熱拉錢斯氏酵母Lachanceathermotolerans1548菌株由中國普通微生物菌種保藏管理中心提供。

    1.1.2 培養(yǎng)基與溶液

    擴培培養(yǎng)基:麥芽汁由某公司糖化車間生產(chǎn),115 ℃滅菌20 min。

    發(fā)酵培養(yǎng)基:添加終體積分數(shù)為2%果葡糖漿至麥芽汁,以增加非釀酒酵母可利用糖含量,115 ℃滅菌20 min。

    1.1.3 實驗試劑

    次甲基藍(分析純),天津百世化工有限公司;硫酸鈣(分析純),天津市風船化學試劑科技有限公司;水合茚三酮、乙醛等標準品(色譜純),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽三糖(色譜純),大連美侖生物技術(shù)有限公司,疊氮溴化乙錠(分析純),美國Sigma公司。

    1.1.4 儀器與設備

    Agilent 1260高效液相色譜儀、G1888-6890氣相色譜儀,美國安捷倫科技有限公司;UV1280紫外可見分光光度計,日本島津公司;ABI7500定量PCR儀,美國Applied Biosystems公司;DX-320離子色譜儀,美國戴安公司;Anton Paar(Ⅳ型)啤酒分析儀,安東帕公司;生化培養(yǎng)箱,上海智城分析儀器制造有限公司;IY1200酵母計數(shù)儀,上海睿鈺生物科技有限公司;FE28 pH計,上海梅特勒-托利多儀器有限公司;MIR-253型生化培養(yǎng)箱,日本三洋公司;超凈工作臺,蘇州凈化設備有限公司;高壓滅菌器,日本HIRAYAM公司。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 啤酒發(fā)酵實驗

    活化后菌液接種至含250 mL麥芽汁的500 mL三角瓶中,25 ℃靜置培養(yǎng)24 h,制備種子液,按1×107~1.2×107CFU/mL的接種量接種至麥芽汁發(fā)酵培養(yǎng)基中,20 ℃靜置培養(yǎng)7 d,然后將600 mL發(fā)酵液注入無菌卡箍瓶中,壓蓋后在0 ℃下貯酒7 d。(每個樣品3個平行)。

    1.2.2 雙酵母混合發(fā)酵體系不同種酵母數(shù)量變化分析

    將qPCR與疊氮溴化乙錠(ethidium monoazide bromide, EMA)活菌處理技術(shù)相結(jié)合,實現(xiàn)對混合發(fā)酵體系中各菌株定量分析,從而可以快速表征雙酵母混合發(fā)酵體系各酵母的動態(tài)變化趨勢。

    與亞甲基藍染色法顯微監(jiān)測法分析細胞死亡率[12]進行關(guān)聯(lián)分析,酵母死亡率測定采用亞甲基藍染色法。確定適用于2株酵母菌種的EMA預處理條件為EMA濃度在20 μmol/L、避光放置10 min后,將樣品放置在距500 W鹵素燈10 cm處曝光15 min,可有效抑制死菌DNA的擴增,從而排除死菌DNA擴增對qPCR菌株定量的影響。將已知濃度的酵母純培養(yǎng)菌液,進行10倍梯度稀釋,之后分別進行EMA-qPCR檢測,其中兩酵母特異性引物分別為S.cerevisiaeCESP-F:ATCGAATTTTTGAACGCACATTG,SCER-R:CGCAGAGAAACCTCTCTTTGGA[13];L.thermotoleransLTH2-F CGCTCCTTGTGGGTGGGGAT,LTH2-R CTGGGCTATAACGCTTCTCC[14]。30 μL的qPCR反應體系為12 μL的Sybrgreen Mix(天根),1 μL上游引物和下游引物,1 μL的模板DNA,15 μL的滅菌水。qPCR反應程序為95 ℃ 5 min,40個循環(huán),每個循環(huán)95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s,在每個循環(huán)的延伸階段進行熒光信號檢測,最終得到104、105、106、107、108、109CFU/mL活細胞的標準曲線, 確定qPCR相應循環(huán)閾值(cycle threshold, Ct)和平板計數(shù)之間的相關(guān)性,實現(xiàn)各菌株的定量分析,最后應用EMA-qPCR監(jiān)測技術(shù)動態(tài)表征雙酵母混合發(fā)酵體系中各單菌生長狀態(tài)。

    1.2.3 雙酵母混合發(fā)酵體系穩(wěn)定性實驗

    將混菌發(fā)酵體系逐級進行發(fā)酵體積放大,分別進行500 mL三角瓶、2 L發(fā)酵瓶、100 L發(fā)酵罐雙酵母混合發(fā)酵酸啤酒實驗,監(jiān)測發(fā)酵過程各關(guān)鍵參數(shù)和風味的穩(wěn)定性。

    1.2.4 有機酸含量的測定

    有機酸對啤酒的風味和口感有很大影響,是評價酸啤酒的重要指標。采用離子色譜方法測定酒液中的有機酸(乳酸、乙酸、甲酸、丙酸、丙酮酸、琥珀酸、酒石酸、草酸、富馬酸和檸檬酸)成分。將混合標準溶液與樣品待測液分別注入離子色譜儀,測得各有機酸的響應值(峰面積),經(jīng)與標準溶液色譜圖比較響應值(峰面積)得到待測樣品有機酸濃度。

    1.2.5 酒精度、發(fā)酵度的測定

    根據(jù)GB 5009.225—2016《食品安全國家標準 酒中乙醇濃度的測定》對真正發(fā)酵度及酒精度進行測定[15]。

    1.2.6 可發(fā)酵糖含量的測定

    使用高效液相色譜儀對發(fā)酵液中的主要糖類進行測定[16]。

    1.2.7 風味物質(zhì)含量的測定

    使用氣相色譜儀對蒸餾后的發(fā)酵液中風味物質(zhì)進行測定[12]。氣相色譜條件:色譜柱Agilent CP-WAX(50 m×250 μm×0.25 μm),載氣為高純氮氣(>99.999%);柱流速為1 mL/min;進樣口溫度250 ℃;檢測器溫度148.8 ℃;程序升溫:起始溫度35 ℃,保持1 min,以3 ℃/min升至70 ℃,保持15 min,再以3.5 ℃/min升至190 ℃,保持22 min;進樣體積為1 μL;分流進樣,分流比30∶1。

    1.2.8 啤酒感官品評

    目前啤酒行業(yè)廣泛采用的描述類感官評價方法是定量描述分析法(quantitative descriptive analysis, QDA),由10名啤酒感官評定專業(yè)人員組成評定小組,對啤酒的口感、口味和香氣進行感官評定,并按照風味強度評分。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 產(chǎn)酸酵母的篩選實驗

    參考相關(guān)研究[17-19],對具有一定產(chǎn)酸能力和麥芽汁發(fā)酵特性的非釀酒酵母進行分析,結(jié)果表明,與啤酒酵母68obg相比,大部分非釀酒酵母都只能利用麥芽汁中的葡萄糖、果糖和蔗糖,對麥芽糖、麥芽三糖等麥芽低聚糖基本不代謝,只有L.thermotoleransFBA-2利用少量的麥芽糖,且代謝速率明顯低于釀酒酵母。

    對5株非釀酒酵母的有機酸種類和產(chǎn)量進行分析,如表1所示,菌株L.thermotoleransFBA-2的乳酸產(chǎn)量最大,為2.573 g/L。但由于其乳酸和有機酸總量均高于其他菌株,感官品評的結(jié)果顯示,酸感明顯,綜合感官品評和風味物質(zhì)檢測,選擇協(xié)調(diào)性和爽口性更佳的L.thermotoleransFBA-2釀造酸啤酒。

    表1 五株非釀酒酵母利用麥芽汁發(fā)酵有機酸產(chǎn)量情況 單位:mg/L

    2.2 酵母單一菌株發(fā)酵實驗

    對S.cerevisiae68obg和L.thermotoleransFBA-2進行單一菌株的麥芽汁發(fā)酵實驗,S.cerevisiae68obg發(fā)酵效率高,且產(chǎn)酯豐富,酒體丁香風味明顯[20]。如圖1所示,L.thermotoleransFBA-2對麥芽糖的利用能力低,不利用麥芽三糖等麥芽低聚糖,殘?zhí)呛枯^高。如表1所示,單一菌株L.thermotoleransFBA-2的發(fā)酵產(chǎn)物中乳酸和總酸的產(chǎn)量最高,但受限于碳源的利用能力,其他風味物質(zhì)的產(chǎn)量較低,主要的雜醇異丁醇和異戊醇則明顯低于S.cerevisiae68obg,導致總醇較低,但酯含量比S.cerevisiae68obg高。

    圖1 單一菌株利用麥芽汁中可發(fā)酵糖情況

    發(fā)酵過程的失重情況如圖2所示,與S.cerevisiae68obg相比,非釀酒酵母L.thermotoleransFBA-2發(fā)酵速率較慢,S.cerevisiae68obg與L.thermotoleransFBA-2發(fā)酵液的酒精度分別為6.75%vol和2.11%vol。感官品評的結(jié)果也表明,菌株L.thermotoleransFBA-2的發(fā)酵酒液酸感突出,影響了酒體的協(xié)調(diào)性和適飲性,其他風味表現(xiàn)不突出,與S.cerevisiae68obg發(fā)酵所得的標準啤酒相比,風格差異較大。在葡萄酒的研究[21]中發(fā)現(xiàn),將耐熱拉錢斯氏酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵可增加總酸度、甘油、多糖、2-苯基乙醇等的產(chǎn)量,同時降低葡萄酒的揮發(fā)性酸度。可見,選擇S.cerevisiae68obg作為雙酵母混合發(fā)酵體系的基礎酵母,菌株L.thermotoleransFBA-2作為構(gòu)建雙酵母混合發(fā)酵酸啤酒的風格酵母,可混合釀造酸味協(xié)調(diào)的酸啤酒。

    圖2 單一菌株麥芽汁發(fā)酵過程失重情況

    2.3 啤酒混菌發(fā)酵體系中非釀酒酵母與釀酒酵母最適配比的確定

    混合發(fā)酵過程存在不同酵母之間的相互作用。大量研究表明[22-23],非釀酒酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵與單菌株發(fā)酵之間代謝活動存在差異,混合發(fā)酵體系中不同酵母菌株的比例對啤酒最終口味起決定性作用。因此,我們將風格酵母L.thermotoleransFBA-2和基礎酵母S.cerevisiae68obg按照100∶1、50∶1、10∶1、1∶1、1∶10、1∶50和1∶100的比例共同接種于發(fā)酵麥芽汁中,并添加2%的果葡糖漿,以促進混菌發(fā)酵體系中非釀酒酵母充分的生長。

    如圖3所示,當混合發(fā)酵體系中風格酵母L.thermotoleransFBA-2和基礎酵母S.cerevisiae68obg接種比例為1∶100、1∶50、1∶10時,菌株S.cerevisiae68obg有明顯的生長優(yōu)勢,細胞增長速率高于風格酵母L.thermotoleransFBA-2,快速成為主導菌株。即使在添加果葡糖漿后的麥芽汁中,與基礎酵母S.cerevisiae68obg競爭利用葡萄糖、果糖、蔗糖,風格酵母L.thermotoleransFBA-2無法形成生長優(yōu)勢,從而無法對最終的啤酒產(chǎn)品組分產(chǎn)生大的影響。

    圖3 不同配比混菌發(fā)酵24 h后各酵母細胞狀態(tài)

    當混合發(fā)酵體系中風格酵母L.thermotoleransFBA-2和基礎酵母S.cerevisiae68obg接種比例為100∶1、50∶1時,風格菌株L.thermotoleransFBA-2占據(jù)了絕對的生長優(yōu)勢,即使在發(fā)酵后期,菌株S.cerevisiae68obg也沒有在酵母數(shù)量上的形成優(yōu)勢,而當混合發(fā)酵體系中風格酵母L.thermotoleransFBA-2和基礎酵母S.cerevisiae68obg接種比例為10∶1時,酵母L.thermotoleransFBA-2啟動發(fā)酵,發(fā)酵中期,逐步衰亡。然后,S.cerevisiae68obg開始占據(jù)主導地位,使發(fā)酵繼續(xù),直至完成。

    2.4 耐熱拉錢斯氏酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵麥芽汁生產(chǎn)新型果味酸啤酒

    綜合啤酒混合發(fā)酵體系中風味物質(zhì)分析和感官品評結(jié)果,選擇L.thermotoleransFBA-2和S.cerevisiae68obg混合接種比例為10∶1,麥芽汁中總酵母數(shù)控制在1.0×107~1.2×107CFU/mL,利用EMA-qPCR監(jiān)測技術(shù)動態(tài)表征雙酵母混合發(fā)酵體系中各單菌生長狀態(tài)。

    2.4.1 EMA-qPCR定量分析建立各酵母標準曲線

    使用EMA-qPCR分別建立了L.thermotoleransFBA-2和S.cerevisiae68obg的活細胞含量與Ct值之間的標準曲線,Ct值與活菌濃度呈線性關(guān)系,L.thermotoleransFBA-2的標準曲線方程為y=-3.118 2x+38.952,相關(guān)系數(shù)為R2=0.988 3,如圖4所示,S.cerevisiae68obg的標準曲線方程為y=-3.221 5x+37.235,相關(guān)系數(shù)為R2=0.993 8,線性關(guān)系均良好。EMA-qPCR檢測方法與傳統(tǒng)的平板計數(shù)法相比較,能將檢測時間從36 h縮減至3~4 h,可大大提高檢測效率。

    2.4.2 混合發(fā)酵麥芽汁生產(chǎn)新型果味酸啤酒過程分析

    利用EMA-qPCR技術(shù)動態(tài)表征雙酵母混合發(fā)酵體系中各單菌生長狀態(tài),如圖4所示,由于接種比例大,L.thermotoleransFBA-2在進罐第1天后,酵母數(shù)量顯著增加,成為優(yōu)勢菌株,對發(fā)酵過程的監(jiān)測發(fā)現(xiàn),1 d后發(fā)酵液的pH值從5.42降至3.51,發(fā)酵2 d后pH值為3.33,并一直保持到第7天。2 d后,隨著可利用糖的耗盡,L.thermotoleransFBA-2活性下降,而后S.cerevisiae68obg利用發(fā)酵液中殘留的麥芽糖和麥芽三糖等可發(fā)酵糖,其酵母數(shù)不斷增加,由于L.thermotoleransFBA-2在發(fā)酵前期處于優(yōu)勢地位,對S.cerevisiae68obg有明顯的抑制作用,相比于S.cerevisiae68obg的單菌發(fā)酵,其酵母數(shù)量增長受限,最高僅為1.38×107CFU/mL,因此,發(fā)酵結(jié)束后酒液中由S.cerevisiae68obg產(chǎn)生的醇類物質(zhì)相對含量下降,發(fā)酵液的酒精度在5.55%vol。

    圖4 EMA-qPCR動態(tài)表征雙酵母混合發(fā)酵體系中各酵母數(shù)變化情況

    從實驗室條件逐級放大有效發(fā)酵體積到100 L發(fā)酵罐麥芽汁發(fā)酵實驗,如表2、表3所示,通過對發(fā)酵過程中相關(guān)關(guān)鍵參數(shù)的監(jiān)測,乳酸含量為1.5~1.8 g/L,酒液pH值為3.3~3.4,酒精度約在5%vol,可見由非釀酒酵母與釀酒酵母構(gòu)建的啤酒雙酵母混合發(fā)酵體系具有一定的穩(wěn)定性。

    表2 雙酵母混合發(fā)酵酸啤酒發(fā)酵性能參數(shù)

    在雙酵母混合發(fā)酵體系中非釀酒酵母和釀酒酵母之間的相互作用[24]會引發(fā)酶類和揮發(fā)性物質(zhì)的產(chǎn)量提升,非釀酒酵母L.thermotoleransFBA-2除了產(chǎn)生一定量的乳酸降低酒液pH值,也能給啤酒帶來更多的復雜香氣,如表3所示,相比于單一菌株發(fā)酵,雙酵母混合發(fā)酵酸啤酒體系其風味物質(zhì)產(chǎn)量都有所提高,產(chǎn)生了更多乙酸異丁酯和乙酸異戊酯等酯類物質(zhì),增強了酸啤酒的水果香氣,感官品評結(jié)果也表明,利用雙酵母混合發(fā)酵體系釀造的酸啤酒融合了2種酵母的特性,酒體果香馥郁,對啤酒的質(zhì)量產(chǎn)生積極影響(圖5)。

    表3 雙酵母混合發(fā)酸啤酒常規(guī)風味物質(zhì)及有機酸產(chǎn)量

    圖5 單一菌株及雙酵母混菌發(fā)酵啤酒感官品評結(jié)果

    3 結(jié)論

    將非釀酒酵母L.thermotoleransFBA-2作為混菌發(fā)酵的風格菌株,基于其對常規(guī)啤酒發(fā)酵用麥芽汁的利用情況,優(yōu)化原料配方,并選擇一株常規(guī)發(fā)酵釀酒酵母S.cerevisiae68obg作為基礎發(fā)酵菌株,以便保證啤酒的基調(diào),構(gòu)建了啤酒雙酵母混合發(fā)酵體系,并確定了最優(yōu)接種比例L.thermotoleransFBA-2∶S.cerevisiae68obg為10∶1,用混菌發(fā)酵生產(chǎn)的酸啤酒中含有1.5~1.8 g/L乳酸,pH值為3.3~3.4,酒精度約為5%vol,風味豐富度高、爽口協(xié)調(diào)、果香馥郁,不過分強調(diào)酸味。實驗室條件和100 L發(fā)酵罐放大實驗結(jié)果表明,利用雙酵母發(fā)酵體系發(fā)酵酸啤酒不僅能夠融合2種酵母的特性,還可以對啤酒的質(zhì)量產(chǎn)生積極影響,酒體果香馥郁,并且這一工藝消除了現(xiàn)有酸啤酒的工藝弊端,簡化了釀造操作環(huán)節(jié),縮短了發(fā)酵時間,可實現(xiàn)更快速的發(fā)酵和高水平的過程控制,能夠促進酸啤酒的大規(guī)模生產(chǎn)應用。

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