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    新疆傳統(tǒng)奶酪中抗氧化乳酸菌篩選及培養(yǎng)條件優(yōu)化

    2023-03-07 13:27:42王佳敏胡美麗李宇輝
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2023年4期
    關(guān)鍵詞:能力

    王佳敏,胡美麗,李宇輝

    1(石河子大學(xué) 食品學(xué)院,新疆 石河子,832000)2(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所,新疆 烏魯木齊,830091)3(新疆農(nóng)墾科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,新疆 石河子,832000)

    本研究從新疆伊犁、哈密、塔城地區(qū)具有代表性奶酪樣品中分離出乳酸菌株并進行篩選,分別測定乳酸菌菌懸液、細胞破碎液、發(fā)酵上清液的DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力、超氧陰離子清除能力、還原能力及金屬離子螯合能力,選出具有高抗氧化性的菌株,為進一步開發(fā)具有抗氧化特性的乳制品和發(fā)酵制品提供理論支持。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    乳酸菌:自新疆伊犁、哈密、塔城地區(qū)具有代表性奶酪樣品中分離純化出的161株活性乳酸菌株,均保藏于石河子大學(xué)食品學(xué)院畜產(chǎn)品加工與安全控制研究中心實驗室。

    培養(yǎng)基:MRS液體培養(yǎng)基和MRS固體培養(yǎng)基均購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

    試劑:三氯乙酸、過氧化氫、O-菲羅啉、硫酸亞鐵、DPPH、鐵氰化鉀、鄰苯三酚、氯化鐵、二乙三胺五乙酸,北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;細菌DNA基因組抽提試劑盒,生工生物工程股份有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    22331型高速冷凍離心機,德國Eppendorf AG公司;T100TTMhermal 型PCR擴增儀,HP1020型凝膠成像系統(tǒng),美國Bio-Rad公司;BYY-BC型電泳儀,北京六一生物科技有限公司;DNP-3272型電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海精宏實驗設(shè)備有限公司;SW-JV2D型雙人單面潔凈工作臺,蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司;LDZX-30KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠。

    1.3 實驗方法

    1.3.1 菌株活化

    將實驗室-80 ℃冰箱保存的菌株取出,每株菌按2%的接種量接種至MRS液體培養(yǎng)基中,于37 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)18~24 h活化3代后備用。

    1.3.2 抗氧化乳酸菌初篩

    按照林祥娜等的方法[6],挑取菌株單菌落接種于含15 mmol/L H2O2的MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)2 h后,吸取150 μL菌液進行涂布并計算活菌數(shù)。

    1.3.3 抗氧化乳酸菌復(fù)篩

    1.3.3.1 樣品制備

    按高利娥[7]的方法分別制備菌株發(fā)酵上清液、菌懸液及細胞破碎液。

    1.3.3.2 DPPH清除能力測定

    取2 mL待測樣品,加入2 mL DPPH無水乙醇溶液(0.2 mmol/L)混勻,室溫避光反應(yīng)30 min,8 000×g離心10 min,于517 nm處測定吸光度值。DPPH自由基清除率計算如公式(1)所示:

    (1)

    式中:A0為等體積無水乙醇代替樣品組吸光度值;A1為實驗組吸光度值;A2為等體積無水乙醇代替DPPH無水乙醇溶液吸光度值。

    1.3.3.3 ·OH清除能力測定

    根據(jù)劉珊春[8]的方法?!H清除率計算如公式(2)所示:

    (2)

    式中:A1為等體積蒸餾水代替H2O2的吸光度值;A2為等體積樣品代替蒸餾水的吸光度值。

    (3)

    式中:A0為不含樣品和鄰苯三酚的吸光度值;A1為不含樣品、含鄰苯三酚的吸光度值;A2為含樣品、不含鄰苯三酚的吸光度值;A3為含樣品和鄰苯三酚的吸光度值。

    1.3.3.5 還原力的測定

    參考劉珊春[8]的方法進行測定。

    1.3.3.6 亞鐵離子螯合能力測定

    參考蔣琰潔[9]的方法進行測定。

    1.3.3.7 菌株的人工胃腸液及膽鹽耐受性

    根據(jù)云月英等[10]的方法,測定菌株對人工胃腸液耐受性。

    根據(jù)張悅等[11]的方法,測定菌株對膽鹽耐受性并作改動,將2%的菌液分別接種至含有質(zhì)量分數(shù)為0.1%、0.2%、0.3%及0.5%牛膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中,以未接種的培養(yǎng)基為對照,37 ℃培養(yǎng)24 h后計算活菌數(shù)。

    1.3.3.8 乳酸菌DNA提取、PCR擴增及16S rDNA測序

    用生工生物工程(上海)股份有限公司細菌DNA基因組抽提試劑盒,提取DNA。

    依照李曉楠等[12]的反應(yīng)條件,進行PCR擴增。PCR擴增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序,測序結(jié)果提交 NCBI 進行 BLAST 比對分析。

    1.3.4 抗氧化乳酸菌培養(yǎng)條件優(yōu)化

    1.3.4.1 菌株最適培養(yǎng)時間的確定

    將MRS液體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)初始pH值為7.0,接種量2%,培養(yǎng)溫度37 ℃,根據(jù)預(yù)實驗測定的菌株生長曲線結(jié)果將培養(yǎng)時間調(diào)整為18、20、24、28、30 h,測定乳酸菌活菌數(shù)。

    1.3.4.2 菌株培養(yǎng)初始pH的確定

    用1 mol/L HCl調(diào)整培養(yǎng)基,pH值分別調(diào)至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5,接種量2%,培養(yǎng)溫度37 ℃,培養(yǎng)時間18 h(對數(shù)期),計算活菌數(shù)。

    1.3.4.3 菌株最適培養(yǎng)溫度的確定

    將培養(yǎng)基pH調(diào)節(jié)為7.0,接種量2%,置于不同培養(yǎng)溫度27、32、37、42 ℃培養(yǎng)18 h,測定活菌數(shù)。

    1.3.4.4 菌株最適接種量的確定

    將培養(yǎng)基pH調(diào)節(jié)為7.0,以1%、2%、3%、4%、5%的接種量接種,培養(yǎng)溫度37 ℃,培養(yǎng)時間18 h,計算活菌數(shù)。

    1.4 數(shù)據(jù)分析

    實驗均重復(fù)3次,所得結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示,使用SPSS 26.0軟件數(shù)據(jù)進行顯著性差異分析,圖表的繪制用Origin 9.0軟件作圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 抗氧化乳酸菌的初篩

    初篩結(jié)果如表1所示(菌落數(shù)<10的未列出),161株乳酸菌中大部分菌株對H2O2耐受力較差,其中41株菌表現(xiàn)出活性,26株菌活性良好,說明菌株對H2O2有耐受能力,氧化應(yīng)激狀態(tài)中可存活,具備進一步試驗的條件。

    表1 菌株對H2O2耐受結(jié)果

    2.2 抗氧化乳酸菌的復(fù)篩

    2.2.1 乳酸菌的·OH清除能力

    如圖1所示,41株乳酸菌的菌懸液、發(fā)酵上清液、細胞破碎液都對羥自由基有清除能力。發(fā)酵上清液組中S2-7的清除率最高(P<0.05),為95.28%,T1-4、T1-2次之且無顯著差異;細胞破碎液組S4-14的清除能力最強(P<0.05),為57.98%,菌株B7-4、F2-6幾乎無清除能力;菌懸液組S5-7、B2-1的清除能力最大(81.56%、81.07%)。菌株發(fā)酵上清液的清除能力較好,與張開屏等[13]對乳酸菌清除羥自由基研究結(jié)果相似,說明乳酸菌清除羥自由基的物質(zhì)可能來自胞內(nèi),當(dāng)菌體存活時通過代謝作用釋放,進而起到清除羥自由基的效果;而菌株之間的清除能力各不相同,可能因為不同菌株生成清除自由基的活性物質(zhì)的種類或含量不同。

    圖1 菌株對·OH的清除率

    圖2 菌株對清除率

    2.2.3 乳酸菌的還原能力

    41株菌的還原能力差異較大,如圖3所示,S5-11發(fā)酵上清液展現(xiàn)出較好的還原能力,為95.48%,T1-4、B3-2次之;S4-14細胞破碎液的還原能力最高(67.62%,P<0.05);菌懸液組B6-4的還原能力最高(92.75%,P<0.05)。發(fā)酵上清液組及菌懸液組高于細胞破碎液組,由此推測乳酸菌的還原能力與菌株表面活性物質(zhì)和胞外釋放物有關(guān),細胞破碎液中的還原活性可能來自于菌體內(nèi)部的酶等。

    圖3 菌株的還原能力

    2.2.4 乳酸菌的亞鐵離子螯合能力

    如圖4所示,B7-5發(fā)酵上清液的螯合能力最大(P<0.05),為87.18%,S4-9、B3-2稍弱;B3-2細胞破碎液最高(58.54%,P<0.05);菌懸液組S5-7、B3-3、S4-14的螯合能力最強且無明顯差異,為94.33%~95.85%。發(fā)酵上清液組與菌懸液組的螯合能力相差不大,細胞破碎液的螯合能力較弱,與黃煜等[15]類似,可以看出乳酸菌的活性影響著金屬離子的螯合能力。

    圖4 菌株對亞鐵離子的螯合能力

    2.2.5 乳酸菌的DPPH自由基清除能力

    根據(jù)以上實驗結(jié)果,去除發(fā)酵上清液、細胞破碎液、菌懸液三部分的抗氧化活性低于整組平均水平的菌株,以下實驗選取綜合抗氧化活性較高的前15株進行,分別是菌株B2-1、B3-2、B3-3、B5-8、E3-2、S2-7、S4-14、S4-4、S4-7、S4-9、S5-11、S5-6、S5-7、T1-4、T2-10。

    DPPH自由基清除率與抗氧化能力呈正相關(guān)。如圖5所示,發(fā)酵上清液組清除能力最強的是菌株S2-7,為88.22%;菌懸液組最強是T1-4(74.95%);細胞破碎液組清除能力最強的是菌株B3-2,為74.28%。在此實驗中,菌株發(fā)酵上清液組清除能力82%~88%,菌懸液組清除率為31%~60%,具有顯著差異,細胞破碎液清除率為7%~74%,差異顯著,這可能說明不同菌株之間抗氧化活性的胞內(nèi)分泌物迥異,影響其抗氧化能力。大多數(shù)菌株的發(fā)酵上清液顯示出更高的清除能力[16],可能是乳酸菌產(chǎn)生的胞外多糖釋放到周圍環(huán)境中,提供的電子與DPPH自由基中和,達到猝滅的效果。

    圖5 菌株對DPPH自由基的清除率

    2.2.6 菌株的人工胃腸液耐受性

    如圖6所示,菌株在模擬胃液中培養(yǎng)3 h后,8株菌的存活率在80%以上,其中B2-1、S4-9、T2-10的存活率最高,為96.26%~97.35%(P<0.05),菌株T1-4的存活率最低,為23.08%。經(jīng)人工腸液處理后的菌株有8株存活率在80%以上,其中B2-1(98.79%,P<0.05)存活率最高,最低為菌株T1-4(37.89%),高于夏海燕等[17]從酢辣椒中分離出的6株乳酸菌在人工腸液中的存活率。通過模擬胃腸液實驗可知,12株菌株對胃腸液都有耐受性,4株菌的適應(yīng)能力較差,難以在胃腸液中長時間生存,分別是菌株B3-3、S4-14、S5-11、T1-4。

    圖6 乳酸菌人工胃腸液耐受率

    2.2.7 菌株的膽鹽耐受性

    乳酸菌的存活率與膽鹽濃度成反比,由圖7可知,膽鹽質(zhì)量分數(shù)為0.1%時,對菌株的生長無明顯影響,均表現(xiàn)出良好耐受性;膽鹽質(zhì)量分數(shù)為0.2%時,有7株存活率在90%以上;膽鹽質(zhì)量分數(shù)為0.3%時,有4株菌的存活率仍在90%以上,其中S4-9的存活率最高,為96.89%(P<0.05);當(dāng)膽鹽質(zhì)量分數(shù)為0.5%時,有4株菌的存活率在80%以上,分別是菌株S2-7、S4-7、S5-11、T1-4。王祎然等[18]分離出的6株乳酸菌在0.3%的膽鹽質(zhì)量分數(shù)下處理3 h后的存活率在87.37%~92.65%。本實驗的12株菌對膽鹽耐受性均較好,在低濃度膽鹽脅迫中保持較高的存活率,高質(zhì)量分數(shù)(0.5%)脅迫中逐漸下降。結(jié)合上述實驗,挑選以下8株菌進行后續(xù)實驗:B2-1、B5-8、E3-2、S4-7、S4-9、S5-7、S5-11、T2-10。

    圖7 乳酸菌的膽鹽耐受性

    2.2.8 PCR擴增及16S rDNA測序

    將篩選出的8株菌經(jīng)16S rDNA測序,通過NCBI數(shù)據(jù)庫比對,結(jié)果如圖8所示,菌株S5-7、E3-2、B5-8、S4-7、S4-9、B2-1、T2-10為乳酸片球菌;S5-11為干酪乳桿菌。

    2.3 抗氧化乳酸菌培養(yǎng)條件優(yōu)化

    2.3.1 菌株培養(yǎng)初始pH的確定

    由表2可知,不同初始pH下菌株的生長活性不同。在pH=7.0時,B2-1、S4-7、S4-9、S5-11長勢較好,菌株E3-2、B5-8在pH=5.5~7.5活性變化不大,說明它們具有良好的耐酸能力,菌株S5-7和T2-10在pH=6.5時長勢好(P<0.05)。每菌株的適宜初始pH值有差異,在一定pH范圍內(nèi)能快速繁殖,這8株菌在pH為7.0左右時有大量生長。

    表2 不同初始pH活菌數(shù)

    2.3.2 菌株的最適培養(yǎng)溫度

    溫度對微生物的生長繁殖具有顯著影響[19],如圖9-a所示,在一定范圍內(nèi),溫度與菌株活菌數(shù)呈正相關(guān),在27 ℃時菌株顯示較低活性,當(dāng)溫度為37 ℃和42 ℃的生長情況較好(P<0.05)。溫度不僅影響微生物的生長發(fā)育繁殖,對其代謝產(chǎn)物的品質(zhì)與產(chǎn)量也有影響[20],適宜的溫度培養(yǎng)對菌株生長和功效的發(fā)揮具有重大意義。

    2.3.3 菌株的最適培養(yǎng)時間

    由圖9-b可知,8株菌分別在培養(yǎng)18、28、28、24、18、20、24、18 h時達到其最大活菌數(shù)(P<0.05),多數(shù)菌株在18~24 h時差異不顯著,可能是因為在此時菌株處于對數(shù)生長末期或穩(wěn)定前期,而此時的菌株在活力、耐受不良環(huán)境能力、代謝能力等的巔峰時期[21],為最佳培養(yǎng)時間。

    2.3.4 菌株的最適接種量

    如圖9-c所示,所有菌株的活菌數(shù)都在接種量為2%~3%達到峰值(P<0.05),當(dāng)接種量為4%~5%時,活菌數(shù)逐漸下降,可能是因為接種量越大,越難達到菌株生長的穩(wěn)定期[22],不利于生長,即在接種量為2%~3%時可以達到最大利用率。

    a-培養(yǎng)溫度;b-培養(yǎng)時間;c-接種量

    綜上所述,培養(yǎng)條件優(yōu)選結(jié)果如表3所示。

    表3 培養(yǎng)條件優(yōu)選結(jié)果

    3 結(jié)論

    從161株乳酸菌中篩選出了41株能耐受H2O2溶液的菌株,對其進行了多種自由基清除能力的實驗,發(fā)現(xiàn)菌株與菌株之間抗氧化性有所區(qū)別,菌株各個部分的抗氧化性也不相同,表明乳酸菌對于不同自由基的清除部位不同。綜合來看菌株各部分抗氧化性由強到弱依次為發(fā)酵上清液,菌懸液,細胞破碎液。再通過測試人工胃腸液與膽鹽耐受性,最終篩選出8株乳酸菌,16S rDNA鑒定分別是乳酸片球菌7株:S5-7、E3-2、B5-8、S4-7、S4-9、B2-1、T2-10;干酪乳桿菌1株:S5-11。對其培養(yǎng)條件優(yōu)化,得到最佳條件培養(yǎng)基初始pH為6.5~7.5、培養(yǎng)時間在18 ~28 h、培養(yǎng)溫度為37 ℃~42 ℃、接種量為2%~3%。這8株抗氧化乳酸菌可為今后開發(fā)具有抗氧化特性的食品奠定基礎(chǔ)。

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