不同還原糖對鰱魚肉糜凝膠品質(zhì)的影響

劉俊雅，施文正，朱學(xué)伸*

（1.江蘇第二師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)化工學(xué)院，江蘇省生物功能分子重點建設(shè)實驗室，江蘇 南京 211200；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306）

鰱魚（Hypophthalmichthys molitrix）是我國價格便宜、產(chǎn)量僅次于草魚的一種大宗淡水魚，鰱魚除了作為活魚出售，主要加工成冷凍魚糜和魚糜制品。但是，相對于其較高的總產(chǎn)量，鰱魚的精深加工程度仍然較低。并且，隨著科技的進(jìn)步和人們生活水平的提高，現(xiàn)有的魚肉制品已不能滿足人們對健康、營養(yǎng)、美味水產(chǎn)品的需求。此外，魚糜在制備過程中需要消耗大量的水，且洗脫過程會造成大量的營養(yǎng)物質(zhì)流失，勢必會造成資源浪費和環(huán)境污染。因此，以未洗脫的魚肉糜進(jìn)行新產(chǎn)品開發(fā)成為新的研究熱點。鰱魚魚肉新產(chǎn)品的開發(fā)，如高蛋白營養(yǎng)食品、休閑風(fēng)味食品等，不僅可以提高鰱魚的附加值，還可以促進(jìn)淡水魚加工產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。

然而，鰱魚蛋白質(zhì)凝膠性差、魚腥味重是限制其精深加工的主要原因。目前，淡水魚糜制品中凝膠增強方式主要以加入多糖、谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶、酚類物質(zhì)、非肉蛋白、畜禽肉或海水魚肉蛋白等外源物質(zhì)為主。淡水魚的腥味去除方法通常有2 種途徑：一種是直接去除腥味物質(zhì)，如鹽水浸泡、除臭劑吸附、漂洗等。另一種是通過產(chǎn)生更多的香氣物質(zhì)來掩蓋腥味物質(zhì)，如香辛料腌制、發(fā)酵、加熱等。然而，目前還沒有相關(guān)研究表明哪種方法或技術(shù)可以在合適條件下同時改善魚肉制品的凝膠特性和揮發(fā)性風(fēng)味特征。

蛋白糖基化是一種蛋白質(zhì)分子修飾技術(shù)，是指食品蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的游離氨基與還原糖中的游離羰基通過美拉德反應(yīng)共價交聯(lián)形成糖蛋白[1]。糖基化可以在不添加任何化學(xué)試劑的情況下自然發(fā)生，并可以在受控條件下避免產(chǎn)生有害健康的二次產(chǎn)物[2]。因此，糖基化是一種“綠色加工技術(shù)”[3]。有研究表明，糖基化可以在合適條件下增強食品蛋白質(zhì)的凝膠性、乳化性、溶解性、抗氧化性等功能性質(zhì)[1,4-5]。此外，蛋白糖基化通常發(fā)生在美拉德反應(yīng)的早期階段[6]，而美拉德反應(yīng)在改善食物色澤、氣味、滋味等方面有顯著效果[7-8]。因此，推測蛋白糖基化在改善鰱魚肉糜凝膠性和氣味方面有很好的可行性。

在凝膠特性方面，Meydani等[9]報道稱，麥芽糊精糖基化可以增強乳清分離蛋白的凝膠硬度和持水力，這是因為高分子質(zhì)量蛋白與多糖接枝物的形成彌補了網(wǎng)絡(luò)的異質(zhì)性，并且糖基化過程中游離氨基的消耗可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)之間靜電斥力降低，形成更緊密的蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)。 Bian Guangliang等[10]發(fā)現(xiàn)，利用葡萄糖胺糖基化可以促進(jìn)正常雞胸肉和類PSE（pale, soft, and exudative）雞胸肉肌原纖維蛋白表面疏水性增加，活性巰基含量下降，導(dǎo)致蛋白質(zhì)凝膠強度增加。然而，也有報道稱，葡聚糖糖基化會降低乳清蛋白的凝膠強度和硬度[11-13]。因此，還原糖的類型可能會影響食物蛋白質(zhì)的質(zhì)構(gòu)特性。在風(fēng)味方面，目前以氨基酸或多肽為氨基來源的美拉德反應(yīng)的相關(guān)報道有很多[14-17]。然而，以蛋白質(zhì)為氨基來源的美拉德反應(yīng)的相關(guān)研究還很有限。作為一種早期的美拉德反應(yīng)，糖基化對含高蛋白的魚肉這一復(fù)雜基質(zhì)的揮發(fā)性風(fēng)味的影響也尚不清楚。

因此，本研究選擇自然界分布最廣泛、最重要的單糖葡萄糖作為其中一個還原糖，并選擇葡萄糖對應(yīng)的寡糖（低聚異麥芽糖）和多糖（葡聚糖）作為還原糖。此外，考慮到低糖飲食的健康策略，木糖和L-阿拉伯糖（2 種新型蔗糖替代品）也被選為還原糖。以5 種不同類型的還原糖作為羰基來源，以鰱魚蛋白質(zhì)作為氨基來源，探究不同類型還原糖對鰱魚肉糜凝膠特性和揮發(fā)性風(fēng)味特征的影響，并結(jié)合感官評價篩選出合適的還原糖類型。本研究將為糖基化在淡水魚高質(zhì)化和高值化加工中的應(yīng)用，以及健康、營養(yǎng)、美味魚肉凝膠類新產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從當(dāng)?shù)爻匈徺I20 條鰱魚（平均體質(zhì)量（5.0±0.5） kg）運送回實驗室。采用頭部重?fù)糁滤溃”橙?。將背肉用絞肉機攪碎，并分裝成400 g/袋，貯存于-80 ℃冰箱待用，1 個月之內(nèi)使用完畢。使用前，放在0～4 ℃冰箱解凍至中心無硬塊。

D-葡萄糖、低聚異麥芽糖、葡聚糖、L-阿拉伯糖、D-木糖（均為分析純） 上海麥克林生化科技有限 公司；鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、甲醇、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、硼砂、β-巰基乙醇（均為分 析純） 上海國藥試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SZ-22A絞肉機 廣州旭眾食品機械有限公司； JJ-2組織搗碎機 常州邁科諾儀器有限公司；H2050R高速冷凍離心機 長沙湘儀有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫攪拌水浴鍋 常州金壇新瑞儀器有限公司；CR-20色差儀 日本Minolta儀器有限公司；FE20數(shù)字pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SMS TA-XT Plus質(zhì)構(gòu)分析儀 英國Stable Micro Systems公司；FOX4000電子鼻 法國Alpha MOS儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 鰱魚肉糜凝膠的制備

稱取200 g鰱魚肉糜，添加5%的還原糖在組織搗碎機中混勻，然后分裝于50 mL離心管中（每管30.0 g）。用離心機500×g低速離心10 min，以去除樣品中的氣泡。將離心管放入90 ℃恒溫水浴鍋中加熱40 min，使肉樣中心溫度達(dá)到72 ℃。以不加糖的樣品為對照組，進(jìn)行相同操作。加熱結(jié)束后，立即放入冰水中停止反應(yīng)。將冷卻后的凝膠樣品放入4 ℃冰箱中過夜，以進(jìn)行下一步分析。樣品測試前在室溫下放置30 min，以恢復(fù)室溫（25 ℃）。

1.3.2 接枝度測定

采用OPA法[18]。OPA試劑的配制：準(zhǔn)確稱取80 mg OPA溶解于2 mL甲醇中，再加入5 mL 20 g/100 mL SDS、50 mL 0.1 mol/L硼砂和200 μLβ-巰基乙醇，最后用蒸餾水定容到100 mL?，F(xiàn)用現(xiàn)配，2 h內(nèi)使用。

取0.50 g樣品與50 mL 50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（含0.1 mol/L NaCl，pH 7.0）混合均質(zhì)，用2 層紗布過濾。取200 μL濾液與4 mL OPA試劑混勻，放入35 ℃水浴鍋中反應(yīng)2 min，立即放入冰水中終止反應(yīng)。使用紫外-可見分光光度計測定樣品在340 nm波長處的吸光度。另取4 mL OPA試劑和200 μL去離子水混合溶液作為測定前去除背景的空白對照。

接枝度為反應(yīng)體系中反應(yīng)前后游離氨基含量的變化率，按式（1）計算。

式中：A0和At分別表示未反應(yīng)和反應(yīng)結(jié)束時樣品所對應(yīng)的吸光度。

1.3.3 色澤測定

將凝膠樣品切成5 mm厚的薄片，用吸水紙擦去表面的水分，在室溫和自然光下，用色差儀測定生肉糜和凝膠樣品的亮度值（L*）、紅度值（a*）和黃度值（b*）。測量前，儀器用白板進(jìn)行校準(zhǔn)。每個處理進(jìn)行3 個重復(fù)。為了進(jìn)一步表征糖基化程度，按 式（2）～（4）計算凝膠樣品的色差值（ΔE）和褐變強度（browning index，BI）[19]。

式中：ΔL*、Δa*和Δb*分別表示凝膠樣品與生肉糜的L*、a*和b*之間的差值。

1.3.4 pH值測定

參照GB 5009.237—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品pH值的測定》。稱量1.00 g肉樣，加入9 mL蒸餾水均質(zhì)，10 000×g離心15 min。收集上清液，并在室溫和自然光下，使用便攜式pH計測量上清液的pH值。每個處理進(jìn)行3 個重復(fù)。

1.3.5 質(zhì)構(gòu)測定

參考Li Ke等[20]的方法，并加以改進(jìn)。將樣品切成高20 mm、直徑25 mm的圓柱。采用質(zhì)構(gòu)分析儀的質(zhì)地剖面分析程序和P50探頭進(jìn)行質(zhì)構(gòu)測試。測試參數(shù)為：測前速率2 mm/s，測試速率1 mm/s，測后速率1 mm/s，壓縮比50%，觸發(fā)力5 g。每個處理進(jìn)行6 個重復(fù)。

1.3.6 感官評價

1.3.6.1 定量描述分析（quantitative descriptive analysis，QDA）

參考Gomez等[21]的方法，采用QDA法對不同還原糖糖基化的樣品進(jìn)行感官評價。首先，參照國家標(biāo)準(zhǔn) GB/T 12313—1990《感官分析方法 風(fēng)味剖面檢驗》、GB/T 16860—1997《感官分析方法 質(zhì)地剖面檢驗》和GB/T 16291.1—2012《感官分析 選拔、培訓(xùn)與管理評價員一般導(dǎo)則 第1部分：優(yōu)選評價員》提出的方法對評價員進(jìn)行篩選和培訓(xùn)。篩選出8 名（3男5女，24～26 歲）食品風(fēng)味方向的研究生組成感官小組。小組成員均熟悉水產(chǎn)品感官品質(zhì)的描述方法和評價流程，至少經(jīng)半年以上的相關(guān)培訓(xùn)。其次，感官小組通過引用參比樣品（表1）對產(chǎn)品感官屬性進(jìn)行描述，并篩選出9 種重要的感官特征：顏色（褐變程度）、質(zhì)構(gòu)（硬度和多汁性）、氣味（氣味強度、魚腥味、肉香味、烤香味和焦糊味）和滋味（滋味強度）。然后對每個特征采用4點標(biāo)度打分：0=沒有、1=輕微、2=中等、3=強烈。其中，氣味強度和滋味強度采用3點標(biāo)度打分：1=低、2=中、 3=高。樣品切成固定大小（2 cm×2 cm×1 cm）的薄片，于感官評價分析室（25 ℃、白熾燈）進(jìn)行感官評定。

表1 用于感官評價的風(fēng)味屬性[22-23]Table 1 Flavor attributes selected for sensory evaluation[22-23]

1.3.6.2 嗜好度評價

參照Alipour等[24]的方法并加以修改。所有的樣品被切成固定大?。? cm×2 cm×1 cm），用7 位隨機數(shù)字編碼，并放在感官評估室桌子上。然后由15 名成員（年齡20～30 歲，食品科學(xué)專業(yè)，女性8 名，男性7 名）對樣品的色澤、硬度、多汁性、風(fēng)味和整體可接受度進(jìn)行評價。感官得分采用9 分嗜好度（1：極其不喜歡；2：非常不喜歡；3：中度不喜歡；4：輕微不喜歡；5：既不喜歡也不討厭；6：輕微喜歡；7：中度喜歡；8：非常喜歡；9：極其喜歡）。所有樣本均在相同環(huán)境下進(jìn)行評估。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用SPSS v21.0軟件（IBM Corporation，NY，USA）對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，選用單因素方差分析和Duncan’s多元檢驗。P＜0.05認(rèn)為差異顯著。用Origin 2019b軟件（OriginLab Corporation，MA，USA）繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同還原糖對鰱魚蛋白質(zhì)接枝度的影響

接枝度表示蛋白質(zhì)和還原糖之間的結(jié)合程度[6,18]。接枝度越高，糖基化程度越高。由圖1可知，木糖與鰱魚蛋白質(zhì)之間的接枝度（（61.89±2.06）%）最高，其次是L-阿拉伯糖（（58.24±0.62）%），而葡聚糖（（44.85±1.48）%）、低聚異麥芽糖（（42.78±0.62）%）、葡萄糖（（40.94±1.39）%）的接枝度依次降低。這一結(jié)果與幾種還原糖的糖基化反應(yīng)活性有關(guān)。單糖的反應(yīng)速率比多糖快，五碳糖比六碳糖的反應(yīng)速率快[25]。以上結(jié)果表明，糖基化程度受還原糖類型的影響。事實上，除了還原糖類型，糖基化程度還受還原糖與蛋白質(zhì)的羰-氨基團比例、加熱時間和溫度、pH值、水分含量和離子強度等的影響[26]。需要根據(jù)實際生產(chǎn)條件選擇最合適的反應(yīng)條件。在本研究中，僅根據(jù)目前的反應(yīng)體系來評價各指標(biāo)的變化。

圖1 鰱魚蛋白質(zhì)與還原糖之間的接枝度Fig. 1 Degree of grafting between silver carp proteins and reducing sugar

2.2 不同還原糖對鰱魚肉糜凝膠色澤的影響

BI反映美拉德反應(yīng)引起的褐變程度[19]，BI越高，褐變程度越高。食物系統(tǒng)的ΔE符合生物體視覺感知褐變的閾值[27]。因此，根據(jù)ΔE可以直觀感知樣品的顏色變化。由表2可知，木糖和L-阿拉伯糖顯著降低了鰱魚肉糜凝膠的L*，顯著增加了a*、b*、ΔE和BI（P＜0.05），其他還原糖對樣品的色澤沒有顯著影響。這與Cai Luyun[28]、Yu Min[29]等的研究結(jié)論一致。他們認(rèn)為L*的下降是由于美拉德反應(yīng)最后階段產(chǎn)生的黑色化合物引起的，a*和b*的增加是由中間或晚期美拉德反應(yīng)生成的綠色和黃色化合物引起的。以上結(jié)果表明，L-阿拉伯糖和木糖的糖基化反應(yīng)活性強、糖基化程度高，有利于增強鰱魚蛋白質(zhì)與還原糖之間的糖基化反應(yīng)。

表2 添加不同還原糖的鰱魚肉糜凝膠色澤變化Table 2 Changes in color of silver carp surimi gels with different reducing sugars

2.3 不同還原糖對鰱魚肉糜凝膠pH值的影響

監(jiān)測pH值變化是評估糖基化程度的有效方法[30]。由圖2可知，添加木糖和L-阿拉伯糖的鰱魚肉糜凝膠的pH值顯著降低（P＜0.05），其他樣品則保持不變。pH值降低是由于美拉德反應(yīng)中間階段有帶電氨基（如賴氨酸）的消耗和有機酸（如甲酸和乙酸）的產(chǎn)生，這個結(jié)果與以往的研究結(jié)果一致[29-30]。同色澤的測定結(jié)果一樣，以上結(jié)果也表明相對于其他糖類，L-阿拉伯糖和木糖這2 種高反應(yīng)活性的還原糖更有利于鰱魚蛋白質(zhì)發(fā)生糖基化反應(yīng)。

圖2 添加不同還原糖的鰱魚肉糜凝膠p值變化Fig. 2 Changes in pH of silver carp surimi gels with different reducing sugars

2.4 不同還原糖對鰱魚肉糜凝膠質(zhì)構(gòu)的影響

由表3可知：與對照組相比，木糖的添加顯著增強了鰱魚肉糜凝膠所有質(zhì)構(gòu)屬性（硬度、彈性、內(nèi)聚性、咀嚼性和回復(fù)性）；L-阿拉伯糖的添加顯著增強了彈性和咀嚼性；而葡萄糖、低聚異麥芽糖和葡聚糖則不同程度降低了樣品的質(zhì)構(gòu)特性。這說明木糖和L-阿拉伯糖可以通過糖基化作用增強鰱魚肉糜凝膠的質(zhì)構(gòu)，其增強效果可能與糖基化程度有關(guān)[11]。Bian Guangliang等[10]解釋糖基化提高類PSE雞胸肉肌原纖維蛋白的凝膠強度，是因為糖基化增加蛋白質(zhì)的表面疏水性，減少活性巰基含量。而葡萄糖等導(dǎo)致的鰱魚肉糜凝膠質(zhì)構(gòu)特性的降低一方面可能與糖基化程度低有關(guān)[11]，另一方面也可能與糖的過量添加有關(guān)[24]。Alipour等[24]報道，添加高濃度的多糖可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)和多糖之間存在對水分子的競爭作用，從而阻礙蛋白質(zhì)在熱變性過程中獲得足量的水以形成三維網(wǎng)絡(luò)凝膠結(jié)構(gòu)，且過量的糖還會阻礙蛋白質(zhì)的交聯(lián)，進(jìn)一步影響成膠性。綜上所述，提高糖基化程度有利于增強鰱魚肉糜凝膠的質(zhì)構(gòu)特性，而糖基化程度受還原糖的種類、分子質(zhì)量及添加量等因素影響。本研究表明，木糖和L-阿拉伯糖可作為還原糖進(jìn)行糖基化，以增強鰱魚肉糜凝膠的質(zhì)構(gòu)。

表3 添加不同還原糖的鰱魚肉糜凝膠質(zhì)構(gòu)特性變化Table 3 Changes in texture properties of silver carp surimi gels with different reducing sugars

2.5 鰱魚肉糜凝膠感官評價

2.5.1 QDA

由圖3可知，與對照組相比，添加L-阿拉伯糖和木糖的鰱魚肉糜凝膠的褐變程度和硬度明顯增加，這與前面分析的色澤和質(zhì)構(gòu)結(jié)果一致。葡萄糖、低聚異麥芽糖和葡聚糖明顯增加了樣品的多汁性，這可能是因為這3 種糖中含有更多的親水基團，有利于截留水分子于蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)中。味覺方面未感受到明顯變化，表明葡萄糖、低聚異麥芽糖、葡聚糖、L-阿拉伯糖和木糖幾種還原糖均沒有影響人體對該產(chǎn)品的味覺感知。氣味方面，對照組的魚腥味較強，加糖加熱后魚腥味均有所減弱。相反，肉香味、烤香味和焦糊味成為主要的香味特征。在所有樣品中，添加木糖的鰱魚肉糜凝膠（接枝度為61.89%）的烤香味和焦糊味得分最高，其次是添加L-阿拉伯糖的鰱魚肉糜凝膠（接枝度為58.24%）。肉香味和烤香味是一種宜人的香氣，而焦糊味則相反，肉香味與噻唑類、硫化物、醛類和酮類物質(zhì)的生成有關(guān)；烤香味主要由吡嗪類、吡咯類和嘧啶類化合物貢獻(xiàn)[28]。此外，由于糖的焦糖化或原料的過度反應(yīng)，烤香味也可能變成令人不愉悅的焦糊味。這種焦糊味可以通過控制糖基化程度來抑制[31]。這些結(jié)果表明，糖基化在合適的接枝度下（大于葡聚糖接枝度且小于木糖接枝度：44.85%～61.89%）是提高鰱魚肉糜凝膠類產(chǎn)品感官品質(zhì)的有效方法。

圖3 添加不同還原糖的鰱魚肉糜凝膠QDA數(shù)據(jù)雷達(dá)圖Fig. 3 Radar plot of QDA data of silver carp surimi gels with different reducing sugars

2.5.2 嗜好度分析

由圖4可知，相較于對照組，添加L-阿拉伯糖和木糖的樣品硬度和風(fēng)味得分較高，說明糖基化可以作為一種有效的凝膠增強和風(fēng)味改良技術(shù)，用于淡水魚凝膠類新產(chǎn)品的開發(fā)。然而，嚴(yán)重的褐變是不受喜愛的，會嚴(yán)重影響評價員對產(chǎn)品的整體可接受度。事實上，前期研究已經(jīng)表明，輕微的褐變不會影響產(chǎn)品的整體可接受 度[31]，甚至?xí)黾幽贻p消費群體對產(chǎn)品的喜愛度。因此，在進(jìn)行新產(chǎn)品開發(fā)時，要重點控制糖基化程度（通過減少糖含量、加熱時間、溫度等），使接枝度盡量控制在44.85%～61.89%，才能在改進(jìn)質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味的基礎(chǔ)上還能滿足消費者對產(chǎn)品顏色的需求。

圖4 添加不同還原糖的鰱魚肉糜凝膠的嗜好度得分雷達(dá)圖Fig. 4 Radar map of the hedonic scores of silver carp surimi gels with different reducing sugars

3 結(jié) 論

L-阿拉伯糖和木糖可以有效增強鰱魚肉糜凝膠的質(zhì)構(gòu)和香氣，且增強效果與糖基化程度有關(guān)。當(dāng)接枝度增大到58.24%時，鰱魚肉糜凝膠的pH值降低，褐變增加。QDA發(fā)現(xiàn)，當(dāng)接枝度達(dá)到58.24%時，可以降低鰱魚肉糜凝膠的魚腥味，增加肉香味、烤香味和焦糊味；但當(dāng)接枝度達(dá)到61.89%時，令人不愉悅的焦糊味會變成主要的香氣特性。喜好度評價表明，要控制接枝度在44.85%～61.89%，才能獲得整體可接受度較好的產(chǎn)品。本研究表明，L-阿拉伯糖和木糖是2 種較好的羰基來源，可以通過糖基化作用增強鰱魚肉糜凝膠的質(zhì)構(gòu)和香氣。本研究為糖基化在淡水水產(chǎn)品精深加工中的應(yīng)用和風(fēng)味休閑水產(chǎn)制品的開發(fā)提供了理論依據(jù)和技術(shù)支持。