外源酶對(duì)陳年武夷巖茶香氣品質(zhì)的改善作用

謝李玲，薛婉茹，李丹陽(yáng)，周惠媛，孟春，洪晶

（福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 350000）

武夷巖茶是烏龍茶的一種，中國(guó)十大名茶之一。“巖茶風(fēng)味”是指在加工過程中由前體產(chǎn)生的醇厚口感和特有花香[1]。迄今為止，已從各種茶葉中發(fā)現(xiàn)了700多種香氣物質(zhì)，包括醇類、醛類、酮類、酯類、內(nèi)酯類、酸類、酚類、碳水化合物等十余類化合物，其中又以醇類、酯類、酮類、醛類和碳水化合物為主[2-4]。

茶香氣是茶葉最重要的品質(zhì)之一，它影響著茶葉的感官特征和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是評(píng)價(jià)茶葉質(zhì)量?jī)?yōu)劣的重要指標(biāo)之一[5]。由于香氣物質(zhì)在茶葉中含量低（質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅0.1%左右）、種類多、易揮發(fā)、提取過程中易發(fā)生各種復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，因而在茶葉深加工過程中香氣物質(zhì)易香氣混雜、損耗及變化而導(dǎo)致香氣低沉惡化[6]。隨著國(guó)內(nèi)外研究的深入，消費(fèi)者對(duì)茶葉香氣的品質(zhì)要求越來(lái)越高，因此，如何提高低檔茶的香氣，成為一個(gè)重要的研究課題[7]。

酶解發(fā)酵技術(shù)是改善茶香氣的眾多方法中較為有效的方法[8]。Rigling等[9]研究發(fā)現(xiàn)綠茶發(fā)酵后，香葉醇、芳樟醇等香氣物質(zhì)顯著增加，且茶葉香氣從原有的青草香轉(zhuǎn)為更令人喜愛的花香。Xiao等[10]用冠突散囊菌處理夏秋茶，結(jié)果表明具有花香氣的萜烯醇含量明顯增加，夏秋茶苦澀味減弱。張良楨[11]研究發(fā)現(xiàn)黑曲霉胞外酶液處理烏龍茶粉后苯甲醛、順-3-己烯醇等的含量明顯增加。繆鳳等[12]研究發(fā)現(xiàn)添加外源纖維素酶可以促進(jìn)紅茶香氣化合物產(chǎn)生，加快花香類化合物的轉(zhuǎn)化，從而改善紅茶品質(zhì)。Kinugasa等[13]發(fā)現(xiàn)在綠茶罐裝茶水中加入果膠酶可釋放出大量芳樟醇和香葉醇。Su等[14]、Zhang等[15]研究表明β-葡萄糖苷酶可提高茶葉中香氣物質(zhì)的含量，如香葉醇、順-3-己烯醇。

相關(guān)研究表明，合理貯藏有利于提高武夷巖茶的感官品質(zhì)[16]，而本研究采用的低檔陳年武夷巖茶由于儲(chǔ)存不當(dāng)，導(dǎo)致香氣低沉惡化。雖然已有研究報(bào)道關(guān)于酶對(duì)茶香氣的影響，但由于不同茶葉中的香氣前體物質(zhì)不同，目前尚未有研究探究酶解對(duì)陳年武夷巖茶香氣的釋放作用。因此，本文運(yùn)用纖維素酶、果膠酶、漆酶、β-葡萄糖苷酶對(duì)陳年武夷巖茶進(jìn)行處理，研究單一酶及復(fù)合酶對(duì)武夷巖茶揮發(fā)性成分種類、含量的影響，為提高低檔巖茶的香氣提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

陳年武夷巖茶：市售；纖維素酶（50 U/g）、果膠酶（500 U/g）、漆酶（120 U/g）、β-葡萄糖苷酶（100 U/g）：上海源葉生物科技有限公司；α-半乳糖苷酶（9 000 U/g）：南京都萊生物技術(shù)有限公司；2-辛醇（10 mg/L）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；氯化鈉（分析純）、無(wú)水乙醇（色譜純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；芳樟醇、順3-己烯醇、苯乙醛、2，5-二甲基吡嗪、反式-α-紫羅蘭酮（均為色譜純）：Sigma-Aldrich公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

7890B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、Agilent HP-INNOWAX 彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）：美國(guó)安捷倫科技公司；Supleco固相微萃取裝置（50/30 μm DVB/CAR/PDMS）：美國(guó) Supelco 公司；98-T-B電子調(diào)溫電熱套：天津市泰斯特儀器有限公司；SHAC恒溫振蕩器：國(guó)華（常州）儀器制造有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；24/29型水蒸氣蒸餾裝置：四川蜀玻（集團(tuán)）有限責(zé)任公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 武夷巖茶香氣物質(zhì)的提取

采用水蒸氣蒸餾法提取陳年武夷巖茶中的香氣物質(zhì)，具體方法：5 g武夷巖茶加入到含有100 mL超純水的圓底燒瓶中，加適量酶在50℃下酶解2 h后，進(jìn)行水蒸氣蒸餾，蒸餾完畢后，收集餾出液。

1.2.2 武夷巖茶香氣物質(zhì)的檢測(cè)

頂空固相微萃?。╤eadspace solid phase microex traction，HS-SPME）萃取過程：取1.2.1中的餾出液樣品 6 mL，加入 10 μL 2-辛醇（10 mg/L）和 2.0 g氯化鈉。60℃水浴加熱15 min后，插入已老化的萃取針，頂空吸附45 min后通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀進(jìn)樣，250 ℃條件下解吸5 min。

GC-MS分析條件：色譜柱為HP-INNOWAX彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度為250℃；升溫程序：初始柱溫40℃，保持5 min，以5℃/min升至240℃，保持5 min，后運(yùn)行時(shí)間5 min；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：電離方式為電子轟擊電離源（electronic ionization，EI），電子能量為70eV，離子源溫度為 230℃，質(zhì)量掃描范圍為m/z 35 amu～450 amu。

定性定量分析：將GC-MS檢測(cè)的物質(zhì)與NIST.11 library相匹配，從而確定揮發(fā)性成分。利用被測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物（2-辛醇）峰面積的比值計(jì)算茶葉中揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)含量。

以醇類、酯類、醛類、酮類、香氣物質(zhì)總量及武夷巖茶中主要揮發(fā)性成分含量為指標(biāo)，對(duì)武夷巖茶香氣物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 武夷巖茶香氣物質(zhì)的增香工藝研究

1.2.3.1 復(fù)合酶種類的篩選

以纖維素酶加果膠酶為基礎(chǔ)，分別復(fù)配不同的復(fù)合酶酶解武夷巖茶（每種酶的添加量為2 mg）。具體復(fù)合酶添加方式：a對(duì)照組（control check，ck），不加酶；b酸解+纖維素酶+果膠酶+β-葡萄糖苷酶；c纖維素酶+果膠酶+α-半乳糖苷酶；d纖維素酶+果膠酶+漆酶；e纖維素酶+果膠酶+β-葡萄糖苷酶；f纖維素酶+果膠酶+漆酶+α-半乳糖苷酶；g纖維素酶+果膠酶+漆酶+β-葡萄糖苷酶，按照1.2.1的方法進(jìn)行提取，再按照1.2.2中的方法進(jìn)行分析和檢測(cè)。

1.2.3.2 單因素試驗(yàn)

按照1.2.1的方法研究單一酶不同添加量酶解武夷巖茶的單因素試驗(yàn)，具體加酶量為纖維素酶（0.15 U/g～0.60 U/g）、果膠酶（1.5 U/g～6.0 U/g）、漆酶（0.36 U/g～1.44 U/g）、β-葡萄糖苷酶（0.3 U/g～1.2 U/g）。將所有樣品按照1.2.2中的方法進(jìn)行分析和檢測(cè)。

1.2.3.3 正交試驗(yàn)

選取纖維素酶、果膠酶、漆酶和β-葡萄糖苷酶復(fù)合酶體系，以不同加酶量為因素，各取3個(gè)水平，進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)以確定最優(yōu)復(fù)合酶配比。按照1.2.1的方法提取茶香氣物質(zhì)，按照1.2.2中的方法進(jìn)行香氣物質(zhì)的檢測(cè)。因素及水平如表1所示。

表1 因素及水平Table 1 Factors and levels

1.2.4 感官評(píng)價(jià)

參考相關(guān)文獻(xiàn)[17-20]，選取青草香、花香、木香、甜香和烘烤香5種香氣屬性作為感官評(píng)價(jià)指標(biāo)。取一定體積的無(wú)水乙醇將標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋成1、5、9分對(duì)應(yīng)的濃度，并建立武夷巖茶感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，具體標(biāo)準(zhǔn)見表2，選取12名感官評(píng)價(jià)成員（20歲～40歲，包括8名女性和4名男性）對(duì)酶解后的茶湯在（25±2）℃的潔凈環(huán)境中進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。其中1分表示香氣強(qiáng)度較低，5分表示香氣強(qiáng)度中等，9分表示香氣強(qiáng)度較高。

表2 武夷巖茶感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 The sensory evaluation standards of Wuyi rock tea

1.2.5 香氣活性值（odor activity value，OAV）的計(jì)算

OAV為某香氣成分的濃度與其嗅覺閾值的比值，查找相關(guān)文獻(xiàn)[18，21]獲得閾值，再根據(jù)定量結(jié)果計(jì)算OAV值，計(jì)算公式如下。

式中：Ci為香氣成分的濃度，μg/L；OTi為該香氣成分的閾值，μg/L。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)重復(fù)3次，使用SPSS statistics 18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析，利用Mini-tab 17進(jìn)行正交方差分析和極差分析，利用SIMCA 14.1軟件進(jìn)行主成分分析，使用R 4.05進(jìn)行聚類熱圖分析。試驗(yàn)結(jié)果顯著性水平為p＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合酶種類對(duì)陳年武夷巖茶揮發(fā)性成分的影響

雪松醇是陳年白茶的主要成分，這可能是構(gòu)成陳年武夷巖茶香氣陳純的物質(zhì)基礎(chǔ)[21]。具有花果香的香葉醇、芳樟醇、橙花叔醇等醇類物質(zhì)，其含量與組成對(duì)烏龍茶香氣品質(zhì)的形成起著關(guān)鍵作用[22]。醇類成分基本上是做青過程中經(jīng)酶水解糖苷配基而形成的，已有研究表明可以通過添加外源酶來(lái)促進(jìn)糖苷類香氣前體充分水解釋放出糖苷配基，從而形成游離態(tài)的芳香物質(zhì)[23]。

不同復(fù)合酶酶解陳年武夷巖茶的GC-MS分析結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同復(fù)合酶處理對(duì)武夷巖茶香氣物質(zhì)含量和峰數(shù)的影響Fig.1 Effect of different complex enzymes treatment on the aroma substances content and peak number of Wuyi rock tea

由圖1可知，武夷巖茶若先酸解再加入復(fù)合酶，揮發(fā)性成分的數(shù)量與對(duì)照組相比顯著減少（p＜0.05），說(shuō)明酸解可能會(huì)使武夷巖茶中原有的香氣物質(zhì)被水解，而其他復(fù)合酶組的揮發(fā)性成分與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異（p＞0.05）。復(fù)合酶處理（除b組外）可以顯著提高香氣物質(zhì)含量（p＜0.05），其中f組、g組對(duì)香氣物質(zhì)總量的增加較為有效，分別提高了96%、109%，其次是d組和e組，分別提高了82%、79%。b組與對(duì)照組相比，其香氣物質(zhì)含量變化不大，但香氣物質(zhì)的個(gè)數(shù)卻大幅減少，這表明酸解不利于陳年武夷巖茶香氣物質(zhì)的釋放。綜上，最終選擇復(fù)合酶種類為纖維素酶、果膠酶、漆酶和β-葡萄糖苷酶。

2.2 不同酶添加量對(duì)陳年武夷巖茶揮發(fā)性成分影響

2.2.1 纖維素酶對(duì)陳年武夷巖茶香氣物質(zhì)的影響

不同纖維素酶添加量對(duì)陳年武夷巖茶香氣物質(zhì)的影響如圖2所示。

圖2 纖維素酶不同添加量對(duì)武夷巖茶揮發(fā)性組分和特征香氣的影響Fig.2 Effects of different concentration of cellulase on volatile components and characteristic aroma of Wuyi rock tea

由圖2可知，陳年武夷巖茶原料中的雪松醇（木香）、橙花叔醇（花果香）、β-紫羅蘭酮（花果香）、苯乙醇（甜香、花香）、香葉醇（花香、甜香）含量較高。雪松醇是陳年白茶的主要成分，這可能是陳年武夷巖茶香氣陳純的物質(zhì)基礎(chǔ)[21]；具有花果香的香葉醇、芳樟醇、橙花叔醇等醇類物質(zhì)，其含量與組成對(duì)烏龍茶香氣品質(zhì)的形成起著關(guān)鍵作用[22]。與對(duì)照組相比，纖維素酶處理后醇類、酯類、酮類及香氣總量均明顯提高。隨著纖維素酶添加量的增加，各香氣組分呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，研究表明苯丙氨酸是苯乙醇前體物質(zhì)，苯丙氨酸被苯乙醛合酶催化形成苯乙醛，再通過芳基脫氫酶轉(zhuǎn)化為苯乙醇，由此可以推測(cè)苯乙醇的來(lái)源可能與纖維素酶促進(jìn)苯丙氨酸轉(zhuǎn)化有關(guān)[24-25]。大多數(shù)香氣物質(zhì)在纖維素酶添加量為0.30 U/g～0.45 U/g時(shí)達(dá)到最高值，這是因?yàn)槔w維素酶能作用于茶葉的細(xì)胞壁，破壞細(xì)胞壁中的不溶性纖維素，增加細(xì)胞的通透性，從而提高香氣物質(zhì)的得率。但隨著纖維素酶添加量的持續(xù)增加，纖維素酶無(wú)法進(jìn)一步水解纖維素，香氣物質(zhì)不再增加，而游離的香氣物質(zhì)被進(jìn)一步水解，導(dǎo)致香氣物質(zhì)含量降低[26]。因此，大部分的香氣物質(zhì)在纖維素酶添加量為0.30 U/g時(shí)酶解效果最佳。

2.2.2 果膠酶對(duì)陳年武夷巖茶香氣物質(zhì)的影響

歐伊伶[27]在研究櫧葉齊夏秋烏龍茶時(shí)發(fā)現(xiàn)，果膠酶一方面增加細(xì)胞間通透性，另一方面能引起細(xì)胞的胞間層解體，釋放出能引發(fā)脅迫響應(yīng)的低聚糖和一些與香氣形成關(guān)聯(lián)密切的糖苷酶類物質(zhì)，從而間接地促進(jìn)櫧葉齊夏秋烏龍茶內(nèi)含生化成分的轉(zhuǎn)化和香氣品質(zhì)的形成。不同果膠酶添加量對(duì)陳年武夷巖茶香氣物質(zhì)的影響如圖3所示。

圖3 果膠酶不同添加量對(duì)武夷巖茶揮發(fā)性組分和特征香氣的影響Fig.3 Effects of different concentration of pectinase on volatile components and characteristic aroma of Wuyi rock tea

由圖3A可知，隨著果膠酶添加量的增加，香氣物質(zhì)總量、酯類、醛類、酮類均先增加后趨于平緩，當(dāng)果膠酶濃度高于3.0 U/g時(shí)，這些香氣物質(zhì)含量無(wú)顯著差異（p＞0.05）。而醇類物質(zhì)隨著果膠酶添加量的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在果膠酶添加量達(dá)到4.5 U/g時(shí)，醇類物質(zhì)含量達(dá)到最高值，但是與3.0 U/g時(shí)沒有顯著差異（p＞0.05）。綜上，果膠酶添加量為3.0U/g時(shí)，陳年武夷巖茶的增香效果最佳。

由圖3B可知，橙花叔醇、β-紫羅蘭酮、香葉醇、芳樟醇、吲哚、水楊酸甲酯的含量隨果膠酶添加量的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，并在果膠酶添加量4.5 U/g時(shí)均達(dá)到最高值，但是與果膠酶添加量為3.0 U/g時(shí)相差不大，說(shuō)明適宜的果膠酶添加量有利于這些香氣物質(zhì)的釋放，過低可能酶解不完全，過高可能使游離的揮發(fā)性物質(zhì)被水解。

2.2.3 漆酶對(duì)陳年武夷巖茶香氣物質(zhì)的影響

不同漆酶添加量對(duì)陳年武夷巖茶香氣物質(zhì)的影響如圖4所示。

圖4 漆酶不同添加量對(duì)武夷巖茶揮發(fā)性組分和特征香氣的影響Fig.4 Effects of different concentration of laccase on volatile components and characteristic aroma of Wuyi rock tea

由圖4A可知，從醇類含量、香氣物質(zhì)含量總量來(lái)看，當(dāng)漆酶的濃度為0.36 U/g時(shí)，其增香效果顯著高于對(duì)照組（p＜0.05），再繼續(xù)增加漆酶添加量，這些香氣物質(zhì)無(wú)顯著變化（p＞0.05）。在漆酶量為0.72 U/g時(shí)，酯類、醛類及酮類的含量達(dá)到較高水平，繼續(xù)增大漆酶添加量時(shí)，這些香氣物質(zhì)含量變化趨于平緩或有所降低，這可能是由于當(dāng)漆酶添加量增加到一定程度時(shí)，漆酶無(wú)法進(jìn)一步把木質(zhì)素降解為小分子物質(zhì)，不利于茶葉內(nèi)部物質(zhì)發(fā)生轉(zhuǎn)變，無(wú)法形成更多有利于香氣品質(zhì)的成分[28]。肖世青[29]的研究表明，漆酶能增加酯類香氣物質(zhì)的含量，而本文結(jié)果表明漆酶不僅能提高酯類含量，還能提高其他香氣組分含量。

由圖4B可知，隨著漆酶添加量的增加，大部分的香氣物質(zhì)呈現(xiàn)先升高后緩慢降低的趨勢(shì)，大部分的香氣物質(zhì)如橙花叔醇、香葉醇、芳樟醇、吲哚、水楊酸甲酯等在漆酶添加量為0.72 U/g時(shí)達(dá)到最高值。綜上所述，漆酶濃度為0.72 U/g時(shí)增香效果最佳。

2.2.4 β-葡萄糖苷酶對(duì)陳年武夷巖茶香氣物質(zhì)的影響

不同β-葡萄糖苷酶添加量對(duì)陳年武夷巖茶香氣物質(zhì)的影響如圖5所示。

圖5 β-葡萄糖苷酶不同添加量對(duì)武夷巖茶揮發(fā)性組分和特征香氣的影響Fig.5 Effects of different concentration of β-glucosidase on volatile components and characteristic aroma of Wuyi rock tea

由圖5A可知，隨著β-葡萄糖苷酶添加量的增加，香氣物質(zhì)的總量、酯類和酮類的含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，但是對(duì)醛類物質(zhì)沒有顯著影響（p＞0.05）。武夷巖茶中的重要特征香氣成分，如橙花叔醇、香葉醇等醇系香氣物質(zhì)，大多是以糖苷類香氣物質(zhì)為前體經(jīng)水解游離形成，β-葡萄糖苷酶可促進(jìn)鍵合態(tài)的糖苷的香氣前體水解成游離的香氣物質(zhì)，從而增加茶湯中茶香氣物質(zhì)的含量，當(dāng)β-葡萄糖苷酶的添加量繼續(xù)增加時(shí)，茶中的糖苷香氣前體基本上已經(jīng)完全游離，因此香氣物質(zhì)含量不會(huì)繼續(xù)增加；香氣物質(zhì)含量降低可能是因?yàn)棣?葡萄糖苷酶可以促進(jìn)游離香氣物質(zhì)進(jìn)一步反應(yīng)[6]。

由圖5B可知，在β-葡萄糖苷酶的作用下，芳樟醇、香葉醇、水楊酸甲酯等糖苷前體的揮發(fā)性化合物含量整體呈增加的趨勢(shì)，這與Su等[14]、Supriyadi等[30]的研究結(jié)果一致，且香葉醇含量隨β-葡萄糖苷酶添加量的增加而增加。大多數(shù)的香氣物質(zhì)如橙花叔醇、β-紫羅蘭酮、吲哚、雪松醇、水楊酸甲酯、苯乙醇含量在β-葡萄糖苷酶添加量為0.60 U/g時(shí)，達(dá)到最高值，且β-紫羅蘭酮的含量在加酶處理組中的含量均明顯高于對(duì)照組，Wang等[20]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)β-葡萄糖苷酶處理綠茶后，其β-紫羅蘭酮的含量增加，這與本研究結(jié)果相一致。

2.3 復(fù)合酶配比對(duì)陳年武夷巖茶揮發(fā)性成分的影響

以單一酶添加量的試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，挑選出纖維素酶、果膠酶、漆酶和β-葡萄糖苷酶的3個(gè)酶濃度水平，進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)的結(jié)果及極差分析如表3所示。

表3 復(fù)合酶配比正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal test of complex enzymes ratio

續(xù)表3 復(fù)合酶配比正交試驗(yàn)結(jié)果Continue table 3 Results of orthogonal test of complex enzymes ratio

由表3可知，影響香氣物質(zhì)總量的因素主次順序?yàn)?C＞A＞D＞B，A2B1C2D3組合的增香效果最佳。

香氣物質(zhì)的總量方差分析見表4。

表4 香氣物質(zhì)的總量方差分析Table 4 Analysis of variance of total aroma substances

由表 4可知，A（纖維素酶）、C（漆酶）、D（β-葡萄糖苷酶）對(duì)香氣總量的提高有顯著效果（p＜0.05），B（果膠酶）在提高香氣物質(zhì)總量時(shí)沒有顯著影響（p＞0.05），各試驗(yàn)組的香氣物質(zhì)含量見圖6。

圖6 復(fù)合酶配比正交試驗(yàn)結(jié)果Fig.6 Orthogonal test results of the complex enzymes ratio

由圖6可知，正交試驗(yàn)第4組的香氣物質(zhì)含量最高，從成本角度考慮，最終確定最優(yōu)復(fù)合酶配比組合為A2B1C2D3，即纖維素酶、果膠酶、漆酶、β-葡萄糖苷酶的質(zhì)量比為2∶1∶2∶3是最佳的復(fù)合酶配比，此時(shí)香氣物質(zhì)總量可高達(dá)6 455.96 μg/L，是對(duì)照組的2.14倍；醇類香氣物質(zhì)可高達(dá)2 399.89 μg/L，是對(duì)照組的2.75倍，說(shuō)明當(dāng)纖維素酶、果膠酶、漆酶、β-葡萄糖苷酶的質(zhì)量比為2∶1∶2∶3時(shí)，對(duì)香氣物質(zhì)含量的增加效果最佳。

2.4 單一酶及復(fù)合酶酶解陳年武夷巖茶的揮發(fā)性成分對(duì)比

為了進(jìn)一步比較單一酶及復(fù)合酶對(duì)陳年武夷巖茶揮發(fā)性香氣成分的影響，對(duì)單一酶及復(fù)合酶的增香效果進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖7所示。

圖7 最優(yōu)酶解水平的揮發(fā)性物質(zhì)組分含量及比例Fig.7 Volatile substance component content and ratio at optimal enzymatic hydrolysis level

由圖7A可知，單一酶和復(fù)合酶均能明顯提高陳年武夷巖茶的香氣物質(zhì)含量。對(duì)于香氣物質(zhì)總量、醇類含量、酯類含量來(lái)說(shuō)，復(fù)合酶的增香效果最佳；醛類物質(zhì)的含量在單一酶解處理過程中含量較高，復(fù)合酶（A2B1C2D3）對(duì)醛類香氣物質(zhì)的增香效果與對(duì)照組無(wú)顯著差異（p＞0.05），Supriyadi等[30]的結(jié)果表明 β-葡萄糖苷酶的加入可以加速酶的氧化反應(yīng)，從而使許多苯甲醇化合物轉(zhuǎn)化為苯甲醛，所以推測(cè)醛類香氣物質(zhì)的增加可能是在酶的作用下，醇類物質(zhì)氧化生成醛；對(duì)于酮類物質(zhì)來(lái)說(shuō)，與對(duì)照組相比，單一酶及復(fù)合酶處理均能顯著提高其含量（p＜0.05），但是各加酶組之間無(wú)顯著差異（p＞0.05）。

由圖7B可知，酶解作用對(duì)香氣物質(zhì)組分的比例略有影響，除了A2組（纖維素酶組），其他加酶組中的醇類物質(zhì)比例均高于對(duì)照組，尤其是A2B1C2D3組（復(fù)合酶），醇類物質(zhì)達(dá)到37.20%；酮類物質(zhì)的比例在對(duì)照組、A2組、B2組、D2組均為24%左右，在C2（漆酶）組為23.32%、A2B1C2D3（復(fù)合酶）組為22.22%；其他組分中，A2B1C2D3（復(fù)合酶）組的比例也是最高的，可能是由于酸類物質(zhì)（如辛酸、癸酸）、含氮類物質(zhì)（如吲哚）等其他揮發(fā)性物質(zhì)含量增加。

對(duì)單一酶及復(fù)合酶最優(yōu)酶解武夷巖茶的主要揮發(fā)性化合物進(jìn)行聚類熱圖分析，如圖8所示。

圖8 最優(yōu)酶解水平主要揮發(fā)性成分聚類熱圖分析Fig.8 Heatmap analysis of major volatile components for the optimal enzymatic hydrolysis level

由圖8可知，武夷巖茶中的主要香氣物質(zhì)被聚類為 4 類，第一類包括反-2，6-壬二醛、（E，E）-2，4-己二烯醛、2，2，6-三甲基環(huán)己酮、2，5-二甲基吡嗪、己醛、反式-2-己烯醛。這些成分在復(fù)合酶組中的含量很低或沒有，具有青草香的己醛和反式-2-己烯醛在A2（纖維素酶）和B2（果膠酶）組中的含量明顯高于其他組分。

第二類包括（E，E）-2，4-庚二烯醛、4-羥基苯丙酮、β-環(huán)檸檬醛、反式-2-壬烯醛、5-甲基呋喃醛、1-辛醇、水楊酸甲酯、6-甲基-3，5-戊二烯-2-酮、α-松油醇、芳樟醇、吲哚、苯乙腈、3，5辛二烯-2酮，這些物質(zhì)在對(duì)照組中的含量很低或沒有，說(shuō)明其主要在加酶后產(chǎn)生。具有花果香的α-松油醇、芳樟醇、吲哚、β-環(huán)檸檬醛以及青草香的3，5辛二烯-2酮在C2（漆酶）組中含量較高。

第三類包括α-柏木烯、癸醛、己酸葉醇酯、正己醇、青葉醇、（E）-β-金合歡烯、植酮、辛酸、茉莉內(nèi)酯、β-紫羅蘭酮、4-[2，2，6-三甲基-7-氧雜二環(huán)[4.1.0]庚-1-基]-3-丁烯-2-酮、大馬酮、香葉醇、橙花醇、酞酸二乙酯、苯甲醛、雪松醇、柳酸芐酯、庚酸、棕櫚酸甲酯、金合歡醇、反式-2，4-癸二烯醛、丙位壬內(nèi)酯、橙花叔醇、苯甲酸己酯、鄰苯二甲酸酯、棕櫚酸、3-甲基吲哚、鄰苯二甲酸二丁酯、苯乙酮，這些物質(zhì)在對(duì)照組中的含量很低或沒有。具有果香氣的癸醛、己酸葉醇酯及青草香的正己醇、青葉醇在復(fù)合酶處理組中含量較高，在其他酶處理組中含量相近；具有茉莉花香的茉莉內(nèi)酯、紫羅蘭香的β-紫羅蘭酮、玫瑰花的香葉醇在復(fù)合酶組中含量較高，其次是D2（β-葡萄糖苷酶）組；橙花叔醇作為高品質(zhì)烏龍茶的一個(gè)重要指標(biāo)，具有花果香、甜香，在復(fù)合酶組中有較高的含量，說(shuō)明復(fù)合酶處理對(duì)提高武夷巖茶品質(zhì)有明顯效果。陳茶中特有的具有木香的雪松醇，在復(fù)合酶組中含量較高，其次是D2（β-葡萄糖苷酶）組。酸類物質(zhì)在復(fù)合酶處理組中也有較多的積累，可能是由于醇類化合物的羥基不穩(wěn)定，易氧化成醛，進(jìn)一步氧化成酸，這一現(xiàn)象在紅茶的發(fā)酵階段尤為常見[31]。

第四類包括月桂烯、壬醛、亞油酸甲酯、2-丁基-3，5-二甲基吡嗪、苯甲醇、順式-3-己烯醇、2-甲基丁酸酯、二苯甲酮、香葉基丙酮、苯乙醇，這些物質(zhì)在對(duì)照組和C2（漆酶）組中含量較低。其中，具有青草香、甜香的壬醛在A2（纖維素酶）組中含量較高；具有甜香脂、木香的月桂烯、亞油酸甲酯在C2（漆酶）組中含量較低，在B2（果膠酶）和D2（β-葡萄糖苷酶）組中含量較高；具有花果香的香葉基丙酮在對(duì)照組中并沒有檢測(cè)到，而在D2（β-葡萄糖苷酶）和A2B1C2D3（復(fù)合酶）組中，其含量明顯高于其他加酶組。

2.5 酶處理對(duì)陳年武夷巖茶香氣物質(zhì)的OAV及感官評(píng)分的影響

根據(jù)GC-MS檢測(cè)到的揮發(fā)性物質(zhì)濃度和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的氣味閾值，計(jì)算各成分的OAV值。香氣強(qiáng)度值大于1才能達(dá)到人體嗅覺感知的強(qiáng)度，因此選取計(jì)算后OAV值大于1的揮發(fā)性成分共15個(gè)，結(jié)果見表5。

表5 不同酶處理的香氣強(qiáng)度值（OAV＞1）Table 5 Odor activity value for different enzymes treatments（OAV＞1）

從表 5 可以看出，在纖維素酶（A2）、果膠酶（B2）、漆酶（C2）、β-葡萄糖苷酶（D2）、復(fù)合酶（A2B1C2D3）的作用下，陳年武夷巖茶的OVA總值從373.89分別增至572.18、604.86、556.26、670.39、764.28，其中，貢獻(xiàn)最大的是復(fù)合酶，其次是β-葡萄糖苷酶。

圖9為不同酶處理組的感官評(píng)分雷達(dá)圖。

圖9 不同酶處理的感官評(píng)分雷達(dá)圖Fig.9 Radar map of different enzymes treatments

由圖9可知，加酶組明顯提高了武夷巖茶的花香、甜香、木香，烘烤香有所降低，烘烤香可能被具有花果香的香氣物質(zhì)覆蓋。Zhang等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，β-葡萄糖苷酶處理明顯提高了花香，削弱了焦糖香；肖世青[29]研究表明，漆酶和α-半乳糖苷酶復(fù)合處理夏季烏龍茶后，茶葉青氣消失，花香顯現(xiàn)，這與本文結(jié)果相一致。

在A2B1C2D3（復(fù)合酶）組中，橙花叔醇（OAV 97.21）、β-紫羅蘭酮（OAV 67.10）、香葉醇（OAV 64.99）有著很高的香氣強(qiáng)度值，這些物質(zhì)主要呈現(xiàn)花果香、甜香的香氣特征，該結(jié)果與感官評(píng)價(jià)中復(fù)合酶組顯示出較高的花香、甜香相符合，說(shuō)明復(fù)合酶酶解對(duì)提高武夷巖茶的花果香有很大的貢獻(xiàn)。A2（纖維素酶）組中，具有青草香、果香的己醛（OAV 16.41）、壬醛（OAV 25.09）、2-己烯醛（OAV 1.58）、（E，E）-2，4-己二烯醛（OAV 1.34）的OAV高于其他酶解組，該結(jié)果與感官評(píng)分雷達(dá)圖中A2組具有較高青草香得分的結(jié)果相一致。具有木香的雪松醇，由于其閾值較低，OAV呈現(xiàn)較高值，尤其在復(fù)合酶組中其含量高達(dá)469.60，在感官評(píng)價(jià)中木香呈現(xiàn)最高分。

3 結(jié)論

加入生物酶處理能夠明顯提高陳年武夷巖茶的香氣物質(zhì)含量，其中復(fù)合酶（纖維素酶+果膠+漆酶+β-葡萄糖苷酶）對(duì)武夷巖茶的增香效果最好，而先酸解再進(jìn)行酶解則不能提高香氣物質(zhì)的種類及含量。纖維素酶、果膠酶、漆酶、β-葡萄糖苷酶的質(zhì)量比為2∶1∶2∶3時(shí)最有利于香氣物質(zhì)的釋放，此時(shí)的香氣總量為6 455.96 μg/L，是對(duì)照組的 2.14 倍。

單一酶和復(fù)合酶處理對(duì)提高醇類、酯類香氣物質(zhì)有較好的效果；對(duì)于醛類物質(zhì)來(lái)說(shuō)，單一酶的增香效果優(yōu)于復(fù)合酶處理；對(duì)于酮類物質(zhì)，單一酶及復(fù)合酶處理均能明顯提高其含量。感官評(píng)價(jià)和香氣強(qiáng)度值（OAV）的結(jié)果表明，武夷巖茶主要呈現(xiàn)花香、甜香、木香，單一酶處理后花香、甜香、木香明顯增強(qiáng)，尤其是β-葡萄糖苷酶的效果最佳，這可能是由于具有花香、甜香的橙花叔醇、香葉醇、芳樟醇、β-紫羅蘭酮及具有木香的雪松醇等香氣物質(zhì)的OAV明顯增大；復(fù)合酶處理下，花香、甜香、木香進(jìn)一步增強(qiáng)，但是青草香降低，主要是由于己醛、2-己烯醛、（E，E）-2，4-己二烯醛的OAV值降低，纖維素酶處理能增強(qiáng)青草香。本研究通過復(fù)合酶解技術(shù)增強(qiáng)了武夷巖茶花香、甜香、木香的香氣屬性，為提高陳年低檔巖茶的利用率及改良其風(fēng)味提供參考。