粗糙脈孢菌發(fā)酵豆渣產(chǎn)物的品質(zhì)和抗氧化活性

趙秀芳，姚海燕，袁江蘭，康旭

（湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北 武漢 430068）

豆渣是豆?jié){、豆腐等豆制品加工的副產(chǎn)物。我國每年可產(chǎn)生2 000多萬噸濕豆渣[1]，但新鮮豆渣水分含量高達(dá)80%[2]，不僅口感粗糙，而且極易酸化腐敗，因此，大部分豆渣經(jīng)過直接干燥后用作動(dòng)物飼料，也有一部分被直接丟棄[3]。分析表明，豆渣營養(yǎng)豐富，每100 g干豆渣含蛋白質(zhì)約19.32 g、碳水化合物51.80 g、脂肪12.40 g，此外還含有大豆異黃酮、無機(jī)鹽、單糖、低聚糖和B族維生素等[4]。豆渣中還含有多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，如凝集素和胰蛋白酶抑制劑等，直接食用可能引起腹瀉或胃腸紊亂，利用微生物發(fā)酵處理可以有效去除這些抗?fàn)I養(yǎng)因子，因此微生物發(fā)酵可能會(huì)大幅提升豆渣品質(zhì)，豐富豆渣的用途。

近年來有關(guān)豆渣發(fā)酵的研究較多，例如利用馬氏克魯維酵母發(fā)酵豆渣，豆渣粗脂肪、可溶性膳食纖維和多糖分別增加24.5%、15.8%和26.2%，植酸和胰蛋白酶抑制劑活性分別降低61.7%和92.7%，豆腥味明顯減少[5]。利用黑曲霉對(duì)豆渣進(jìn)行發(fā)酵，氨基酸態(tài)氮含量為未發(fā)酵豆渣的3.23倍，纖維素酶活提升了2.02倍，半纖維素酶活提高了10.64倍[6]等。粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）屬真菌門、脈紋孢菌屬，是粗壯串珠霉的有性世代，是一種能夠產(chǎn)生纖維素酶的可食用真菌[7]，有氣生菌絲，能產(chǎn)生黃色或橙紅色孢子。該菌能夠分解豆渣中部分粗纖維和大分子蛋白質(zhì)，產(chǎn)生小分子單糖、雙糖、低聚糖、多肽、氨基酸等生理活性物質(zhì)，使豆渣口感變細(xì)膩，提高豆渣的營養(yǎng)價(jià)值和綜合加工特性。釀酒酵母具有較好的發(fā)酵特性，其利用谷物發(fā)酵基質(zhì)產(chǎn)生酶系，對(duì)谷物的營養(yǎng)和功能品質(zhì)產(chǎn)生較大影響[8]；植物乳桿菌是工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用較多的發(fā)酵菌，具有優(yōu)良益生保健功能和產(chǎn)細(xì)菌素的特性[9]，但在豆渣發(fā)酵中應(yīng)用較少。本研究以粗糙脈孢菌為基礎(chǔ)發(fā)酵菌種，考察其與釀酒酵母、植物乳桿菌耦合對(duì)豆渣品質(zhì)和抗氧化功能的影響，為豆渣類功能食品或食品、飼料、醫(yī)藥原輔料的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種及主要試劑

新鮮豆渣：武漢遠(yuǎn)大豆制品有限公司；粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）：廣州納豆生物科技有限公司；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，菌種編號(hào) CICC 1477）：湖北安琪酵母有限公司；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，菌種編號(hào)CICC 24809）：北京川秀國際貿(mào)易有限公司；干酪素、羧甲基纖維素鈉、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH）、α-淀粉酶（100 000 U/g）：上海源葉生物科技有限公司；福林酚、乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na）、鄰苯三酚：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；3，5-二硝基水楊酸、5-磺基水楊酸：上海麥克林生化科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)（G-250）：西安飛揚(yáng)生物科技有限公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）：德國BioFroxx公司；胰蛋白酶（豬胰）（250 U/mg）：Aladdin試劑（上海）有限公司；18種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品：美國Sigma公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DHWS-250型低溫恒溫恒濕培養(yǎng)箱：合肥達(dá)斯卡特生物科技有限公司；UPI-11-5T型優(yōu)普系列超純水器：四川優(yōu)普超純科技有限公司；Bio-Rad Mini-PRO TEAN Tetra Cell蛋白電泳裝置：美國伯樂公司；K9860全自動(dòng)凱氏定氮儀：山東海能科學(xué)儀器有限公司；L-8900型全自動(dòng)氨基酸分析儀：日本Hitachi公司；UV-2600型紫外可見分光光度計(jì)：島津儀器（蘇州）有限公司；CR-13型柯尼卡美能達(dá)色譜儀：日本大阪市美能達(dá)有限公司；Agilent 7890A/5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Agilent公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵用孢子粉制備

將粗糙脈孢菌接種至馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）中，在 30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，收集孢子粉置于4℃冰箱備用。

1.3.2 發(fā)酵豆渣樣品制備

粗糙脈孢菌發(fā)酵豆渣：稱取含水量約為85%豆渣，100℃常壓蒸20 min，冷卻后置于超凈臺(tái)上，紫外滅菌15 min，按照豆渣質(zhì)量0.01%接入粗糙脈孢菌孢子粉，攪拌均勻后置于30℃、相對(duì)濕度85%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中發(fā)酵，記為NF。以未發(fā)酵豆渣作為對(duì)照。

接入0.01%粗糙脈孢菌和0.01%釀酒酵母粉，記為NSF，其余制備條件相同。

接入0.01%粗糙脈孢菌孢子粉和0.01%植物乳桿菌菌粉，記為NLF，其余制備條件相同。

接入0.01%粗糙脈孢菌孢子粉、0.01%釀酒酵母粉和0.01%植物乳桿菌菌粉，記為NSLF，其余制備條件相同。

1.3.3 豆渣固態(tài)發(fā)酵前后纖維素酶活的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[10]的方法測(cè)定纖維素酶活。分別取10 g新鮮發(fā)酵 0、24、36、48、60 h 的豆渣樣品于燒杯或試劑瓶中，充分搗碎，再加入200 mL預(yù)冷的pH5.0乙酸-乙酸鈉緩沖液（含0.15 mol/L NaCl），冰浴攪拌提取1 h，低溫過濾，取1 mL濾液用相應(yīng)的緩沖溶液適度稀釋后測(cè)定纖維素酶活。纖維素酶活單位定義：在（40±1）℃、催化反應(yīng)的pH值條件下，每分鐘從5 mg/mL羧甲基纖維素鈉溶液中釋放1 μg還原糖所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位，結(jié)果以U/g表示。計(jì)算公式如下。

式中：c為試樣反應(yīng)溶液中葡萄糖的上機(jī)濃度，mg/mL；c0為試樣空白反應(yīng)溶液中葡萄糖的上機(jī)濃度，mg/mL；n為試樣溶液定容后的稀釋倍數(shù)；m為試樣質(zhì)量，g；t為酶反應(yīng)時(shí)間，min；100 為試樣定容體積，mL；180.2為葡萄糖摩爾質(zhì)量，g/mol；1 000為轉(zhuǎn)化因子。

1.3.4 膳食纖維含量測(cè)定

參考GB 5009.88—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中膳食纖維的測(cè)定》和文獻(xiàn)[11]中的方法測(cè)定發(fā)酵和未發(fā)酵豆渣不溶性膳食纖維（insoluble dietary fiber，IDF）和可溶性膳食纖維（soluble dietary fiber，SDF）含量。

1.3.5 豆渣理化指標(biāo)測(cè)定

將未發(fā)酵豆渣（unfermented okara，UF）即發(fā)酵0 h樣品和發(fā)酵 24、36、48、60 h 的 NF、NSF、NLF、NSLF 樣品凍干磨粉并過60目篩。不同發(fā)酵時(shí)間還原糖的測(cè)定采用 3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）法[12]；發(fā)酵60 h樣品水解氨基酸和游離氨基酸含量參考文獻(xiàn)[13]中的方法測(cè)定。

1.3.6 聚丙烯酰氨凝膠電泳（polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE）

參考文獻(xiàn)[14]中的方法，分別稱取一定質(zhì)量發(fā)酵60h的豆渣蛋白至10mL離心管，未發(fā)酵豆渣蛋白為對(duì)照，溶于0.01 mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液中，保證蛋白濃度為10 mg/mL，將離心管在滾軸混勻儀上以50 r/min混樣1 h，使蛋白充分溶解，稀釋5倍，8 000 r/min離心15 min，取上清液備用。將上清液和含有巰基乙醇的上樣緩沖液按照體積比1∶1混合，煮沸5 min，冷卻后10 000 r/min離心2 min，取10 μL上樣，分離膠和濃縮膠濃度分別為12%和4%。

1.3.7 總酸測(cè)定

參考GB 12456—2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中總酸的測(cè)定》中的方法對(duì)新鮮發(fā)酵60 h豆渣樣品進(jìn)行總酸測(cè)定。

1.3.8 色度測(cè)定

不同發(fā)酵時(shí)間樣品分別凍干磨粉并過60目篩，參考文獻(xiàn)[15]中的方法測(cè)定 L*、a*、b*。

1.3.9 揮發(fā)性成分測(cè)定

采用頂空固相微萃?。╤eadspace solid phase microextraction，HS-SPME）與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[16]。取 7.5 g（精確至0.001 g）新鮮豆渣發(fā)酵60 h產(chǎn)物，置于40 mL頂空樣品瓶中，在80℃條件下平衡30 min，使用50/30 μm 二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）纖維萃取頭進(jìn)行固相微萃取，頂空吸附30 min，解吸5 min，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

GC條件：CP-SIL 8型毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm），升溫程序：40℃保持 2 min，先以 5℃/min升溫到120℃保持2 min，再以7℃/min的速率升到220℃保持5 min；載氣（He）流速1.0 mL/min，進(jìn)樣口溫度250℃，不分流。

MS條件：采集方式為選擇離子掃描，溶劑延遲7 min，質(zhì)量范圍35 amu～395 amu，離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃，接口溫度250℃，電離方式電子電離（electron ionization，EI），離子源能量 70 eV。

對(duì)匹配度大于70（最大值100）的揮發(fā)性成分根據(jù)NIST 08數(shù)據(jù)庫對(duì)化合物進(jìn)行定性，面積歸一化法計(jì)算相對(duì)含量。

1.3.10 抗氧化活性測(cè)定

取不同發(fā)酵時(shí)間（36、48、60h）的豆渣干粉各2g，加入30 mL去離子水，28℃水浴攪拌1 h，然后8 000 r/min離心15 min獲得上清液，用去離子水稀釋20倍后待測(cè)。DPPH·清除率參考文獻(xiàn)[17]中的方法并稍作修改；羥基自由基（·OH）清除率參考文獻(xiàn)[18]中的方法測(cè)定；超氧陰離子自由基（·O2－）清除率參考文獻(xiàn)[19]中的方法并稍作修改。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 2017作圖，用SPSS 23.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用單因素方差分析中的Duncan多重比較法進(jìn)行顯著性分析（p＜0.05表示差異顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆渣發(fā)酵過程纖維素酶活變化規(guī)律

豆渣發(fā)酵過程中的纖維素酶活變化見圖1。

圖1 豆渣發(fā)酵過程中的纖維素酶活Fig.1 Cellulase activity during okara fermentation

由圖1可知，4組發(fā)酵豆渣樣品的纖維素酶活均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，其中NF和NSF纖維素酶活均在發(fā)酵48 h時(shí)達(dá)到峰值，分別為1 097.98 U/g和1 234.18 U/g。而NLF和NSLF均在36 h達(dá)到峰值，分別為1 126.70 U/g和1 056.94 U/g，隨后纖維素酶活逐漸降低。纖維素酶活能夠影響發(fā)酵產(chǎn)物中膳食纖維的含量，纖維素酶可以將基質(zhì)中不溶性膳食纖維分解成單糖，從而導(dǎo)致不溶性膳食纖維含量降低，可溶性膳食纖維含量增加。纖維素酶主要由粗糙脈孢菌產(chǎn)生[20]，結(jié)果表明，釀酒酵母和植物乳桿菌參與發(fā)酵明顯加快了粗糙脈孢菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶進(jìn)程，發(fā)酵后期可能因?yàn)閜H值明顯降低，微生物的生長(zhǎng)進(jìn)入衰亡期，逐漸停止產(chǎn)酶，因此纖維素酶活下降。

2.2 發(fā)酵對(duì)豆渣膳食纖維和還原糖含量的影響

不同發(fā)酵豆渣中膳食纖維和還原糖含量差異見圖2。

圖2 不同發(fā)酵豆渣中膳食纖維和還原糖含量差異Fig.2 Differences of dietary fiber and reducing sugar contents in different fermented okara

由圖2A可知，未發(fā)酵豆渣（UF）中IDF含量最高，占豆渣干重69.85%，SDF含量最低，為4.05%。菌種耦合發(fā)酵 60 h后，NF、NSF、NLF、NSLF 樣品中 IDF 與未發(fā)酵豆渣相比均顯著降低（p＜0.05），分別為55.04%、43.27%、52.11%、41.09%，SDF含量明顯提高。NSLF組IDF含量降低明顯，推測(cè)釀酒酵母和植物乳桿菌能夠協(xié)同促進(jìn)粗糙脈孢菌產(chǎn)生更多纖維素酶，導(dǎo)致IDF被分解得更多，這與2.1中纖維素酶活變化規(guī)律基本一致。

由圖2B可知，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，還原糖含量逐漸增加，而NSF組在發(fā)酵后期還原糖含量有明顯下降趨勢(shì)。在發(fā)酵36 h～48 h釀酒酵母參與的發(fā)酵有利于還原糖的積累，含量最高分別達(dá)到了（59.50±2.45）mg/g，繼續(xù)發(fā)酵至終點(diǎn)（60 h）時(shí)，還原糖降低為53.40 mg/g左右。粗糙脈孢菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的大量纖維素酶作用于發(fā)酵基質(zhì)中的IDF，分解產(chǎn)生低分子的還原糖，因此還原糖含量增加，IDF含量降低，SDF含量增加。NLF和NSLF組還原糖積累量較低，這是由于植物乳桿菌消耗還原糖用于自身生長(zhǎng)繁殖的速率高于釀酒酵母[21]。

2.3 不同發(fā)酵豆渣氨基酸差異分析

發(fā)酵豆渣水解氨基酸組成和含量變化見表1。發(fā)酵豆渣游離氨基酸組成和含量見表2。

表1 發(fā)酵豆渣水解氨基酸組成和含量變化Table 1 Composition and content of hydrolyzed amino acids of fermented okara

表2 發(fā)酵豆渣游離氨基酸組成和含量Table 2 Composition and content of free amino acids of fermented okara

由表1、表2可知，發(fā)酵后4組豆渣的水解氨基酸以及游離氨基酸均顯著增加（p＜0.05）。NF、NSF、NLF、NSLF水解氨基酸含量分別為UF的1.87、1.99、1.88、1.83倍，必需氨基酸含量分別為128.37、135.22、129.67、121.87 mg/g，較 UF（46.33 mg/g）分別提高了 63.91%、65.74%、64.27%、61.98%，經(jīng)過發(fā)酵后豆渣中必需氨基酸含量均能達(dá)到水解氨基酸的20%以上，豆渣營養(yǎng)品質(zhì)明顯提高。

由表2可知，UF游離氨基酸總量為（2.24±0.07）mg/g，而4組發(fā)酵豆渣的游離氨基酸明顯增加，分別為 UF 的 13.16、10.93、16.97、14.69 倍，其中以NLF組增量最大。食品中呈鮮味氨基酸主要是谷氨酸和天冬氨酸，甜味氨基酸主要來源于丙氨酸和甘氨酸等。NLF組谷氨酸含量最高為2.07 mg/g，是UF的12.94倍；NLF組丙氨酸含量最高約為1.10 mg/g，是UF的6.88倍。這一結(jié)果表明植物乳桿菌參與的發(fā)酵對(duì)豆渣的滋味和營養(yǎng)提升作用更加明顯。發(fā)酵促進(jìn)蛋白質(zhì)的降解，明顯促進(jìn)豆渣內(nèi)呈結(jié)合狀態(tài)活性物質(zhì)的溶出與釋放。水解氨基酸和游離氨基酸含量的變化與Vong等[22]的研究結(jié)果基本一致。

2.4 SDS-PAGE分析

發(fā)酵60h的豆渣蛋白SDS-PAGE電泳如圖3所示。

圖3 發(fā)酵豆渣蛋白的SDS-PAGE電泳Fig.3 SDS-PAGE of fermented okara protein

由圖3 UF條帶可以看出，豆渣中主要有7S和11S兩種抗原蛋白[23]。7S蛋白包括α、α'、β三種亞基，分子量從上到下分別為82 kDa的α'亞基、71 kDa的α亞基、55 kDa的β亞基，11S蛋白包括38 kDa和30 kDa的酸性亞基、22 kDa的堿性亞基。與未發(fā)酵豆渣相比，4種發(fā)酵豆渣樣品7S蛋白均明顯發(fā)生降解，幾乎看不到條帶，11S蛋白38 kDa條帶酸性亞基降解較充分，11S蛋白亞基的降解程度明顯低于7S蛋白亞基。發(fā)酵后豆渣中抗原蛋白消失或含量減少，豆渣的致敏性明顯降低。各發(fā)酵樣品在10 kDa～15 kDa出現(xiàn)顏色較深的新條帶，這可能是由于微生物將大分子蛋白質(zhì)逐步降解為低分子蛋白質(zhì)。與Kunitz型胰蛋白酶抑制劑（KTI）條帶比較可知，發(fā)酵豆渣中胰蛋白酶抑制劑基本可以忽略。

2.5 發(fā)酵豆渣總酸含量

發(fā)酵豆渣總酸含量見圖4。

圖4 發(fā)酵豆渣總酸含量Fig.4 Total acid content of fermented okara

由圖4可知，發(fā)酵60 h后豆渣總酸含量相比未發(fā)酵豆渣均顯著增加（p＜0.05），分別可達(dá) 0.541、0.699、0.593、0.734 g/kg，釀酒酵母能利用豆渣基質(zhì)中營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生二氧化碳和乙醇，促進(jìn)系統(tǒng)產(chǎn)生更多酶，因此有利于產(chǎn)生更多的有機(jī)酸、脂肪酸、氨基酸等酸性物質(zhì)[24]，使總酸含量顯著增加（p＜0.05）。植物乳桿菌經(jīng)過發(fā)酵主要產(chǎn)生乙酸、乳酸等有機(jī)酸，比較NLF和NF總酸含量發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌的引入對(duì)總酸含量的增加無明顯促進(jìn)作用。

2.6 發(fā)酵豆渣感官質(zhì)量差異分析

2.6.1 色度分析

豆渣發(fā)酵期間色度變化見表3～表5。

表3 豆渣發(fā)酵期間色度L*的變化Table 3 Change of chroma L*in okara during fermentation

表4 豆渣發(fā)酵期間色度a*的變化Table 4 Change of chroma a*in okara during fermentation

表5 豆渣發(fā)酵期間色度b*的變化Table 5 Change of chroma b*in okara during fermentation

由表3～表5可知，4組 L*均在68.27～74.26，均有較好的明亮度，這與粗糙脈孢菌的基本發(fā)酵特征有關(guān)。在本試驗(yàn)條件下，經(jīng)過觀察發(fā)現(xiàn)，粗糙脈孢菌在發(fā)酵前期產(chǎn)生肉眼可見的白色菌絲，發(fā)酵36 h時(shí)開始產(chǎn)生大量鮮亮的橙黃色孢子，從而導(dǎo)致發(fā)酵豆渣的L*均有明顯增加，即明度增加。NF、NSF、NLF組L*隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，NSLF組的L*在整個(gè)發(fā)酵過程均低于其它3組（除60 h）。

耦合發(fā)酵60 h的樣品紅色度（a*）明顯高于粗糙脈孢菌單菌種發(fā)酵樣品，特別是釀酒酵母參與耦合發(fā)酵尤為明顯，以3個(gè)菌種耦合發(fā)酵的樣品紅色度增加最快，最終紅色度最高。發(fā)酵36 h時(shí)NSLF組較另外3組呈現(xiàn)出顯著差異（p＜0.05），紅色度最高。4組樣品在發(fā)酵36 h時(shí)均能產(chǎn)生大量橙黃色孢子，并且紅色度隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，這與粗糙脈孢菌孢子富含類胡蘿卜素有關(guān)。4組樣品的黃色度（b*）表現(xiàn)出同紅色度（a*）相似的變化趨勢(shì)。

2.6.2 揮發(fā)性香氣成分

發(fā)酵60 h豆渣揮發(fā)性香氣成分分析見表6，不同種類揮發(fā)性成分相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)見圖5。

表6 發(fā)酵60 h豆渣揮發(fā)性香氣成分分析Table 6 Analysis of volatile aroma components of okara fermented for 60 h

圖5 不同種類揮發(fā)性成分相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.5 Relative mass fractions of different volatile components

由表6可知，發(fā)酵后揮發(fā)性香氣總量明顯增加，NSF組最高為72.57%，是UF組的1.59倍。NF組（Z）-α-紅沒藥烯含量最高為44.95%，是未發(fā)酵豆渣的30倍，該物質(zhì)具有柑橘香、花香等風(fēng)味。庚醛具有草本氣息、正辛醛具有玫瑰或橙皮香氣，這2種成分均僅在NF發(fā)酵組產(chǎn)生。發(fā)酵后1-辛烯-3-醇的含量明顯提高，NSF樣品最高，為14.72%，是UF的3倍，該物質(zhì)具有令人愉悅的玫瑰和干草香氣。苯乙醇在未發(fā)酵樣品中未檢出，經(jīng)過發(fā)酵后NSLF組含量最高為1.52%，其具有清甜的玫瑰花香味，酵母細(xì)胞能夠通過莽草酸途徑形成的苯丙酮酸脫羧脫氫形成苯乙醇[25]。苯甲醛、苯乙醇、辛酸乙酯等成分含量的增加也對(duì)發(fā)酵后豆渣香氣有貢獻(xiàn)。辛酸乙酯具有水果香味，在有釀酒酵母的發(fā)酵組出現(xiàn)，該成分在NSF組含量最高，為0.44%，酯類成分是由于釀酒酵母的作用下醇與酸的酯化反應(yīng)產(chǎn)生的，由于酯類較低的氣味閾值[26]，其在較低含量時(shí)也能被感知。

由圖5可知，發(fā)酵豆渣中揮發(fā)性成分種類主要有醛類、醇類、酯類、烷烴類、芳香烴等。經(jīng)過發(fā)酵后，醇類、烯烴類和芳香烴類揮發(fā)性成分相對(duì)含量明顯增加，醇類最高為NSF組21.96%，是UF的4倍，烯烴類最高為NF組50.52%，是UF的14倍。醛類、酯類、烷烴類和雜環(huán)類揮發(fā)性成分相對(duì)含量有所降低，推測(cè)酯類含量的減少可能是因?yàn)榫N利用酯類等營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行自身代謝將其轉(zhuǎn)化成醇類物質(zhì)等。豆渣在菌種作用下經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間發(fā)酵發(fā)生一系列生化反應(yīng)，如羥醛縮合、蛋白質(zhì)降解、醇酸縮合等[27]，產(chǎn)生出多種具有特殊香味的揮發(fā)性物質(zhì)，這些化合物互相融合，使發(fā)酵產(chǎn)物具有獨(dú)特的風(fēng)味。因此，粗糙脈孢菌協(xié)同釀酒酵母和植物乳桿菌耦合發(fā)酵對(duì)豆渣風(fēng)味具有明顯提高作用。

2.7 菌種耦合發(fā)酵對(duì)豆渣抗氧化活性的影響

豆渣發(fā)酵期間抗氧化活性的變化見圖6。

圖6 豆渣發(fā)酵期間抗氧化活性的變化Fig.6 Changes in antioxidant activity during soybean dregs fermentation

由圖6可知，發(fā)酵后豆渣DPPH·清除率均能達(dá)到95%左右，而未發(fā)酵豆渣DPPH·清除率測(cè)定值僅為13%左右，表明發(fā)酵前豆渣沒有明顯的DPPH·清除能力，而各發(fā)酵樣品均具有很強(qiáng)的DPPH·清除能力，發(fā)酵后豆渣中還原糖含量明顯增加，還原糖可能提供電子使自由基形成穩(wěn)定的物質(zhì)，有效阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[28]，豆渣抗氧化能力明顯提高?！2－清除率也比未發(fā)酵豆渣有顯著提高（p＜0.05）。NF、NSF、NLF 三組的·O2－清除率均較高，并在發(fā)酵36 h達(dá)到峰值，分別為74.44%、86.03%及83.79%，之后隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)而降低。從·OH清除率來看，在發(fā)酵 48 h時(shí)，NF、NSF、NSLF組·OH清除率達(dá)到最高值，發(fā)酵后期·OH清除率下降，可能是由于還原類物質(zhì)在后期被微生物用于自身生長(zhǎng)消耗。發(fā)酵豆渣過程中可能產(chǎn)生了類胡蘿卜素和抗氧化活性多肽等物質(zhì)[29]，從而提高了豆渣的抗氧化能力，但需要進(jìn)一步試驗(yàn)確認(rèn)。

3 結(jié)論

本文以粗糙脈孢菌為基本發(fā)酵菌種，耦合釀酒酵母和植物乳桿菌發(fā)酵鮮豆渣，探究豆渣的營養(yǎng)品質(zhì)和抗氧化活性的變化，以獲得營養(yǎng)豐富、感官品質(zhì)良好的功能性食品、飼料或醫(yī)藥輔料。豆渣發(fā)酵后，還原糖、總氨基酸、游離氨基酸、可溶性膳食纖維等功能活性物質(zhì)含量明顯增加，豆渣的營養(yǎng)組成更有利于人體健康。NSLF組IDF被微生物明顯分解，IDF含量降低28.76%，SDF含量提高5.03%。植物乳桿菌參與的發(fā)酵對(duì)豆渣的滋味提升效果最好，粗糙脈孢菌協(xié)同釀酒酵母和植物乳桿菌耦合發(fā)酵能夠有效增加揮發(fā)性成分的種類并提高含量，發(fā)酵產(chǎn)物風(fēng)味更加優(yōu)良。發(fā)酵后豆渣的DPPH·清除能力、·O2-清除能力和·OH清除能力均明顯增加，抗氧化活性明顯增強(qiáng)。綜合分析認(rèn)為，粗糙脈孢菌、釀酒酵母和植物乳桿菌耦合發(fā)酵豆渣能夠明顯改善豆渣的營養(yǎng)品質(zhì)和抗氧化活性，本研究中豆渣經(jīng)過發(fā)酵后營養(yǎng)成分明顯改善、豆渣利用價(jià)值有效提高，為開發(fā)以發(fā)酵豆渣為原輔料的功能性食品提供參考。