微生物亞硝化抑制劑對新型培根品質(zhì)的影響

李佳怡，吳卓倩，曲暢，孫旭陽，索朗次仁，劉璐璐，鄭引瑜，楊華，2*

（1.天津農(nóng)學院動物科學與動物醫(yī)學學院，天津 300384；2.和田職業(yè)技術學院，新疆 和田 848000）

培根作為歐洲三大主要西式肉制品之一，備受消費者喜愛，但其生產(chǎn)過程中需要添加亞硝酸鹽達到抑菌、發(fā)色、抗氧化以及提高產(chǎn)品風味的效果，然而亞硝酸鹽又會與肉中蛋白質(zhì)降解的二級胺類物質(zhì)發(fā)生反應而形成危害人體健康的N-亞硝胺[1]。目前，國內(nèi)外控制N-亞硝胺在肉制品中的生成主要從原料肉的選擇[2]、加工方式[3]以及外源抑制物[4]等方面展開，實際生產(chǎn)中通常添加亞硝化抑制劑（抗壞血酸鈉，又稱維生素C鈉、VC鈉鹽）控制N-亞硝胺，其價格適宜、制作成本低，但VC鈉鹽溶于水，仍可以在腌肉產(chǎn)品中檢測到亞硝酸鹽、生物胺及N-亞硝胺，說明VC鈉鹽并不是最理想的亞硝化抑制劑。茶多酚作為人工半天然材料是合成有機食品原料的最重要天然抗氧化劑，常用于生物合成有機油脂、肉制品香精等食品中，在加工肉制品中添加0.1%茶多酚可以減緩其氧化速度，從而達到延長產(chǎn)品保質(zhì)期和保護色值的雙重效果。迷迭香作為一種安全、高效、耐熱且有極強抗氧化能力的天然抗氧化劑，對純油脂食物的抗氧化作用強于其他非純油脂食物，它有延長保質(zhì)期、提高產(chǎn)品風味的效果。維生素E屬脂溶性維生素，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一無毒的油脂類食品的天然抗氧化劑，對于提高肉制品安全性效果最佳。研究發(fā)現(xiàn)，多種抗氧化劑復配后抑制N-亞硝胺生產(chǎn)的效果優(yōu)于單獨添加抗氧化劑的效果。因此，開發(fā)有效的亞硝化抑制劑，探究不同種類的抗氧化劑對肉制品中N-亞硝胺的影響具有重要的現(xiàn)實意義。

在商業(yè)復合菌PRO-MIX5（木糖葡萄球菌＋清酒乳桿菌＋類植物乳桿菌）的菌體碎片所制得的微生物亞硝化抑制劑（microbial nitrification inhibitor，MNI）應用到紅腸[5]和培根[6]的研究中發(fā)現(xiàn)：0.05%MNI可使紅腸中N-二甲基亞硝胺（N-nitrosodimethylamine，NDMA）含量由 2.61 μg/kg 降低至 1.23 μg/kg，9 種 N-亞硝胺總量由 32.16 μg/kg 降低至 18.96 μg/kg，對亞硝酸鹽降解率達18.90%；添加0.05%MNI可以很好地抑制西式培根產(chǎn)品中NDMA（抑制率為59.46%）和N-亞硝基哌啶（N-nitrosopiperidine，NPIP）（抑制率為 68.08%）的產(chǎn)生。

綜上所述，MNI及天然抗氧化劑均可在一定程度上降低N-亞硝胺的產(chǎn)生，本研究以實際生產(chǎn)中使用的VC鈉鹽作為對照組，將抑制N-亞硝胺效果較好的茶多酚、迷迭香、維生素E以及自主研發(fā)的微生物亞硝化抑制劑進行比較，探究這4種物質(zhì)在培根中的降硝效果，以期尋找一種較為合理且有效的降硝手段，并為后續(xù)尋找與MNI復配效果更佳的天然抗氧化劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

迷迭香、維生素 E（vitamin E，VE）、去皮五花肉、精碎肉、味精、白酒等輔料：市售；大豆分離蛋白粉、茶多酚、煙酰胺、抗壞血酸鈉（食品級）：蘇州福萊生物科技有限公司；復合磷酸鹽（三聚磷酸鈉24%，焦磷酸鈉21%，六偏磷酸鈉14%）：徐州添安食品添加劑有限公司；卡拉膠粉：河南雪川食品配料有限公司；8種生物胺（色胺、腐胺、苯乙胺、酪胺、精胺、組胺、尸胺及亞精胺）標準品（純度≥99%）、9種N-亞硝胺標品[NDMA、N-二乙基亞硝胺（N-nitrosodiethylamine，NDEA）、N-甲基乙基亞硝胺（N-nitrosomethylethylamine，NMEA）、N-二丁基亞硝胺（N-nitrosodibutylamide，NDBA）、N-二丙基亞硝胺（N-nitrosodipropylamine，NDPA）、N-亞硝基哌啶（N-nitrosopiperidine，NPIP）、N-亞硝基吡咯烷（N-nitrosopyrrolidine，NPYR）、N-亞硝基嗎啉 （N-nitroso morpholine，NMOR）、N-亞硝基二苯胺（N-nitrosodiphenylamine，NDpheA）]：美國 Sigma 公司；9 種 N-亞硝胺混合標準品（純度≥99%）、亞硝酸鈉標準品（純度≥99%）：美國Supelco公司；二氯甲烷（色譜純）、氯化鈉、無水硫酸鈉（均為分析純）：廣東翁江化學試劑有限公司；丙酮、高氯酸、丹磺酰氯（純度≥98%）：國藥集團化學試劑有限公司；MRS培養(yǎng)基：西亞化學科技（山東）有限公司；商業(yè)復合菌PRO-MIX5（木糖葡萄球菌＋清酒乳桿菌＋類植物乳桿菌）：意大利薩科公司；0.22 μm有機濾膜：海寧市永恒膜過濾設備有限公司。

1.2 儀器與設備

LC2-0A高效液相色譜儀：日本島津公司；JC-7890氣相色譜分析儀：聚環(huán)創(chuàng)保有限公司；20/20R臺式高速離心機：美國Microfuge公司；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鄭州科達機械儀器有限公司；690004 pH酸度計：銳能工具有限公司；7230G可見分光光度計：濟寧市裕怎工業(yè)科技有限公司；MJX-80霉菌培養(yǎng)箱：浙江蘇珀儀器設備有限公司；S20-LA599碎肉機：九陽廚房電器有限公司；BVB-30F商用真空攪拌機：廣州柯喜卡廚房設備有限公司；XZ-YXL-50A全自動煙熏爐：旭眾食品機械有限公司；BY-70不銹鋼壓肉模具：百耐爾廚具有限公司；BX-02速凍箱：江蘇江凱設備有限公司；AH-20SG冷凍式干燥機：廣州艾瑪壓縮機有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 新型培根加工的操作要點

1）原料準備：質(zhì)量比為1∶1的去皮五花肉與精碎肉。

2）鹽水注射：注射5 kg鹽水（注射率20%），注射2遍，剩余鹽水可在真空滾揉開始時加入（鹽水添加量≤4%）。

3）真空滾揉：正轉(zhuǎn) 20 min，反轉(zhuǎn) 20 min，中間停20 min，滾揉總時間為2 h，全過程轉(zhuǎn)速8 r/min，溫度6℃～8℃，真空度達到90%以上。

4）壓膜：在模具中放置聚乙烯（polyethylene，PE）保護膜將修好的五花肉平鋪在底部，保持肉干凈、伸展，并將精碎肉放置上層。完成后，真空處理約30 min。

5）預煮：多功能煙熏爐于（78±2）℃蒸煮 90 min，噴淋自來水冷卻20 min。

6）冷卻、脫膜、整形：中心溫度冷卻至20℃以下，輕拿輕放脫模，修剪不規(guī)則邊角。

7）煙熏、冷卻：置于多功能煙熏爐內(nèi)，65℃干燥1 h，熱熏法（55±2）℃至產(chǎn)品表面呈金黃色（約6 h）。

8）冷凍、切片、包裝：冷凍至中心溫度為-4℃～-2℃后進行切片。切成質(zhì)量勻稱的片（20 g～24 g），真空包裝。

9）裝箱、入庫：標注產(chǎn)品名稱、時間等信息，裝箱入庫。

1.3.2 MNI的制備方法

MNI的制備參照李秀明等[5]的方法，在其方法基礎上，將所得沉淀使用冷凍干燥機進行冷凍干燥處理，于-80℃保存。

1.3.3 試驗設計

試驗分為5組，分別為對照（control check，CK）組、微生物亞硝化抑制劑（microbial nitrification inhibit，MNI）組、茶多酚（tea polyphenols，TP）組、迷迭香（rose mary，RM）組、維生素 E（vitamin E，VE）組。腌制液添加量為20 mL/100 g肉，其中CK組腌制時使用的是基礎腌制液，其余組別分別添加0.05%MNI、0.25%TP、0.06%RM、0.06%VE。分別按照1.3.1所描述的方法加工出5組培根產(chǎn)品，測定5組培根的pH值、感官評分、亞硝酸鹽殘留量、硫代巴比妥酸反應物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值、生物胺以及 N-亞硝胺含量等指標，以評價4種亞硝化抑制劑對培根品質(zhì)的影響。

1.3.4 指標測定

1.3.4.1 感官評定

選擇10位專業(yè)感官分析評定檢測人員，對添加MNI和抗氧化劑的新型培根成品就氣味、滋味、組織狀態(tài)和整體可接受度方面進行評分，評分標準參照表1。

表1 新型培根的感官評定標準Table 1 The new bacon sensory evaluation criteria

1.3.4.2 pH值的測定

根據(jù)GB 5009.237—2016《食品安全國家標準食品pH值的測定》中的方法進行測定。

1.3.4.3 TBARS值的測定

參考Faustman等[7]的方法進行測定。

1.3.4.4 亞硝酸鹽含量的測定

根據(jù)GB 5009.33—2016《食品安全國家標準食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中的方法進行測定。

1.3.4.5 生物胺含量的測定

根據(jù)GB 5009.208—2016《食品安全國家標準食品中生物胺的測定》中的方法進行測定。

1.3.4.6 N-亞硝胺含量測定

根據(jù)GB 5009.26—2016《食品安全國家標準食品中N-亞硝胺類化合物的測定》中的方法進行測定。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

試驗均重復3次，使用SPSS軟件自動分析計算平均值及標準差，采用Statistix 8.1軟件中的Tukey HSD程序?qū)?shù)據(jù)平均值進行顯著性分析（P＜0.05），采用SigmaPlot 10.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 MNI與抗氧化劑對培根感官品質(zhì)的影響

表2為MNI與抗氧化劑對培根感官評分的影響結(jié)果。

表2 MNI與抗氧化劑對培根感官品質(zhì)的影響Table 2 Effects of MNI and antioxidants on the sensory quality of bacon

由表2可知，5組的組織狀態(tài)差異不顯著（P＞0.05），由于MNI的添加使肉制品略酸，導致MNI的氣味顯著低于TP、RM、VE組（P＜0.05）。與CK組相比，MNI組的氣味提高了8.9%，滋味提高了16.9%，整體可接受度提高了12.1%；TP組氣味提高了12.1%，滋味提高了19.0%，整體可接受度提高了17.3%；RM組氣味提高了14.8%，滋味提高了14.3%，整體可接受度提高了10.9%；VE組氣味提高12.1%，滋味提高了14.9%，整體可接受度11.9%。由此可知，MNI與抗氧化劑均可提高培根的感官品質(zhì)，其中TP組效果最佳?？傮w的感官評價結(jié)果為 TP組＞RM組＞VE組＞MNI組＞CK組。

2.2 MNI與抗氧化劑對培根pH值的影響

MNI與抗氧化劑對培根pH值的影響如圖1所示。

圖1 MNI與抗氧化劑對培根pH值的影響Fig.1 Effects of MNI and natural antioxidants on pH bacon

由圖1可知，與CK組相比，MNI對培根pH值的影響不顯著（P＞0.05），由于 MNI本身為弱酸性（pH6），所以MNI對于pH值的直接影響系數(shù)與CK組相比，差異不顯著（P＞0.05）。但 TP 組、RM 組、VE組中培根的pH 值顯著升高（P＜0.05），且 TP、RM、VE三組之間差異不明顯。這可能是因為茶多酚含有60%～80%兒茶素類化合物，并且兒茶素類化合物具有酚羥基，會導致培根的pH值升高[8]。研究發(fā)現(xiàn)，迷迭香抗氧化的關鍵在于其能有效通過阻斷由類脂自身的自動協(xié)調(diào)氧化反應產(chǎn)生出的一系列氧化連鎖反應，清除氧自由基，猝滅單重態(tài)氧，整合金屬離子的氧化效應[9]，因此RM組可能在清除自由基的同時，減少了酸類物質(zhì)，從而導致pH值上升。

2.3 MNI與抗氧化劑對培根TBARS值的影響

肉制品具有較好的口感及較高的營養(yǎng)價值，由于肉制品中含有豐富的蛋白質(zhì)和脂肪，可以補充人體所需、減少脂肪氧化，從而提高風味。過度氧化會使肉制品產(chǎn)生酸敗等情況，嚴重還會涉及健康問題[10]。Sun等[11]經(jīng)研究還發(fā)現(xiàn)豬肉糜塊中NDEA的異常形成主要與蛋白、脂質(zhì)共同氧化過程有關，脂質(zhì)共同氧化反應能間接促進NDEA的異常形成且主要與脂肪蛋白共氧化呈正相關。TBARS值是通過測定脂肪在氧化分解時產(chǎn)生的次級反應產(chǎn)物丙二醛的含量，來客觀衡量脂肪被氧化破壞程度的肉品質(zhì)檢測指標，可以有效地檢測出肉中氧化程度。MNI與抗氧化劑對培根TBARS值的影響如圖2所示。

圖2 MNI與抗氧化劑對培根TBARS值的影響Fig.2 Effects of MNI and natural antioxidants on the TBARS value of recombinant bacon

由圖2可以看出，與CK組相比，TP組、RM組、VE組、MNI組的TBARS值分別降低了 40.0%、35.1%、32.5%、37.5%，并顯著低于 CK 組（P＜0.05）。表明添加抗氧化劑或MNI均可顯著降低新型培根中的TBARS值，有效減少培根中脂肪的氧化。另外，TP組顯著低于CK 組、RM 組、VE組（P＜0.05），并與 MNI組差異不顯著（P＞0.05）。有研究顯示，茶多酚中由于含有比較豐富的二酚類化合物，可以通過與電子螯鏈的選擇性合作而直接對抗氧化過渡性金屬離子，尤其是茶多酚對鐵離子和銅離子的結(jié)合反應最為敏感，使氧化自由基分子間不能結(jié)合，抑制氧化自由基結(jié)合反應，從而達到有效抑制人體脂質(zhì)過度氧化和形成的雙重目的[12]。此外，茶多酚還可以通過抑制人體內(nèi)多種主要致病原細菌病毒等的快速生長或增殖等，來有效降低人細胞脂肪質(zhì)素氧化降解過程中的氧化反應速率。因此，茶多酚TBARS值較低。閆利娟[13]研究發(fā)現(xiàn)，MNI可有效抑制腐敗菌的生長繁殖，并在一定程度上延遲培根脂肪氧化。所以在后續(xù)試驗中可以選擇將茶多酚與MNI進行復配研究。

2.4 MNI與抗氧化劑對培根亞硝酸鹽殘留量的影響

亞硝酸鹽作為食品防腐劑和食品抗氧化劑等添加在某些腌、臘肉類制品生產(chǎn)中，但亞硝酸鹽并沒有完全被消耗，腌肉制品中仍有大量的殘留。GB2760—2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》中規(guī)定腌肉醬制品亞硝酸鹽殘留量不可以超過30 mg/kg，人體攝入過量硝酸鹽往往會導致中毒死亡[14]。MNI與抗氧化劑對培根亞硝酸鹽殘留量的影響如圖3所示。

圖3 MNI與抗氧化劑對培根亞硝酸鹽殘留量的影響Fig.3 Effects of MNI and natural antioxidants on nitrite of bacon

由圖3可知，與CK組相比，VE組和MNI組的亞硝酸鹽殘留量均顯著降低（P＜0.05），其中VE組降低了7.8%，MNI組降低了8.1%，且兩組差異小。維生素E屬于乙酰氨基酚類化合物，由于其能夠同時使亞硝酸及亞硝酸鹽發(fā)生氧化分解，使活性氫基團直接分解，釋放部分活性碳氫，減少自由基的產(chǎn)生，從而完全地阻斷了氧化自由基所生成的氧化還原鏈式碳反應。因此，維生素E可以有效地阻止N-亞硝胺生成[8-9，15]。與CK組相比，迷迭香對消除亞硝酸鹽殘留量并沒有效果，可能是作為抗氧化劑的迷迭香濃度未能達到清除亞硝酸鹽的程度，從而使該試驗結(jié)果受到影響。李秀明等[5]發(fā)現(xiàn)在紅腸中添加一定濃度的微生物亞硝化抑制劑可以降低亞硝酸鹽含量，其效果與添加量成正比。由圖3可知，VE組和MNI組的亞硝酸鹽含量顯著降低，因此后續(xù)可以選擇將維生素E與MNI進行復配試驗。

2.5 MNI與抗氧化劑對培根中生物胺含量的影響

MNI與抗氧化劑對培根中生物胺含量的影響如表3、圖4所示。

表3 MNI與抗氧化劑對西式培根生物胺含量的影響Table 3 Effect of MNI and antioxidant on biogenic amine content of bacon

圖4 MNI與抗氧化劑對生物胺總量的影響Fig.4 Effects of MNI and antioxidants on total biogenic amines

由表3可知，試驗僅檢測到4種生物胺（組胺、尸胺、精胺及亞精胺）。MNI組精胺含量顯著低于其他各組（P＜0.05），這是其總量顯著低于其他組的原因。其中MNI組中毒性最強的組胺和精胺在5組中含量最低，分別為50.01 mg/kg和120.07 mg/kg。另外，MNI組中亞精胺含量（4.43 mg/kg）顯著高于其他組（P＜0.05），這可能是因為亞精胺是豬肉制品中生物胺的組成元素之一，其相對含量一般不受其他發(fā)酵劑濃度影響[8]。

精胺和亞精胺普遍存在于食品中，主要由腐胺轉(zhuǎn)化而來。尸胺是賴氨酸菌株在脫羧酶直接催化下進行脫羧酶代謝而自然形成的一種轉(zhuǎn)化反應產(chǎn)物，所以尸胺自然形成的量可能與正常腸桿菌形成的產(chǎn)物數(shù)量之間存在一定的顯著性和相關性[16]。另外也有研究表明，微生物的生物胺降解活性主要是由于產(chǎn)生了生物胺氧化酶，而產(chǎn)生的生物胺氧化酶種類與降解的生物胺種類相關[17]。所以推測本試驗可能是由于MNI及茶多酚均具有較強的抑菌性，抑制了腸桿菌等的生長使得MNI組、TP組的尸胺含量顯著低于CK組（P＜0.05）。相關研究表明，在生物胺中組胺對人類身體健康的危害極大，組胺含量過高可引起腸平滑肌的收縮，導致疾病發(fā)生[18]。與CK組相比，本試驗中各抑制劑均顯著降低了組胺的含量（P＜0.05）。Salda?e等[19]研究表明，當食品中生物胺總量超過1000mg/kg時，會對人體和健康結(jié)構(gòu)造成極大的毒性危害。各組培根中的生物胺平均含量均遠低于規(guī)定水平，不會對正常人體系統(tǒng)造成危害。

由圖4可知，MNI組的生物胺總量顯著低于其他4組（P＜0.05）。與 CK 組相比，MNI組、TP組、RM組、VE組的生物胺總量分別降低了18.0%、17.1%、16.6%、13.9%，綜上，MNI抑制生物胺的效果最佳。

2.6 MNI與抗氧化劑對培根中N-亞硝胺的影響

酸性條件下，腌肉制品中大量游離亞硝酸鹽與蛋白質(zhì)被降解產(chǎn)物生成一種含有少量N2O-的化合物，被稱為N-亞硝胺。N-亞硝胺具有致癌性，極大降低了腌肉制品的安全性[15]，根據(jù)GB 2762—2017《食品安全國家標準食品中污染物限量》可進一步得知，腌肉制品中NDMA含量應在3 μg/kg以下。MNI與抗氧化劑對培根中N-亞硝胺的影響如表4、圖5所示。

圖5 MNI與抗氧化劑對N-亞硝胺總量的影響Fig.5 Effect of MNI and antioxidants on total N-nitrosamines

表4 MNI與抗氧化劑對培根中N-亞硝胺的影響Table 4 Effects of compound antioxidants on the formation of N-nitrosamines in bacon

由表4可知，常見的9種N-亞硝胺中NDpheA與NMEA未被檢測到。NDMA在食品中存在較多，具有致肝、腎發(fā)生癌變的危害。MNI組N-亞硝胺總量含量最低，與CK組相比降低了21.9%，說明MNI可以顯著減少培根中N-亞硝胺的含量。RM組的NPYP含量低于其他各組，與CK組相比降低了22.3%。MNI組的NDMA、NDEA、NDPA、NPIP、NMOR含量與其他各組相比均最低，與CK組相比分別降低了41.8%、24.9%、44.4%、19.6%、38.2%。由圖5可知，與CK組相比，其余各組N-亞硝胺總量均顯著低于CK組（P＜0.05），MNI組N-亞硝胺總量顯著低于TP組、RM組、VE組（P＜0.05）。

3 結(jié)論

MNI與茶多酚、迷迭香、維生素E均能提升新型培根的感官品質(zhì)，并且與CK組相比，MNI組亞硝酸鹽殘留量降低了8.1%，組胺、精胺及生物胺總量顯著低于其他組（P＜0.05），N-亞硝胺總量降低了 21.9%，NDMA降低了41.8%。綜合各項理化指標并且參考感官評價，提升新型培根品質(zhì)及安全性的效果為MNI組＞TP組＞VE組＞RM組＞CK組。本試驗結(jié)論說明微生物亞硝化抑制劑能有效降低肉制品中N-亞硝胺的含量，對于新型培根的品質(zhì)及安全性有著重要意義，為后續(xù)尋找MNI復配效果更佳的天然抗氧化劑提供參考。