花青素與大豆不溶性膳食纖維穩(wěn)定體系優(yōu)化構(gòu)建及評(píng)價(jià)

孫肖振，陳冬霞，郭文睿，安玲玉，石鎮(zhèn)銘，劉宇恒，賀陽，文連奎

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118）

花青素是存在于葡萄、藍(lán)莓、紫甘藍(lán)等果蔬的水溶性多酚類天然色素[1-3]，基本結(jié)構(gòu)單元為3，5，7－三羥基-2-苯基并吡喃，其3、5、7位上的羥基可以與一個(gè)或多個(gè)單糖（葡萄糖、半乳糖等）、二糖（蕓香糖等）或三糖等連接[4]，多以糖苷鍵形式存在，故又稱花色苷[5]?；ㄇ嗨鼐哂锌寡趸⒖拱?、降脂減肥及調(diào)節(jié)腸道菌群等功效[6-7]，但由于骨架上多個(gè)酚羥基的存在，使花青素易受溫度、光照、pH值、氧氣、抗壞血酸、金屬離子等影響，出現(xiàn)褪色、變色、沉淀等現(xiàn)象，使其穩(wěn)定性和生理活性降低，限制了花青素的應(yīng)用，因此，提高花青素的穩(wěn)定性尤為重要[8]。

近年來，提高花青素穩(wěn)定性的研究已成為食品領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，主要方法有微膠囊法、糖基?；蚺c生物大分子之間通過相互作用形成復(fù)合物[9-13]。在花青素中添加蛋白質(zhì)、淀粉、膳食纖維、果膠等大分子，通過氫鍵、疏水、金屬配位、π-π堆積、靜電和共價(jià)鍵相互作用與大分子結(jié)合[14]，形成較穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，可以起到對(duì)花青素的保護(hù)作用。

大豆不溶性膳食纖維（soybean insoluble dietary fiber，SIDF）含量約占豆渣（大豆榨油和傳統(tǒng)豆制品加工主要副產(chǎn)物）干物質(zhì)的45%，可占大豆豆渣總膳食纖維的90%。有研究表明膳食纖維能夠與多酚類物質(zhì)相互作用，提高其穩(wěn)定性[15-16]。本文構(gòu)建花青素純化物（purified anthocyanins，ACN）與SIDF穩(wěn)定體系并進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為花青素穩(wěn)定性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山葡萄（品種為“北冰紅”）：通化市柳河縣山葡萄產(chǎn)業(yè)服務(wù)中心；豆渣：山東嘉華保健品公司。

乙酸、乙醇、鹽酸（均為分析純）：北京化工廠；D101大孔樹脂（分析純）：天津市光復(fù)精細(xì)化研究所；高峰α-淀粉酶（40 000 U/g）、中性蛋白酶（60 000 U/g）、淀粉葡萄糖苷酶（100 000 U/g）：北京索萊寶科技有限公司；檸檬酸、磷酸氫二鈉（均為食品級(jí)）：江蘇瑞多生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

數(shù)顯恒溫磁力攪拌器（HJ-3B）：博納科技有限公司；紫外可見分光光度計(jì)（T6）：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；電子分析天平（CPA-125）：德國(guó)Sartourius公司；真空冷凍干燥機(jī)（LG0.2）：新陽速凍設(shè)備制造有限公司；離心機(jī)（KL04-A）：美國(guó)Agilent公司；高速冷凍離心機(jī)（JXN-26）：美國(guó)MARCAREG有限公司；電熱恒溫水浴鍋（H.HS21.6）：上海醫(yī)療器械三廠；pH計(jì)（PHS-3D）：上海精科儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 材料預(yù)處理

1.3.1.1 ACN的制備

參考賀陽[17]的方法制備ACN。山葡萄500 g打漿，用65%乙醇-1%鹽酸提取劑進(jìn)行提取[提取液：山葡萄液料比 5∶1（mL/g）]，在 55℃下以 100 r/min振蕩30 min后，收集上清液，在45℃～50℃進(jìn)行減壓濃縮得到花青素粗提物?；ㄇ嗨卮痔嵛锿ㄟ^D101大孔樹脂進(jìn)行純化，洗脫速率為1.5 BV/h，洗脫劑為75%乙醇-0.01%鹽酸。洗脫后的液體在45℃～50℃進(jìn)行減壓濃縮后得到花青素純化物。采用pH示差法測(cè)定ACN（總花青素含量）≥25%。

1.3.1.2 SIDF的制備

參照Wang等[18]方法制備SIDF。取干豆渣10 g，加入蒸餾水進(jìn)行稀釋，料液比為1∶50（g/mL），然后進(jìn)行連續(xù)的酶消化，首先加入1 mL熱穩(wěn)定的α-淀粉酶（0.25 g/mL），在 95℃～100℃條件下水浴 35 min，然后加入3 mL中性蛋白酶（0.125 g/25 mL），60℃水浴振蕩30 min后，加入100 mL乙酸溶液（3 mol/L）調(diào)節(jié)pH值至4.5，最后加入4 mL淀粉葡萄糖苷酶（0.25 g/12.5 mL）進(jìn)行30 min酶解。酶解完成后加入70℃蒸餾水靜置2 h，在3 500 r/min條件下離心20 min，用5倍體積的95%乙醇沉淀12 h后進(jìn)行真空抽濾，殘留物進(jìn)行冷凍干燥。選用100目～500目篩網(wǎng)對(duì)SIDF進(jìn)行過篩，獲取不同粒徑的SIDF。

1.3.2 ACN-SIDF穩(wěn)定體系構(gòu)建流程

將適量ACN與SIDF按一定質(zhì)量比，用pH3.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液定容至100 mL（最終總花青素含量為12 mg/100 mL），按試驗(yàn)設(shè)計(jì)構(gòu)建ACN-SIDF穩(wěn)定體系，未經(jīng)穩(wěn)定處理的ACN溶液為對(duì)照。以吸光度和沉淀離心率為指標(biāo)評(píng)價(jià)體系穩(wěn)定效果。測(cè)定溶液沉淀30 min后在最大吸收波長(zhǎng)521 nm處吸光度；同時(shí)稱量離心管的質(zhì)量，量取5 mL穩(wěn)定溶液，加入離心管中，常溫下6 000 r/min離心20 min，離心后倒掉上層液體，再將離心管倒置5 min后稱重，按照下列公式測(cè)定穩(wěn)定溶液的沉淀離心率。

沉淀離心率/%=（W2-W1）/（W3-W1）×100

式中：W1為離心管質(zhì)量，g；W2為離心倒置后離心管加沉淀物的質(zhì)量，g；W3為離心前樣品加離心管的質(zhì)量，g。

1.3.3 ACN-SIDF穩(wěn)定體系構(gòu)建單因素試驗(yàn)

在pH3.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中加入適量ACN和SIDF，分別以ACN與SIDF質(zhì)量比（1∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50）、SIDF 粒徑（100、200、300、400、500 目）、乳化溫度（20、30、40、50、60 ℃）、乳化時(shí)間（10、20、30、40、50 min）為考察因素，最終用 pH3.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液定容至100 mL（最終總花青素含量為12 mg/100 mL），每個(gè)因素水平試驗(yàn)時(shí)，其他因素以中間水平值為定值，避光恒溫磁力攪拌后，將溶液靜置30 min，測(cè)定λ521nm處的吸光度，常溫下6 000 r/min離心20 min后，以吸光度和沉淀離心率為指標(biāo)來評(píng)價(jià)體系穩(wěn)定效果。

1.3.4 ACN-SIDF穩(wěn)定體系構(gòu)建正交試驗(yàn)

在單因素基礎(chǔ)上，選取ACN與SIDF質(zhì)量比、SIDF粒徑、乳化溫度、乳化時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，以吸光度及沉淀離心率作為指標(biāo)評(píng)價(jià)穩(wěn)定效果，計(jì)算吸光度和沉淀離心率的權(quán)重系數(shù)，用于數(shù)據(jù)分析。

1.3.5 ACN-SIDF穩(wěn)定體系穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

1.3.5.1 熱穩(wěn)定性

將ACN-SIDF穩(wěn)定體系與ACN溶液分別置于玻璃管中用錫紙包裹，在（100±2）℃的水浴中熱處理100 min，每隔20 min從水浴中取出后，立即放入冰水中冷卻，在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以花青素保存率（retention rate，R）為指標(biāo)，評(píng)價(jià)熱穩(wěn)定效果。根據(jù)下列公式計(jì)算花青素保存率。

R/%=A1/A×100

式中：A1為熱、光處理后花青素的吸光度；A為熱、光處理前花青素的吸光度。

1.3.5.2 光穩(wěn)定性

將ACN-SIDF穩(wěn)定體系與ACN溶液密封在玻璃瓶中，在室溫（20±2）℃條件下光照（置于室內(nèi)的窗臺(tái)上，每天日照時(shí)間不少于 6 h）保存。分別于 0、5、10、15、20、25、30 d后取出樣品。在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定花青素的吸光度，根據(jù)公式計(jì)算花青素保存率。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析與處理

所有測(cè)試進(jìn)行3次平行測(cè)定，結(jié)果取平行測(cè)定的平均值表示，使用SPSS 23版與Origin 2.19版軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果分析

2.1 ACN-SIDF穩(wěn)定體系構(gòu)建單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 ACN與SIDF質(zhì)量比對(duì)穩(wěn)定體系的影響

ACN與SIDF質(zhì)量比對(duì)穩(wěn)定體系的影響見圖1。

圖1 ACN與SIDF質(zhì)量比對(duì)穩(wěn)定體系的影響Fig.1 Effect of ACN-SIDF mass ratio on the stable system

由圖1可知，ACN與SIDF質(zhì)量比為1∶30時(shí)，穩(wěn)定體系在λ521nm處的吸光度達(dá)到最高水平0.872，而離心沉淀率最小0.846%，這可能是由于SIDF分散在溶液中與花青素發(fā)生分子間的交互作用，形成穩(wěn)定的懸浮狀液體。當(dāng)SIDF比例逐漸升高時(shí)，過量的SIDF無法與ACN結(jié)合，產(chǎn)生沉淀，使吸光度呈下降趨勢(shì)，沉淀離心率呈上升趨勢(shì)。由于正交試驗(yàn)需設(shè)置3個(gè)不同水平，考慮到綜合評(píng)分結(jié)果，選擇ACN與SIDF質(zhì)量比為1∶20、1∶30、1∶40進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.2 SIDF粒徑對(duì)穩(wěn)定體系的影響

SIDF粒徑對(duì)穩(wěn)定體系的影響見圖2。

圖2 SIDF粒徑對(duì)穩(wěn)定體系的影響Fig.2 Effect of SIDF particle size on the stable system

由圖2可知，SIDF粒徑為200目～400目時(shí)，穩(wěn)定體系的吸光度和沉淀離心率較好。當(dāng)SIDF粒徑為300目時(shí)，穩(wěn)定體系在λ521nm處的吸光度達(dá)到較高水平，為0.862，而離心沉淀率最小0.815%，300目粒徑的SIDF穩(wěn)定效果最佳，可能是由于超微粉碎使SIDF顆粒細(xì)微化，并增大了SIDF的表面積，使更多的極性基團(tuán)和水結(jié)合位點(diǎn)暴露在周圍的水中，進(jìn)而增加了SIDF與花青素的接觸面積，使它們能緊密結(jié)合，從而降低沉淀離心率并增加吸光度[19]。當(dāng)SIDF粒徑目數(shù)逐漸增大，粉體過于細(xì)微化，出現(xiàn)疏水作用等排斥力，使得花青素?zé)o法與SIDF絡(luò)合，并產(chǎn)生沉淀。因此，選擇SIDF粒徑為200、300、400目進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.3 乳化溫度對(duì)穩(wěn)定體系的影響

乳化溫度對(duì)穩(wěn)定體系的影響見圖3。

圖3 乳化溫度對(duì)穩(wěn)定體系的影響Fig.3 Effect of emulsification temperature on the stable system

由圖3可知，隨著乳化溫度的升高，吸光度呈下降的趨勢(shì)，沉淀離心率整體呈逐漸上升的趨勢(shì)。當(dāng)乳化溫度為30℃時(shí)，穩(wěn)定體系在λ521nm處的吸光度達(dá)到較高水平，為0.869，而離心沉淀率最小0.818%。研究表明，疏水作用是一個(gè)吸熱的過程，氫鍵作用是一個(gè)放熱的過程，由于溫度的不同，兩種過程相互作用的比例也不同[20]。溫度的變化對(duì)多酚與膳食纖維之間的相互作用有一定的影響，當(dāng)乳化溫度由20℃升高到30℃時(shí)，ACN與SIDF之間可能通過疏水相互作用結(jié)合，而當(dāng)乳化溫度逐漸升高，疏水鍵斷裂，同時(shí)產(chǎn)生氫鍵相互作用[21]。因此，選擇乳化溫度為20、30、40℃進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.4 乳化時(shí)間對(duì)穩(wěn)定體系的影響

乳化時(shí)間對(duì)穩(wěn)定體系的影響見圖4。

圖4 乳化時(shí)間對(duì)穩(wěn)定體系的影響Fig.4 Effect of emulsification time on the stable system

由圖4可知，乳化時(shí)間為30 min～50 min時(shí)，穩(wěn)定體系的吸光度和沉淀離心率結(jié)果相對(duì)較好。當(dāng)乳化時(shí)間為40 min時(shí)，穩(wěn)定體系在λ521nm處的吸光度達(dá)到較高水平0.878，而離心沉淀率最小0.782%。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為20 min～40 min時(shí)，溶液的吸光度逐漸增加，沉淀離心率逐漸減小，表明反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)有利于提高穩(wěn)定體系的互作效應(yīng)。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，吸光度與離心沉淀率逐漸趨于平緩，表明反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)反應(yīng)效果影響逐漸減小，使其相互作用效應(yīng)達(dá)到平衡。同時(shí)考慮到經(jīng)濟(jì)與穩(wěn)定效果，選擇乳化時(shí)間為30、40、50 min進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2 ACN-SIDF穩(wěn)定體系構(gòu)建正交試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 變異系數(shù)法分析

變異系數(shù)法是直接利用各項(xiàng)指標(biāo)所包含的信息，通過計(jì)算得到指標(biāo)的權(quán)重，是客觀賦權(quán)的方法。通過賦予權(quán)重衡量穩(wěn)定體系吸光度和沉淀離心率的相對(duì)重要性。

各個(gè)指標(biāo)的變異系數(shù)按下列公式計(jì)算。

式中：Vi為第i項(xiàng)指標(biāo)的變異系數(shù)；Si為第i項(xiàng)指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)差；Xi為第i項(xiàng)指標(biāo)的算術(shù)平均值。

各個(gè)指標(biāo)的權(quán)重按下列公式計(jì)算。

式中：Wi為第i項(xiàng)指標(biāo)的權(quán)重；Vi為第i項(xiàng)指標(biāo)的變異系數(shù)；為n項(xiàng)指標(biāo)的和。

通過公式計(jì)算可知，吸光度的權(quán)重為0.475，沉淀離心率的權(quán)重為0.525。

采用SPSS 23版標(biāo)準(zhǔn)差標(biāo)準(zhǔn)化法將各指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化，結(jié)果見表1。在穩(wěn)定體系指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)值中，吸光度數(shù)值越大越好，沉淀離心率數(shù)值越小越好，對(duì)于指標(biāo)越小越好的沉淀離心率測(cè)定值，標(biāo)準(zhǔn)化后需在數(shù)值前加負(fù)號(hào)。

表1 ACN-SIDF穩(wěn)定體系指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化值Table 1 Standardized values of indicators of ACN-SIDF stable system

2.2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

將標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)值與對(duì)應(yīng)的權(quán)重相乘，計(jì)算各個(gè)指標(biāo)的總合，得到各樣品的綜合評(píng)分，計(jì)算正交試驗(yàn)綜合評(píng)分。正交試驗(yàn)因素水平及試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析Table 2 Orthogonal experiment results

由表2可知，ACN與SIDF質(zhì)量比（A）、SIDF粒徑（B）、乳化溫度（C）和乳化時(shí)間（D）對(duì)花青素穩(wěn)定效果的綜合評(píng)分最高組合為A2B1C2D3（綜合評(píng)分為0.692）。由正交試驗(yàn)中極差R可知，各因素對(duì)ACN-SIDF穩(wěn)定體系影響程度為C＞B＞A＞D，由K值可知，最優(yōu)組合為A2B2C2D3，但考慮到較小的粒徑能夠提高SIDF的持水能力和比表面積，降低表面張力，并可以將更多的極性基團(tuán)暴露在周圍的水中，從而與花青素純化物緊密結(jié)合，因此將穩(wěn)定體系的最優(yōu)組合調(diào)整為A2B2C2D3，即ACN與SIDF質(zhì)量比1∶30、SIDF粒徑300目、乳化溫度30℃、乳化時(shí)間50 min。

穩(wěn)定體系正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

由表3方差分析可知，乳化溫度對(duì)穩(wěn)定體系有極顯著影響（P＜0.01），ACN 與 SIDF質(zhì)量比、SIDF粒徑對(duì)穩(wěn)定體系影響顯著（P＜0.05）。

2.3 ACN-SIDF穩(wěn)定體系穩(wěn)定性評(píng)價(jià)結(jié)果與分析

2.3.1 熱穩(wěn)定性評(píng)價(jià)結(jié)果與分析

熱處理對(duì)花青素保存率的影響見圖5。

圖5 熱處理對(duì)花青素保存率的影響Fig.5 Effect of heat treatment on retention rate of anthocyanin

由圖5可知，在100℃加熱100 min后ACN-SIDF穩(wěn)定體系與ACN溶液的花青素保存率分別為72.66%和56.85%，ACN-SIDF穩(wěn)定體系的花青素保存率較ACN溶液提高了15.81%。結(jié)果表明，ACN-SIDF穩(wěn)定體系具有較高的熱穩(wěn)定性，分析可能是生物大分子與酚類物質(zhì)之間存在相互作用，如范德華力、氫鍵、靜電相互作用和疏水作用等。這些相互作用使生物大分子與酚類物質(zhì)結(jié)合，因此提高了酚類物質(zhì)的熱穩(wěn)定性[22]。也可能是膳食纖維具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，能夠吸附多酚類物質(zhì)，從而保護(hù)多酚類物質(zhì)在加熱條件下的穩(wěn)定性[22]。

2.3.2 光穩(wěn)定性評(píng)價(jià)結(jié)果與分析

光照對(duì)花青素保存率的影響見圖6。

圖6 光照對(duì)花青素保存率的影響Fig.6 Effect of sunlight on retention rate of anthocyanin

由圖6可知，在日光照射條件下貯藏30 d后，ACN-SIDF穩(wěn)定體系和ACN溶液的花青素保存率分別為71.45%和54.89%。綜合表明，SIDF可以延長(zhǎng)花青素在日光條件下的保存時(shí)間，相較于ACN溶液，ACNSIDF穩(wěn)定體系的花青素保存率提高了16.56%。環(huán)境條件對(duì)花青素穩(wěn)定性具有重要的作用，SIDF對(duì)花青素有良好的保護(hù)效果。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過正交試驗(yàn)，優(yōu)化構(gòu)建ACN-SIDF穩(wěn)定體系并對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，表明構(gòu)建ACN-SIDF穩(wěn)定體系的最優(yōu)參數(shù)為ACN與SIDF質(zhì)量比1∶30、SIDF粒徑300目、乳化溫度30℃、乳化時(shí)間50 min。在100℃水浴中熱處理100 min，ACN-SIDF穩(wěn)定體系花青素保存率為72.66%，較比ACN溶液提高了15.81%。在室溫（20±2）℃、光照30 d條件下，穩(wěn)定體系花青素保存率為71.45%，比ACN溶液提高了16.56%。綜合試驗(yàn)結(jié)果表明，ACN-SIDF穩(wěn)定體系中由于SIDF的加入明顯提高了花青素的熱穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性。