耐鹽堿枸杞低聚糖結(jié)構(gòu)鑒定及其體外消化能力和抑菌作用

劉昊，于濱，崔波*

（1．齊魯工業(yè)大學（山東省科學院）生物基材料與綠色造紙國家重點實驗室，山東 濟南 250353；2.齊魯工業(yè)大學（山東省科學院）食品科學與工程學院，山東 濟南 250353）

枸杞系茄科、枸杞屬植物，廣泛分布于寧夏、甘肅、青海等西北地區(qū)，在南北美洲和西歐等國家也廣為引種，是深受人們歡迎的食品之一[1-2]。枸杞作為我國傳統(tǒng)的“藥食同源”植物，具有延年益壽、滋陰補腎、強筋壯骨、養(yǎng)血明目、潤肺止咳等多種營養(yǎng)價值和保健功能，其果實中有效的活性物質(zhì)較為復(fù)雜[2-6]。在目前的研究中，枸杞多糖已經(jīng)被很多研究者證明其具有免疫活性和維持腸道菌群的平衡等活性[7-11]。黃河三角洲區(qū)域內(nèi)存在大面積中低產(chǎn)鹽堿地，土壤鹽漬化導(dǎo)致當?shù)罔坭降拈_發(fā)和利用程度較低[12]。目前，利用多糖降解的方法制備耐鹽堿枸杞低聚糖，其結(jié)構(gòu)的鑒定和生理活性尚未見報道。某些低聚糖片段是多糖的活性中心，多糖的活性與其結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象密切相關(guān)，其生物活性主要取決于寡糖活性片段[13-15]。功能性低聚糖是由2個～10個單糖通過糖苷鍵連接而成的低分子量的非消化性碳水化合物[16]，不易被人體消化吸收，并且能夠有效地抑制有害菌的生長，降低毒素在腸道內(nèi)外膜上的附著力[17]，從而能夠在腸道發(fā)揮獨特的生理功能來維持機體健康。因此，對低聚糖消化吸收、抑制有害菌生長等生理活性的評價具有重要意義。本試驗以黃河三角洲鹽堿地枸杞為研究對象，對其果實提取液中的枸杞多糖進行降解，得到耐鹽堿枸杞低聚糖，利用現(xiàn)代色譜和波譜技術(shù)對其結(jié)構(gòu)進行初步鑒定，同時測定其體外消化能力和抑菌作用，探究其生理活性，為枸杞類產(chǎn)品開發(fā)提供參考，以期將其添加到食品中，開發(fā)具有獨特生理功能的產(chǎn)品，實現(xiàn)黃河三角洲鹽堿地枸杞的高效利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞：山東東營黃河三角洲鹽堿地；c聚糖（Lycium barbarum oligosaccharides，LBO）：齊魯工業(yè)大學生物基材料與綠色造紙國家重點實驗室自制；三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）、石油醚、重水（D2O）、溴化鉀（KBr）（光譜純）：上海麥克林生化科技有限公司；氯仿、正丁醇、碳酸鈉（Na2CO3）、無水乙醇、95%乙醇、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、碳酸氫鈉（NaHCO3）、無水葡萄糖、醋酸鈉（CH3COONa）：國藥集團化學試劑有限公司；Tris-鹽酸緩沖液：Sigma-Aldrich（上海）貿(mào)易有限公司；鹽酸（HCl）、硫酸（H2SO4）：煙臺遠東精細化工有限公司；鏈霉蛋白酶（Pronase E，7000 U/g）、胃脂肪酶（30 000 U/g）、胃蛋白酶（3 000 U/mg）、胰酶（4 000 U/g）、胰蛋白酶（4 000 U/mg）、豬膽粉、3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）溶液：北京索萊寶科技有限公司；單糖分析標準品（阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖）（均為色譜純）：上海源葉生物科技有限公司；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus CGMCC.1.12409）、培養(yǎng)基 CM0002：中國共同微生物收集與管理中心；Sephadex G-100、Sephadex G-25：北京瑞達恒輝科技發(fā)展有限公司。未單獨說明的試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004分析天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；FSJ-A05N6小型粉碎機：廣東小熊電器有限公司；TDL-40B離心機：上海安亭科學儀器廠；RE2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海賢德實驗儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鄭州科泰實驗設(shè)備有限公司；HH-21-8電熱恒溫水浴鍋：常州諾基儀器有限公司；JXDG-10真空冷凍干燥機：上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司；MixTable渦旋振蕩器：合肥艾本森科學儀器有限公司；LAI-3T厭氧培養(yǎng)箱：上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；FE28型pH計：梅特勒-托力多儀器（上海）有限公司；UV-6100型紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；Frontier型傅里葉變換紅外光譜儀：美國Perkin-Elmer公司；Avance II400核磁共振波譜儀：瑞士Bruker公司；LC-20A液相色譜儀：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 枸杞低聚糖的制備

將枸杞進行預(yù)處理，洗凈、烘干后，用粉碎機粉碎，過篩。定量稱取經(jīng)預(yù)處理后的干燥枸杞粉，經(jīng)石油醚加熱回流重復(fù)脫脂3次，烘干后按料液比1∶3（g/mL）加入蒸餾水于90℃水浴提取2 h，過濾，得濾液，4 000 r/min離心15 min，棄去殘渣，重復(fù)離心2次，合并上清液。采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器真空濃縮至1/4體積，冷卻至室溫（25℃）。加入1/5體積Sevag試劑（氯仿∶正丁醇=4∶1，體積比），劇烈振搖，使其充分混勻，4 000 r/min離心15 min，傾出上清液，除去中間變性蛋白和下層氯仿，重復(fù)以上操作直至中間層無變性蛋白，收集上清液加入4倍體積的95%乙醇沉淀，靜置24 h，濾布過濾，冷凍干燥后得到枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharides，LBP）[18]。在 0.1 mol/L 的 Tris-鹽酸緩沖液加入一定量的 LBP、Pronase E（LBP ∶Pronase E=1 ∶2，質(zhì)量比），60℃預(yù)熱30 min使其它酶滅活。然后在樣品液中加入樣品質(zhì)量1%的Pronase E，37℃消化24 h后，再補加樣品質(zhì)量0.5%的Pronase E，繼續(xù)消化48 h，確保反應(yīng)液的pH值保持在8.0左右。反應(yīng)結(jié)束后以Sephadex G-100純化，Sephadex G-25除鹽，之后加入40 mmol/L H2SO4，80℃攪拌反應(yīng)取樣，以0.25 mol/L Na2CO3溶液中和，然后以蒸餾水透析，收集袋內(nèi)液濃縮，加入0.5 mol/L TFA水解，80℃反應(yīng)4 h，蒸餾水濃縮數(shù)次至中性為止，冷凍干燥后得到LBO[19]。

1.3.2 枸杞低聚糖結(jié)構(gòu)的鑒定

1.3.2.1 傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）分析

取一定量干燥的LBO，按照質(zhì)量比1∶200～1∶250添加干燥的KBr粉末，混合均勻，制得壓片，波數(shù)范圍為4 000 cm-1～400 cm-1，置于傅里葉變換紅外光譜儀上進行掃描，繪制紅外光譜圖[20]。

1.3.2.2 核磁共振波譜（nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR）分析

將干燥的LBO溶解于含有0.1%四甲基硅烷的0.5 mL D2O中，使用核磁共振光譜儀（400 MHz）對樣品進行1H NMR和13C NMR波譜分析[20]。

1.3.2.3 高效凝膠滲透色譜（high-performance gel chromatography，HPGPC）分析

配制葡聚糖標準品，用流動相溶解LBO樣品，過0.45 μm微孔濾膜，5 000 r/min離心10 min后取上清液，用流動相沖洗色譜柱至平衡，標準品和待測樣品分別進樣測定。色譜條件為色譜柱：TSKgel G4000-PWXL（7.8mm×30cm，10μm）；流動相：0.1mol/L NaNO3；檢測器：示差檢測器；柱溫：40 ℃；流速：0.5 mL/min；進樣體積：20 μL。以葡聚糖標準品重均分子量的對數(shù)（lgMw）對保留時間（tR）作圖，通過分子量標準曲線及回歸方程計算得出LBO分子量[21]。

1.3.2.4 高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC）分析

依次精確移取阿拉伯糖（arabinose，Ara）、木糖（xylose，Xyl）、鼠李糖（rhamnose，Rha）、半乳糖（galactose，Gal）、葡萄糖（glucose，Glu）和甘露糖（mannose，Man）標準溶液 1 000、500、200、100、50 μL，用水定容至1 mL，配制成濃度為 100、50、20、10、5 mg/L 系列標準溶液，上機測定。稱量0.1 g LBO，加4 mol/L TFA 10 mL，充氮氣，110℃水解2 h，冷卻至室溫（25℃），加入4 mol/L NaOH調(diào)pH值為6.5，加水定容。參照文獻[22]的方法，取1 mL樣品溶液同標準品一起衍生后，過0.45 μm微孔濾膜上機。色譜條件為色譜柱：Diamonsil Plus 5 μm C18色譜柱（250 mm×4.6 mm）；流動相 A：0.05 mol/L KH2PO4-NaOH；流動相B：乙腈；檢測器：紫外檢測器；柱溫：40 ℃；流速：1.0 mL/min；進樣體積：20 μL。

1.3.3 枸杞低聚糖體外模擬胃腸道消化能力的測定

1.3.3.1 消化體系的制備

參照文獻[23]的方法配制胃電解質(zhì)和腸電解質(zhì)。胃腸液的配制：稱取12.5mg胃脂肪酶和11.8mg胃蛋白酶，加入50 mL胃電解質(zhì)和1.5 mL CH3COONa（1 mol/L，pH5），在室溫（25℃）條件下于磁力攪拌器上攪拌，用0.1 mol/L HCl調(diào)pH值至2；將100 g腸電解質(zhì)、100 g胰酶溶液、13 mg胰蛋白酶、200 g膽汁混合，用0.1 mol/L NaHCO3調(diào)pH值至7。胃腸液-4℃冷藏備用。

1.3.3.2 模擬消化

取4 mL LBO樣品溶液（1 mg/mL），加10 mL胃液，放在 37℃、200 r/min搖床內(nèi)反應(yīng)，在 0、2、4、6 h時取樣1 mL，沸水浴5 min滅酶活。消化6 h后用0.1 mol/L NaHCO3調(diào)pH值至7，加腸液1.8 mL，混勻，繼續(xù)37℃、200 r/min 搖床內(nèi)反應(yīng)，在 0、2、4、6 h 時取樣 1 mL，沸水浴5 min滅酶活。同時設(shè)立空白對照組，只加胃液和胃腸液，不加樣品。設(shè)置3個重復(fù)。釆用3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）法測定消化產(chǎn)物中還原糖的生成量。以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標建立標準曲線。取200 μL樣品，加600 μL DNS溶液，沸水浴15 min，冷卻后加3.2 mL水，于550 nm處測吸光度，測定樣品中還原糖含量[24]。

1.3.4 枸杞低聚糖的抑菌性

1.3.4.1 菌種的活化

試驗前在無菌操作條件下，將金黃色葡萄球菌制劑膠囊中的凍干菌粉移入盛有無菌生理鹽水的試管中，充分振蕩使菌體混合均勻。以0.1%接菌量接種于10 mL活化培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)，傳代2次，重新接種發(fā)酵18 h后得菌種母液。

1.3.4.2 生長曲線的測定

參照文獻[25]的方法并進行修改，LBO添加量依次為基礎(chǔ)培養(yǎng)基中葡萄糖質(zhì)量的1/3、2/3和1取代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖作為試驗培養(yǎng)基，113℃濕熱滅菌20 min，取菌種母液以0.1%接菌量分別接種基礎(chǔ)培養(yǎng)基和試驗培養(yǎng)基。37℃厭氧培養(yǎng)48 h，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h 取樣測定在 600 nm 下金黃色葡萄球菌的菌體濃度，每個處理設(shè)3個重復(fù)。以培養(yǎng)時間為橫坐標，菌體濃度OD600nm為縱坐標，繪制生長曲線。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0軟件中的Duncan法進行數(shù)據(jù)的差異性分析，Origin 8.5作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞低聚糖結(jié)構(gòu)鑒定分析

2.1.1 FT-IR分析

LBO的FT-IR如圖1所示。

圖1 LBO紅外光譜圖Fig.1 Infrared spectrum of LBO

由圖1可知，3 400 cm-1處寬峰是由O-H伸縮振動和N-H伸縮振動引起的[26]。因此，LBO可能含-OH、-NH2或-NH-基團。2 930 cm-1C-H的伸縮振動是糖類的特征峰，表明多糖發(fā)生降解后仍含有-CH2-基團[27]。1 640 cm-1附近的吸收峰為一級氨基和二級氨基N-H的變角振動或-C=O的非對稱伸縮振動峰[5，28]，表明有蛋白質(zhì)成分存在。-COOH的C-O伸縮振動引起的1 420 cm-1吸收峰，-COO的C=O對稱伸縮振動引起的1 350 cm-1吸收峰和-COOH的O-H變角振動引起的1 250 cm-1吸收峰表明LBO中含有-COOH基團[29]。1 040 cm-1處的吸收峰為一級醇羥基的變角振動峰。1 400 cm-1～1 160 cm-1處的吸收峰是C-H鍵的變角振動，它與C-H的伸縮振動構(gòu)成了糖環(huán)的特征吸收，1 160 cm-1～1 040 cm-1間的吸收峰證明了吡喃糖糖苷的存在[30]。840 cm-1和760 cm-1左右為α型糖苷鍵和α-D-葡萄糖環(huán)的吸收峰[31]，870 cm-1～810 cm-1為甘露糖的特征峰[32]。

2.1.21H NMR和18C NMR分析

LBO的1H NMR圖譜如圖2所示。

圖2 LBO1H NMR圖譜Fig.2 Spectrum of LBO1H NMR

由圖2可知，LBO的信號大多集中在δ 2.9 ppm～5.1 ppm之間，δ 4.58 ppm處的質(zhì)子信號為溶劑D2O的質(zhì)子位移，δ 3.2 ppm～4.3 ppm為糖環(huán)質(zhì)子信號。譜圖中顯示在δ 5.15 ppm處有端基氫質(zhì)子的信號，表明LBO樣品中含有α型糖苷鍵[30]。異頭碳上氫的化學位移δ 2.9 ppm～4.1 ppm出現(xiàn)糖類的特征分裂信號，產(chǎn)生吸收峰裂分的原因可能是相鄰的自旋核（氫核）之間通過成鍵電子發(fā)生相互干擾作用而形成的多重共振躍遷，產(chǎn)生共振吸收峰的裂分[33]。除此之外，譜圖顯示具有小于δ 4.8 ppm的質(zhì)子信號，這表明存在吡喃糖殘基[34]。13C NMR圖譜比1H NMR圖譜有著范圍更廣的化學位移，且有著較高的分辨率，能夠更好地區(qū)分分子的構(gòu)型和構(gòu)象。

LBO13C NMR圖譜見圖3。

圖3 LBO13C NMR圖譜Fig.3 Spectrum of LBO13C NMR

如圖3所示，異頭碳的共振區(qū)有4個信號，均為α型糖苷異頭碳，表明LBO主要以α型糖苷鍵構(gòu)型存在。另外，LBO的信號大多集中在δ 60 ppm～77 ppm之間，表明其中吡喃環(huán)占有較大比例，且δ 71.50 ppm～71.69 ppm、δ 73.29～73.96 ppm、δ 76.68 ppm～76.81 ppm、δ 72.65 ppm～72.81 ppm有著較強信號，它們屬于吡喃葡萄糖殘基的 C2、C3、C4、C5的振動信號[35]。這與 FT-IR和1H NMR的研究結(jié)果相一致。

2.1.3 HPGPC分析分子量分布

葡聚糖標準品和LBO樣品的HPGPC結(jié)果如圖4所示。

圖4 LBO的分子量分布色譜圖Fig.4 Molecular weight distribution chromatogram of LBO

由圖4可知，黑色實線為LBO樣品的示差信號圖，圖中出現(xiàn)了1個非常明顯的出峰區(qū)間，其出峰的保留時間為20.092 min，該區(qū)間為LBO主要的分子量組分，占LBO樣品的63.1%。根據(jù)葡聚糖的標準曲線，lgMw=-0.043 9tR3+2.300 1tR2-40.552 7tR+244.938 5，R2=0.994 2。計算可得LBO的平均重均分子量Mw在507.48 Da左右。

2.1.4 PMP-HPLC分析單糖組成結(jié)果

通過對比添加的單糖的峰型、峰面積和出峰時間的變化，確定了LBO的單糖組成，結(jié)果如圖5和圖6所示。

圖5 標準單糖的分析色譜圖Fig.5 Analysis chromatogram of standard monosaccharide

圖6 LBO單糖的組成分析色譜圖Fig.6 Composition analysis chromatogram of LBO monosaccharide

由圖5、圖6可知，從左至右，各出峰依次為PMP、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖；添加了樣品水解液后，甘露糖、鼠李糖和葡萄糖的峰型和出峰時間保持一致，其相應(yīng)的單糖的峰面積增加，各單糖的出峰順序依次為甘露糖、鼠李糖、葡萄糖，說明樣品水解液中包含這3種糖類。

2.2 體外模擬胃腸道消化能力分析

DNS法繪制的還原糖標準曲線如圖7所示。

圖7 DNS法繪制葡萄糖標準曲線Fig.7 Drawing glucose standard curve by DNS method

計算得到枸杞低聚糖經(jīng)胃液消化后產(chǎn)物的還原糖含量，以此來表示LBO在胃液和胃腸液中的消化能力，消化產(chǎn)物的還原糖含量與消化能力成正比，其變化趨勢如表1所示。

表1 不同模擬消化時間下LBO消化產(chǎn)物的還原糖含量Table 1 Reducing sugar content of LBO digestion products at different simulated digestion times

由表1可知，胃腸環(huán)境中也含有一定量還原糖。在0、2、4、6 h時取樣檢測，發(fā)現(xiàn)隨著胃液消化的進行，還原糖含量由0 h的0.128 3 mg/mL降至6 h的0.121 3 mg/mL，還原糖的含量并沒有明顯升高，說明枸杞多糖在胃液中只有輕微程度的降解，甚至不降解。而在胃腸液消化時，LBO的還原糖含量無顯著差異（P＞0.05），說明即使在消化了6 h后，也只有少量的還原糖產(chǎn)生，有極少的糖苷鍵發(fā)生了變化。LBO在胃腸液中不發(fā)生降解這一結(jié)論，可以初步推斷出LBO可作為一種益生元應(yīng)用到宿主機體內(nèi)，調(diào)控腸道平衡。

2.3 抑菌性分析

圖8為LBO對金黃色葡萄球菌在不同添加量下處理后的生長曲線。

圖8 金黃色葡萄球菌生長曲線Fig.8 Growth curve of Staphylococcus aureus

由圖8可知，未添加LBO的金黃色葡萄球菌在整個生長期間表現(xiàn)出了典型的細菌生長特性，生長曲線呈現(xiàn)S型，而添加了LBO的金黃色葡萄球菌的生長曲線逐漸趨于直線，金黃色葡萄球菌的整個生長期間的菌體濃度出現(xiàn)了下降的趨勢，對數(shù)期增長速度減緩，穩(wěn)定期菌體數(shù)量下降。添加更高濃度的LBO，對金黃色葡萄球菌的生長抑制作用更加明顯。

3 結(jié)論

通過酸解和酶解聯(lián)合的方法對枸杞多糖進行降解，得到了枸杞低聚糖。分別以傅里葉變換紅外光譜、核磁共振波譜、高效凝膠滲透色譜和高效液相色譜對枸杞低聚糖的結(jié)構(gòu)進行了初步鑒定，確定了其可能存在的基團和糖苷鍵、分子量和單糖組分。根據(jù)上述結(jié)果，可以確定枸杞低聚糖的分子量在507.48 Da左右，主要以α型糖苷鍵連接的吡喃糖存在，由甘露糖、鼠李糖和葡萄糖組成。要系統(tǒng)完整地分析其結(jié)構(gòu)還需要采用高碘酸氧化、Smith降解等分析方法進行更深入的研究。同時，在模擬胃腸液試驗中發(fā)現(xiàn)枸杞低聚糖的降解程度較低，枸杞低聚糖可能作為一種益生元被機體所利用，這可以作為下一步對其生物活性研究的全新突破口。此外，以常見的致病菌金黃色葡萄球菌為代表，枸杞聚糖對其有較強的抑制作用，且抑菌能力隨著濃度的增加而增強。對作用于未來體內(nèi)實驗的機理研究提供了更為可靠的依據(jù)，有助于探索枸杞低聚糖與腸道菌群間相互干預(yù)的作用關(guān)系。