LINC01234 通過調(diào)控IGF2BP1 c-Myc 對急性髓系白血病細胞增殖 侵襲 遷移的影響*

劉景珍 李彥華 葛一蓉 薛紅娟 劉文春

急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML），類似于大多數(shù)其他人類惡性腫瘤，是一種高度異質(zhì)性疾病[1]。約40%的年輕AML 患者和10%的老年AML患者可以通過目前的標準化療治愈[2]。盡管近年來AML 治療取得了一些進展，但由于耐藥性的快速發(fā)展和治療后的高復發(fā)率，AML 患者的長期生存仍很差[3]。因此，尋找針對AML 的特異性、新穎的治療靶點越來越迫切，這可能會改善AML 的臨床療效。一些報道認為長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是AML 進展中的新調(diào)節(jié)因子。lncRNA 由RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄，其5'端可被帽封，3'端可聚腺苷化[4]。lncRNA 的失調(diào)參與了癌癥的發(fā)生和進展[5-6]。lncRNA 通過多種機制調(diào)控癌細胞中與增殖、生存、遷移、轉(zhuǎn)移或多能性相關(guān)的下游基因的表達[7]。諸多臨床試驗[8-9]表明，lncRNA 作為新型腫瘤相關(guān)生物標志物在早期腫瘤篩查和預測腫瘤患者臨床結(jié)果方面具有重要的潛力。然而，lncRNA 在AML 中的表達和功能研究還很有限。LINC01234 是近年來新發(fā)現(xiàn)的與腫瘤進展相關(guān)的lncRNA，位于染色體12q24.13 上。部分研究表明，LINC01234 在乳腺癌[10]、肝癌[11]、結(jié)直腸癌[12]中上調(diào)表達，能夠促進疾病進展。上述研究表明，LINC01234 在人類疾病進展中作用重大。然而，LINC01234 在AML 中的表達及其與AML 細胞進展之間的相關(guān)性尚未明確。因此，本研究將揭示LINC0-1234 在AML 中的表達情況，并探討LINC01234 在AML 中的功能及潛在機制。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

分析2019 年3 月至2021 年9 月在湖北省恩施州中心醫(yī)院確診的31 例AML 患者和在本院體檢的24 例健康志愿者的外周血標本。31 例AML 患者中男性20 例，女性11 例，平均年齡（49.34±12.29）個月。根據(jù)FAB 分型，31 例AML 患者中M1 型8 例，M2型11 例，M4 型8 例，M5 型4 例。24 例健康志愿者中男性14 例，女性10 例，平均年齡（36.59±5.42）個月。采集的外周血標本用標準Ficoll-Hypaque 密度離心法分離外周血單個核細胞（PBMCs）。所有受試者均已成年且均簽署知情同意書，相關(guān)研究經(jīng)本醫(yī)院人類倫理委員會批準，并根據(jù)《赫爾辛基宣言》進行。

HS-5（人骨髓基質(zhì)細胞）及AML 細胞株（MV-4-11、NB4、KG-1、THP-1、HL-60）購自浙江美森細胞科技有限公司。細胞在RPMI1640 培養(yǎng)基（10%胎牛血清）中，37℃和5%CO2培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 試劑和儀器 shRNA 陰性對照（sh-control）、LINC01234 shRNA（sh-LINC01234）、LINC01234 過表達質(zhì)粒（LINC01234）和其對照組、胰島素樣生長因子2 mRNA 結(jié)合蛋白1（insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein 1，IGF2BP1）shRNA（sh-IGF2BP1）、IGF2BP1/c-Myc 過表達質(zhì)粒（pcDNA-IGF2BP1/pcDNA-c-Myc）和其對照（pcDNA-control）由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。兔抗IGF2BP1、兔抗c-Myc、兔抗GAPDH、山羊抗兔IgG（HRP）購自美國Abcam 公司。Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑購自中國賽默飛公司，TRIzol 試劑購自北京雷根生物公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物公司，SYBR Green qPCR 試劑盒購自北京畢特博生物公司，CCK-8 試劑盒購自上海吉滿生物科技公司，EZ-Magna RIP 試劑盒購自上海玉博生物公司，RIPA 緩沖液購自北京百奧萊博公司，SuperSignal West Femto 試劑盒購自賽默飛世爾科技公司。ABI StepOnePlus 實時定量PCR 系統(tǒng)購自Applied Biosystems 公司，顯微鏡購自上海通灝光電科技有限公司。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染和分組 為研究LINC01234 對AML細胞增殖、遷移、侵襲的影響，本研究使用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑對HL-60 細胞進行轉(zhuǎn)染，并分為空白對照組（BC 組，正常培養(yǎng)）、sh-control 組（轉(zhuǎn)染shRNA 陰性對照）、sh-LINC01234 組（轉(zhuǎn)染LINC-01234 shRNA）；為探究LINC01234 調(diào)控AML 細胞增殖、遷移、侵襲的作用機制，本研究在sh-LINC-01234 組的基礎上，分別轉(zhuǎn)染c-Myc 過表達質(zhì)?；蜿幮詫φ眨⒂洖閟h-LINC01234+pcDNA-control 組、sh-LINC01234+pcDNA-c-Myc 組。

1.2.3 實時定量PCR（real-time quantitative PCR，qRTPCR）根據(jù)制造商的說明，用TRIzol 試劑從細胞或組織中提取總RNA。應用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。然后根據(jù)試劑盒協(xié)議使用SYBR Green qPCR 試劑盒對cDNA 進行qPCR 檢測?；陂撝笛h(huán)（Ct）定義lncRNA、基因的表達水平，并采用2-ΔΔCt法計算。以GAPDH 作為lncRNA、基因的參考。引物序列如下：LINC01234：F 5'-TCACCTCCTCGGTCTCAGTT-3'，R 5'-GGGTGAGAAGAGACAAGCGT-3'；IGF2BP1：F 5'-GGTTAGGCCTCTCCTCCTAATA-3'，R 5'-CCTT CCCAGCACACTTGATAG-3'；c-Myc：F 5'-AAGCTG AGGCACACAAAGA-3'，R 5'-GCTTGGACAGGTTA GGAGTAAA-3'；GLI1：F 5'-AGCTAGAGTCCAGAG GTTCAA-3'，R 5'-TAGACAGAGGTTGGGAGGTAA G-3'；Slug：F 5'-AACTACAGCGAACTGGACAC-3'，R 5'-GAGGATCTCTGGTTGTGGTATG-3'；HULC：F 5'-GGAACTCTGATCGTGGACATT-3'，R 5'-ATTCCG GCCTTTACTTCAGAG-3'；GAPDH：F 5'-GGTGTGA ACCATGAGAAGTATGA-3'，R 5'-GAGTCCTTCCA CGATACCAAAG-3'。

1.2.4 細胞增殖檢測 采用CCK-8 試劑盒檢測細胞增殖情況。HL-60 細胞置于96 孔板中（每孔1 000 個細胞）。在指定時間點（培養(yǎng)24、48、72、96 h）加入CCK-8 試劑（15 μL/孔）。在5%CO2中37℃孵育2.5 h后，在酶標儀上450 nm 處測量吸光度（OD）。

1.2.5 Transwell 侵襲和遷移實驗 將250 μL 培養(yǎng)基中的經(jīng)過處理的HL-60 細胞置于預先涂上Matrigel 的上腔中（1×105個細胞/孔）。對于transwell 遷移檢測，上腔室不需要預先涂上Matrigel。下室添加含15%胎牛血清的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h 后，移出培養(yǎng)基，用70%乙醇和0.1%結(jié)晶紫處理細胞。PBS 洗滌2次后，用顯微鏡拍攝侵襲或遷移細胞的圖像。

1.2.6 RNA 免疫沉淀（RNA immunoprecipitation，RIP）反應 根據(jù)制造商的說明，使用EZ-Magna RIP試劑盒與IGF2BP1 抗體或免疫球蛋白G（IgG）進行RIP，IgG 作為對照。

1.2.7 RNA pull-down 實驗 將LINC01234 或反義LINC01234（antisense LINC01234）cDNA 克隆到pBluescriptⅡ載體中。生物素標記RNA 在體外轉(zhuǎn)錄和純化。將細胞提取液與生物素化RNA 混合，再與預洗的鏈霉親和素-瓊脂糖小珠混合1 h。小珠短時間洗滌5 次，在十二烷基硫酸鈉緩沖液中煮沸，提取的蛋白通過Western blot 或質(zhì)譜分析進行檢測。antisense LINC01234 為陰性對照。

1.2.8 放線菌素D 處理檢測 c-Myc RNA 的穩(wěn)定性采用放線菌素D 檢測。將2 mg/mL 放線菌素D 添加到經(jīng)1.2.2 處理后的HL-60 細胞中，分別培養(yǎng)0、4、8、12、16 h。

1.2.9 Western blot 分析 細胞在RIPA 緩沖液中裂解獲得全蛋白。然后定量測定整個蛋白質(zhì)，在十二烷基硫酸鈉緩沖液中煮沸。利用SDS-PAGE 凝膠分離蛋白，然后將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。用一抗在4℃孵育膜過夜，用含Tween 20 的磷酸鹽緩沖鹽水沖洗膜后，用相應的二抗在室溫下孵育膜2 h。最后，采用SuperSignal West Femto 試劑盒將膜蛋白帶可視化。一抗、二抗分別為：兔抗IGF2BP1、兔抗c-Myc、兔抗GAPDH、山羊抗兔IgG（HRP）。GAPDH作為內(nèi)源性對照。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad Prism6.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)以±s表示。統(tǒng)計方法主要包括雙尾t檢驗和方差分析（ANOVA）。Tukey 的事后檢驗被用于檢驗組間數(shù)據(jù)的差異。以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 LINC01234 在AML 中高表達

如圖1A 顯示，與健康志愿者PBMC 樣本相比，AML 患者PBMC 樣本中LINC01234 水平明顯升高（P<0.05）。此外，圖1B 顯示，與HS-5 細胞相比，LINC-01234 在5 個AML 細胞中表達明顯上調(diào)（P<0.05）。選擇LINC01234 水平最高的HL-60 細胞進行后續(xù)實驗。

圖1 AML 標本及細胞系中LINC01234 表達

2.2 沉默LINC01234 可抑制AML 細胞的增殖和遷移

與BC 組和sh-control 組比較，sh-LINC01234 組LINC01234 的水平顯著降低，OD450（48、72、96 h）值顯著降低，侵襲和遷移數(shù)目明減少（P<0.05），見圖2。

圖2 沉默LINC01234 對AML 細胞的增殖和遷移的影響

2.3 LINC01234 與IGF2BP1 相互作用

Starbase 數(shù)據(jù)庫顯示IGF2BP1 可能與LINC01-234 相互作用。RNA pull-down 實驗證實了LINC012-34 和IGF2BP1 之間的相互作用（圖3A）。RIP 實驗結(jié)果顯示IGF2BP1 和LINC01234 之間存在顯著的相關(guān)性（圖3B）。然而，在HL-60 細胞中，sh-IGF2BP1組IGF2BP1 mRNA 和蛋白水平顯著降低（P<0.05），LINC01234 的水平基本不變（P>0.05），見圖3C。圖3D顯示，過表達或下調(diào)LINC01234 不影響IGF2BP1 蛋白的表達（P>0.05）。

圖3 LINC01234 與IGF2BP1 相互作用

2.4 LINC01234 通過競爭性結(jié)合IGF2BP1 促進c-Myc mRNA 的穩(wěn)定性

qRT-PCR 結(jié)果顯示，sh-LINC01234 組HL-60 細胞中c-Myc mRNA 水平顯著降低（P<0.05），GLI1、Slug、HULC mRNA 的表達無顯著性差異（P>0.05），見圖4A。圖4B 顯示，放線菌素D 處理后sh-LINC 01234 組c-Myc mRNA 的半衰期顯著縮短（P<0.05）。使用IGF2BP1 抗體進行RIP 實驗，結(jié)果顯示，LINC01-234 組IGF2BP1 與c-Myc mRNA 的相互作用升高，sh-LINC01234 組IGF2BP1 與c-Myc mRNA 的相互作用降低（P<0.05），見圖4C。與sh-LINC01234 組和sh-LINC01234+pcDNA-control 組相比，sh-LINC012-34+pcDNA-IGF2BP1 組IGF2BP1、c-Myc 表達明顯升高，c-Myc mRNA 的穩(wěn)定性增強（P<0.05），見圖4D～F。

圖4 LINC01234 通過競爭性結(jié)合IGF2BP1 促進c-Myc mRNA 的穩(wěn)定性

2.5 LINC01234 通過調(diào)節(jié)c-Myc 的表達在AML 細胞中發(fā)揮作用

與sh-LINC01234 組和sh-LINC01234+pcDNAcontrol 組比較，sh-LINC01234+pcDNA-c-Myc 組c-Myc 表達明顯升高，OD450（48、72、96 h）值顯著增高，侵襲和遷移數(shù)目明顯增多（P<0.05），見圖5。

圖5 LINC01234 通過調(diào)節(jié)c-Myc 的表達影響AML 增殖、侵襲和遷移

3 討論

AML 是一種異質(zhì)性惡性腫瘤，干細胞研究和大量的基因組分析均取得了顯著進展，極大地促進AML 發(fā)病機制中潛在分子機制的研究[13-14]。然而，治療效果是有限的。因此，亟需發(fā)現(xiàn)新的抑制AML 細胞增殖轉(zhuǎn)移的靶點，以改善AML 患者的臨床預后。lncRNA 的異常表達已在多種類型的癌癥中被描述，其在AML 發(fā)病機制中的功能仍在不斷被闡明。本研究探索了LINC01234 在人類AML 細胞中的潛在作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)慢病毒介導的LINC01234 干擾可以有效抑制AML 細胞的增殖、侵襲和遷移，這依賴于競爭性結(jié)合IGF2BP1 降低c-Myc 的表達。因此，本研究在人類AML 發(fā)病機制中發(fā)現(xiàn)了一個LINC01234-IGF-2BP1-c-Myc 軸，其可能被用作AML 診斷和治療的生物標志物。

本研究發(fā)現(xiàn)，LINC01234 在AML 患者和人AML細胞系中均有高表達，說明LINC01234 可能促進AML 發(fā)展。LINC01234 的表達也被一致地發(fā)現(xiàn)與乳腺癌的進展有關(guān)。在配對的臨床樣本中，乳腺癌組織中LINC01234 相對于相鄰正常組織表達上調(diào)，其下調(diào)顯著抑制MDA-MB-231 和MDA-MB-468 細胞的增殖和遷移[15]。同樣，在本研究中，人類AML 細胞中的LINC01234 也具有促增殖功能，其沉默顯著抑制了HL-60 細胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力。上述結(jié)果表明，LINC01234 在AML 致癌過程中起到啟動子的作用。此前，Liu 等[16]報道了LINC01234 在口腔鱗狀細胞癌中高表達。在其體外實驗中，LINC01234 被證明通過調(diào)節(jié)miR-433-3p/PAK4 顯著促進腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。其結(jié)果與本研究的發(fā)現(xiàn)相一致，提示LINC01-234 的功能在不同類型的腫瘤中是相似的。

IGF2BP1 與胚胎發(fā)生和癌變有關(guān)。IGF2BP1 作為一種轉(zhuǎn)錄后因子，調(diào)控癌細胞增殖、侵襲和耐藥所需的一些重要mRNA 靶標的表達，與各種類型的人類癌癥中較差的總生存率有關(guān)。IGF2BP1 是一種RNA結(jié)合蛋白，已報道與c-Myc、GLI1、Slug 和HULC RNA 相關(guān)，并在癌細胞中獲得穩(wěn)定[17-20]。本研究通過Starbase 數(shù)據(jù)庫預測到LINC01234 可能與IGF2BP1存在互作。在這里，RNA pull-down 和RIP 分析證明了LINC01234 和IGF2BP1 之間的相互作用。然而，IGF2BP1 的表達不受LINC01234 的調(diào)控。近期，一些lncRNA 被報道與IGF2BP1 相關(guān)。LINC01093 特異性地直接結(jié)合IGF2BP1，干擾IGF2BP1 與GLI1 mRNA 的相互作用，誘導其在HCC 中降解[18]。在視網(wǎng)膜母細胞瘤中l(wèi)ncRNA THOR 通過增強IGF2BP1蛋白和c-Myc mRNA 的結(jié)合上調(diào)c-Myc 的表達[21]。因此，本研究檢測了LINC01234 是否影響IGF2BP1靶標的表達，發(fā)現(xiàn)僅有c-Myc 可以被LINC01234 正調(diào)控。c-Myc 的異常表達是大多數(shù)惡性腫瘤過度增殖的一個標志，也是哺乳動物細胞中引起程序性細胞死亡-凋亡的一種強有力的因子[22]。c-Myc 的表達在許多水平上受到調(diào)控，并在很大程度上受到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制的控制。在轉(zhuǎn)錄后控制c-Myc 表達的因素中，癌胚RNA 結(jié)合蛋白IGF2BP1 保護CRD 序列不被切割，穩(wěn)定mRNA 并增加其表達[23-24]。此外，LINC-01234 促進了IGF2BP1 與c-Myc mRNA 的結(jié)合，促進了c-Myc mRNA 的穩(wěn)定性。本研究表明，LINC0-1234 與IGF2BP1 相關(guān)，抑制了c-Myc mRNA 的衰減，從而促進了AML 的生長和轉(zhuǎn)移。與本研究一致的是，Chen 等[25]發(fā)現(xiàn)LINC01234 與c-Myc 表達顯著正相關(guān)，在肺癌中LINC01234 通過與HNRNPA2B1 相互作用調(diào)控miR-106b-5p/CRY2 軸，進而增加c-Myc 的表達。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)LINC01234 在AML中高表達。LINC01234 通過與IGF2BP1 競爭性結(jié)合被發(fā)現(xiàn)是癌蛋白c-Myc 的促進因子，可能通過競爭性結(jié)合IGF2BP1 促進c-Myc mRNA 的穩(wěn)定性，提示LINC01234 在AML 治療方面可能是一種有效的治療方法。

本文無影響其科學性與可信度的利益沖突。